楊 棟,陳章林,肖姜伶,周作瓊,張 平,彭夕洋,鄭 瀾,湯長(zhǎng)發(fā)

(湖南師范大學(xué) 體育學(xué)院,中國(guó)湖南 長(zhǎng)沙 410081)

斑馬魚(yú)具有基因組與人類(lèi)基因組相似度高、基因編輯簡(jiǎn)單、飼養(yǎng)方便等特點(diǎn),而且其水環(huán)境適合多種運(yùn)動(dòng)方案和高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的開(kāi)展,是一種新興的研究運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果的理想模型[1]。運(yùn)動(dòng)方案的設(shè)計(jì)需要考慮運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)頻率、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和能量供應(yīng)方式。研究表明,不同的運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案對(duì)斑馬魚(yú)機(jī)能的影響截然不同,合理的運(yùn)動(dòng)方案對(duì)實(shí)現(xiàn)預(yù)期的運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果至關(guān)重要[2]。建立斑馬魚(yú)有氧運(yùn)動(dòng)能力評(píng)估方法和有氧/無(wú)氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練判斷方法,有利于了解斑馬魚(yú)能承受的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度及運(yùn)動(dòng)時(shí)能量供應(yīng)狀態(tài),為精確制定斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案奠定基礎(chǔ)。

臨界游泳速度是魚(yú)類(lèi)測(cè)試方案中達(dá)到的最大游泳速度,體現(xiàn)了魚(yú)類(lèi)在持續(xù)的游泳活動(dòng)中提供能量的最大能力,可作為魚(yú)類(lèi)游泳能力和代謝性能的評(píng)估指標(biāo)[3]。斑馬魚(yú)臨界游泳速度易受多環(huán)芳烴和2,3,7,8-四氯二苯并二惡英(TCCD)等毒性物質(zhì)的影響,常被用于水質(zhì)監(jiān)控和藥物毒性檢測(cè)[3～4]。在臨界游泳速度測(cè)試中,魚(yú)類(lèi)的實(shí)時(shí)耗氧量與游泳速度呈正相關(guān)[5～7],魚(yú)類(lèi)的最大耗氧量類(lèi)似于人類(lèi)的最大攝氧量,反映了魚(yú)類(lèi)最高代謝率[3],可作為評(píng)估有氧運(yùn)動(dòng)能力的重要指標(biāo)[8～9]。目前,已有研究通過(guò)Loligo泳道呼吸儀,設(shè)計(jì)了成年斑馬魚(yú)的耗氧量測(cè)定方案[5～7],但由于不同年齡斑馬魚(yú)的體長(zhǎng)、體重和基礎(chǔ)代謝速率有差異,以往研究未探討耗氧量測(cè)定方案在不同年齡階段斑馬魚(yú)中測(cè)試的可行性,以及耗氧量與游泳速度之間的關(guān)系。衡量有氧運(yùn)動(dòng)能力的另一個(gè)經(jīng)典指標(biāo)是血乳酸閾。血液中乳酸濃度隨運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加而增加,當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度達(dá)到某一負(fù)荷時(shí),血乳酸濃度急劇增加的拐點(diǎn)稱(chēng)為乳酸閾,表示機(jī)體從有氧運(yùn)動(dòng)向無(wú)氧運(yùn)動(dòng)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)[10]。然而,關(guān)于斑馬魚(yú)血乳酸閾的測(cè)定方法目前尚未有報(bào)道,其血乳酸水平與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的關(guān)系也有待研究?；诖?本文擬探究通過(guò)測(cè)量最大耗氧量、臨界游泳速度、血乳酸閾等指標(biāo)來(lái)綜合評(píng)估斑馬魚(yú)有氧運(yùn)動(dòng)能力的方法,以期為建立水生生物有氧運(yùn)動(dòng)能力評(píng)價(jià)指標(biāo)體系奠定基礎(chǔ)。

