王碧雯,駱亞莉,b*,李 研,馬 玉,周嘯天

(甘肅中醫(yī)藥大學a.甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室;b.基礎醫(yī)學院病理教研室,中國甘肅 蘭州 730000)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)有多向分化和自我更新的優(yōu)良特性,這些優(yōu)良特性使其具有修復和再生受損組織的治療潛力[1～2]。MSCs直接或間接參與骨缺損[3]、軟骨缺損[4]、心肌梗死[5]、神經(jīng)損傷[6]等組織損傷的修復,這使其在臨床應用中具有良好的前景[7]。目前,針對MSCs成骨和成脂分化相關轉錄因子、蛋白質的研究多見于體外或體內實驗,從生物信息學角度對成骨成脂分化關鍵基因展開分析的綜合研究少見,本文通過生物信息學技術在眾多相關基因中篩選出關鍵基因,并試圖揭示成骨成脂分化可能存在的關聯(lián)點和作用機制,這對于進一步研究MSCs異常成骨成脂分化的發(fā)生機制具有重要意義,同時可為骨質疏松癥等骨與脂肪生成不平衡的相關疾病提供治療思路。

1 材料與方法

1.1 文獻檢索及基因統(tǒng)計

以“MSC”“osteogenic differentiation”“adipogenic differentiation”為關鍵詞,通過PubMed檢索公開發(fā)表的與MSCs成骨分化和成脂分化相關的研究文獻,納入文獻包括與MSCs成骨分化和MSCs成脂分化有關的基因或基因產(chǎn)物的臨床研究、論著、隨機對照試驗、綜述及系統(tǒng)評價文獻,排除無法獲取摘要的文獻、重復文獻及其他與研究目的不符的文獻,剔除重復、錯誤的基因或基因產(chǎn)物,最終摘選出MSCs成骨分化與成脂分化相關的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)或基因產(chǎn)物。

1.2 生物功能和通路富集分析

將1.1所得有關基因分別導入在線軟件DAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp),Select I-dentifier選擇 Official gene symbol,Species選擇Homo sapiens,Background設置為Homo sapiens,設定P＜0.01,對相關基因進行基因本體論(Gene Ontology,GO)分析與京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(K-yoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析。

1.3 基因所表達蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建和關鍵基因篩選

將1.1所得成骨分化有關基因和成脂分化有關基因分別上傳至STRING 11.0(http://STRING-db.org/)軟件進行分析,物種設置“Homo sapiens”,構建由導入基因表達產(chǎn)物所組成的相互作用網(wǎng)絡,以TSV格式導出,并將源文件導入Cytoscape軟件進行可視化分析。利用Cytoscape軟件中的插件Centiscape計算出網(wǎng)絡中每個節(jié)點的拓撲特性,繼而根據(jù)節(jié)點度數(shù)(degree)和節(jié)點中介性(betweenness centrality)篩選出關鍵節(jié)點,即MSCs成骨分化與成脂分化的關鍵基因表達產(chǎn)物。

1.4 成骨分化與成脂分化共同關鍵基因篩選

將1.3篩選所得的關鍵基因表達產(chǎn)物導入Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具,對成骨分化和成脂分化的關鍵基因進行交互比較,得到成骨分化和成脂分化共同關鍵基因。

2 結果

2.1 文獻檢索及入選情況

經(jīng)PubMed數(shù)據(jù)庫檢索,共獲得成骨分化相關文獻2 083篇,成脂分化相關文獻1 028篇,按照納入標準進一步篩選出符合要求的成骨分化文獻279篇,成脂分化文獻164篇;最終篩選出成骨分化基因及表達產(chǎn)物217個,成脂分化基因及表達產(chǎn)物227個。

2.2 GO分類和KEGG通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對MSCs成骨分化相關的DEGs進行GO分類,得到P＜0.01的分類281種,其中生物過程(biological process,BP)條目221個,細胞組分(cellular component,CC)條目19個,分子功能(molecular function,MF)條目41個。在生物過程層面,這些成骨分化DEGs主要與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控和負調控、成骨細胞分化等有關(排名前10位的條目見圖1A);在細胞組分層面,這些基因大多參與細胞體、黏著斑、質膜外側、早期內體膜等的組成(排名前10位的條目見圖1B);其分子功能的變化主要集中在轉錄因子結合、生長因子活性、轉錄激活子活性以及RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)域序列特異性結合等(排名前10位的條目見圖1C)。進一步對上述基因展開KEGG通路分析,結果顯示其主要涉及調節(jié)干細胞多能性的信號通路、轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路、Hippo信號通路等13條信號通路(P＜0.01),排名前10位的通路信息見圖1D。

圖1 成骨分化差異表達基因的GO分類和KEGG通路分析(前10位)Fig.1 Enrichment analysis of GO and KEGG pathway of DEGs in osteogenic differentiation(top 10)

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對MSCs成脂分化相關的DEGs進行GO分類,得到P＜0.01的分類317種,其中BP條目238個、CC條目24個、MF條目55個。在生物過程層面,這些成脂分化DEGs主要與轉錄正調控、DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控和負調控等有關(排名前10位的條目見圖2A);在細胞組分層面,這些基因大多參與胞質溶膠、SMAD蛋白復合物、細胞外區(qū)域等的組成(排名前10位的條目見圖2B);其分子功能的變化主要集中在蛋白質結合、轉錄因子結合、轉錄激活子活性、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)域序列特異性結合等(排名前10位的條目見圖2C)。成脂分化相關DEGs的KEGG通路分析結果顯示,其主要涉及癌癥通路、調節(jié)干細胞多能性的信號通路、AMPK信號通路等47條信號通路(P＜0.01),排名前10位的通路信息見圖2D。

圖2 成脂分化差異表達基因的GO分類和KEGG通路分析(前10位)Fig.2 Enrichment analysis of GO and KEGG pathway of DEGs in adipogenic differentiation(top 10)

2.3 差異基因所表達蛋白質的相互作用網(wǎng)絡

將篩選出的217個成骨分化基因、227個成脂分化基因分別輸入STRING數(shù)據(jù)庫,得到成骨分化和成脂分化的網(wǎng)絡數(shù)據(jù),將所得網(wǎng)絡數(shù)據(jù)分別導入Cytoscape軟件構建可視化網(wǎng)絡圖(圖3)。網(wǎng)絡數(shù)據(jù)顯示,成骨分化的PPI(protein-protein interaction)網(wǎng)絡圖共193個節(jié)點、2 271條邊、平均節(jié)點度數(shù)23.5;成脂分化的PPI網(wǎng)絡圖共206個節(jié)點、2 126條邊、平均節(jié)點度數(shù)20.6,這些節(jié)點之間絕大部分存在著密切的相互作用關系,且有多個節(jié)點處于網(wǎng)絡的中心,屬于整個通路的核心位置。

圖3 PPI網(wǎng)絡圖(A)成骨分化相關蛋白質的PPI網(wǎng)絡圖;(B)成脂分化相關蛋白質的PPI網(wǎng)絡圖。Fig.3 PPI network diagram(A)PPI network diagram of osteogenic differentiation related proteins;(B)PPI network diagram of the adipogenic differentiation related proteins.

2.4 關鍵基因篩選結果

將STRING中所得PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件進行分析。節(jié)點的度數(shù)越高,表示與其相互作用的基因越多,其在定向分化過程中起的作用越大。節(jié)點的中介性值越大,說明該基因對于整個網(wǎng)絡的調控影響越大[8]。在基因調控網(wǎng)絡中,關鍵基因的調控變化在整個