本研究設(shè)計(jì)了泳道呼吸儀耗氧量測(cè)量方案,該方案適用于測(cè)量青年、中年和老年斑馬魚(yú)的最大耗氧量;同時(shí),設(shè)計(jì)了乳酸閾檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)了不同游泳速度下斑馬魚(yú)血乳酸的連續(xù)測(cè)定,分析了斑馬魚(yú)血乳酸水平與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的關(guān)系。本文建立的斑馬魚(yú)耗氧量和血乳酸閾測(cè)定方案,為有效評(píng)估斑馬魚(yú)有氧運(yùn)動(dòng)能力提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

野生型斑馬魚(yú)購(gòu)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心,飼養(yǎng)條件為水溫28℃、光照14 h/d,每天投喂豐年蝦3次。研究中使用的儀器主要包括丹麥Loligo泳道呼吸儀和德國(guó)EKF公司的微量血乳酸檢測(cè)儀,前者用于測(cè)定臨界游泳速度(Ucrit)和耗氧量(MO2),后者用于測(cè)定血乳酸值。其他材料和試劑包括:斑馬魚(yú)采血針(北京市紅星區(qū)醫(yī)療設(shè)備廠)、Lactate Scout試紙片(EKF公司,德國(guó))、三卡因麻醉劑(Sigma公司,美國(guó))和肝素鈉(5 mg/mL,生工生物工程上海股份有限公司)等。

1.2 斑馬魚(yú)臨界游泳速度與相對(duì)臨界游泳速度的測(cè)定

1.3 斑馬魚(yú)耗氧量測(cè)定

1.4 單位距離能耗與最優(yōu)游泳速度的計(jì)算

單位距離能耗(cost of transport,COT)表示維持標(biāo)準(zhǔn)代謝率、克服阻力并以特定水速加速的能量消耗,可用于確定斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)單位距離所需的能量。參照Palstra等[11]魚(yú)類(lèi)COT模型:COT=實(shí)時(shí)耗氧量/實(shí)時(shí)游泳速度。根據(jù)COT與遞增速度節(jié)點(diǎn)做圖,經(jīng)回歸分析推導(dǎo)COT與速度節(jié)點(diǎn)的方程[11]。依據(jù)Palstra等[12]定義的最優(yōu)游泳速度(optimal swimming speed,Uopt):每單位距離游泳時(shí)最低的耗氧量或最低COT所對(duì)應(yīng)的速度,可推算出Uopt是COT方程的一階導(dǎo)數(shù)等于零時(shí)所對(duì)應(yīng)的速度。

1.5 斑馬魚(yú)血乳酸閾測(cè)定

以斑馬魚(yú)臨界游泳速度的0%、20%、40%、60%、80%、100%設(shè)置梯度游泳運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度節(jié)點(diǎn),在每個(gè)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度節(jié)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)5 min。使用微量采血針進(jìn)行尾靜脈取血,并使用微量血乳酸檢測(cè)儀測(cè)量血乳酸,繪制不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度節(jié)點(diǎn)的斑馬魚(yú)血乳酸值曲線圖,從而求得斑馬魚(yú)的血乳酸閾。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),顯著性水平為P＜0.05。采用Graphpad Prism 9.1.0制圖。

2 結(jié)果

2.1 不同月齡斑馬魚(yú)的最大耗氧量

斑馬魚(yú)的最大耗氧量(MO2max)隨著年齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(圖1),3月齡斑馬魚(yú)的MO2max高于8月齡(P＜0.05)和14月齡斑馬魚(yú)(P＜0.01);8月齡斑馬魚(yú)的MO2max較14月齡斑馬魚(yú)高,且差異具有顯著性(P＜0.05)。

圖1 3、8和14月齡斑馬魚(yú)的最大耗氧量Fig.1 Maximum oxygen consumption(MO2max)of 3-,8-,and 14-month-old zebrafish*:P＜0.05;**:P＜0.01.

2.2 不同月齡斑馬魚(yú)的相對(duì)臨界游泳速度

檢測(cè)結(jié)果顯示,3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚(yú)的 Ucrit-r分別是(13.84±0.73)BL/s、(14.05±0.35)BL/s和(11.49±0.42)BL/s(圖 2)。其中,3 月齡和 8月齡斑馬魚(yú)的Ucrit-r無(wú)顯著差異,3月齡和8月齡斑馬魚(yú)的Ucrit-r顯著高于14月齡斑馬魚(yú)的Ucrit-r(P＜0.01,P＜0.05),表明隨著年齡的增長(zhǎng),8月齡之后斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)能力下降顯著。

圖2 3、8和14月齡斑馬魚(yú)的相對(duì)臨界游泳速度Fig.2 Relative critical swimming speed(Ucrit-r)of 3-,8-,and 14-month-old zebrafish*:P＜0.05;**:P＜0.01.

2.3 不同月齡斑馬魚(yú)的耗氧量、單位距離能耗和最優(yōu)游泳速度

圖3 3月齡斑馬魚(yú)耗氧量(A)和單位距離能耗(B)(n=8)Fig.3 Oxygen consumption(A)and cost of transport(B)of 3-month-old zebrafish(n=8)

圖4 8月齡斑馬魚(yú)耗氧量(A)和單位距離能耗(B)(n=7)Fig.4 Oxygen consumption(A)and cost of transport(B)of 8-month-old zebrafish(n=7)

圖5 14月齡斑馬魚(yú)耗氧量(A)和單位距離能耗(B)(n=3)Fig.5 Oxygen consumption(A)and cost of transport(B)of 14-month-old zebrafish(n=3)

2.4 不同月齡斑馬魚(yú)的血乳酸閾

不同月齡斑馬魚(yú)的血乳酸檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加,血乳酸濃度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中,斑馬魚(yú)的血乳酸濃度基本保持平穩(wěn)或呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)。3月齡斑馬魚(yú)的血乳酸濃度隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加,在60%的Ucrit運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度后急劇上升,其血乳酸閾為(2.98±0.86)mmol/L。8月齡斑馬魚(yú)和14月齡斑馬魚(yú)的血乳酸濃度在80% Ucrit運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度后急劇上升,血乳酸閾分別為(2.47±0.29)mmol/L 和(3.83±0.25)mmol/L(圖 6)。在相同的Ucrit百分比下,14月齡斑馬魚(yú)的血乳酸閾值高于8月齡斑馬魚(yú)。

圖6 3、8和14月齡斑馬魚(yú)血乳酸在不同訓(xùn)練速度下的變化Fig.6 Blood lactic acid change of 3-,8-,and 14-monthold zebrafish under different training speeds

3 討論

有氧運(yùn)動(dòng)能力是評(píng)估斑馬魚(yú)機(jī)能狀態(tài)的指標(biāo),作為監(jiān)控手段被廣泛應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)[13～14]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[3,15]、遺傳[16]和藥理[17～19]等領(lǐng)域的研究。本文建立了基于最大耗氧量和血乳酸閾評(píng)估斑馬魚(yú)有氧運(yùn)動(dòng)能力的方法。針對(duì)3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚(yú)有氧運(yùn)動(dòng)能力的檢測(cè)數(shù)據(jù)說(shuō)明,該方法體系對(duì)各年齡階段斑馬魚(yú)具有可行性,為涉及有氧運(yùn)動(dòng)能力檢測(cè)的斑馬魚(yú)模型應(yīng)用研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

評(píng)估有氧運(yùn)動(dòng)能力是合理設(shè)計(jì)斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)方案的重要前提。運(yùn)動(dòng)方案中設(shè)計(jì)的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度過(guò)大,將會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)病理性心肌肥大[20]、免疫力降低、代謝重編程[21],促進(jìn)炎癥的發(fā)生[22],影響運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果的判斷。Palstra等[11]最早對(duì)3月齡斑馬魚(yú)在不同游泳速度下的耗氧情況進(jìn)行了研究。斑馬魚(yú)的有氧運(yùn)動(dòng)能力與其年齡及體質(zhì)差異密切相關(guān),我們發(fā)現(xiàn)Palstra制定的測(cè)定方案不適合中、老年斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)耗氧量測(cè)定,對(duì)不同年齡斑馬魚(yú)的有氧運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定有局限性。因此,在借鑒國(guó)外耗氧量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上,本研究針對(duì)不同年齡階段斑馬魚(yú)的體質(zhì)特征對(duì)測(cè)試方案進(jìn)行了優(yōu)化,經(jīng)過(guò)大量前期試驗(yàn),最終確定了本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)斑馬魚(yú)耗氧量的方法。本實(shí)驗(yàn)確定的檢測(cè)斑馬魚(yú)耗氧量的方法可適應(yīng)于不同年齡段的斑馬魚(yú)耗氧量測(cè)試,結(jié)果曲線基本符合國(guó)外關(guān)于斑馬魚(yú)耗氧量的測(cè)試結(jié)果。通過(guò)測(cè)定3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚(yú)的有氧運(yùn)動(dòng)能力,經(jīng)回歸分析,我們推導(dǎo)出3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚(yú)的MO2及COT方程,并獲得這3種年齡階段斑馬魚(yú)的Uopt,驗(yàn)證了耗氧量測(cè)定方法的科學(xué)性和可行性。

乳酸閾是界定機(jī)體在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中,由中強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)為主向高強(qiáng)度無(wú)氧運(yùn)動(dòng)為主的過(guò)渡點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于人類(lèi)有氧能力的評(píng)估。與簡(jiǎn)單、易行的人類(lèi)血乳酸檢測(cè)不同,斑馬魚(yú)由于血管小、血量少、取血難,遞增運(yùn)動(dòng)不同節(jié)點(diǎn)下血乳酸的檢測(cè)是關(guān)鍵技術(shù)難題。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用血乳酸檢測(cè)斑馬魚(yú)有氧運(yùn)動(dòng)能力及血乳酸水平與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度關(guān)系的研究尚屬空白。本研究利用微量采血針采集斑馬魚(yú)尾部靜脈血液,按照斑馬魚(yú)血乳酸檢測(cè)方法,測(cè)定血乳酸的水平,首次繪制了斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)血乳酸曲線,發(fā)現(xiàn)3月齡斑馬魚(yú)的血乳酸閾出現(xiàn)在臨界游泳速度的60%左右,而8月齡和14月齡斑馬魚(yú)的血乳酸閾在臨界游泳速度的80%左右出現(xiàn)。從結(jié)果上看,3月齡斑馬魚(yú)的有氧運(yùn)動(dòng)能力可能要比8月齡和14月齡斑馬魚(yú)的有氧運(yùn)動(dòng)能力差,但實(shí)際而言,3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚(yú)在60% Ucrit所對(duì)應(yīng)的實(shí)際速度是不一樣的,所以本文沒(méi)有對(duì)不同年齡段斑馬魚(yú)血乳酸閾的變化趨勢(shì)進(jìn)行分析,只是探討3月齡、8月齡和14月齡斑馬魚(yú)的血乳酸閾拐點(diǎn)出現(xiàn)的速度占Ucrit的百分比,為斑馬魚(yú)有氧和無(wú)氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)方案的界定與制定提供參考。

綜上所述,本研究確定的最大耗氧量和血乳酸閾的測(cè)試方法,可有效評(píng)估斑馬魚(yú)有氧運(yùn)動(dòng)能力和最佳游泳速度,為斑馬魚(yú)模型在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、遺傳和藥理等領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了有氧運(yùn)動(dòng)能力的精準(zhǔn)評(píng)估手段。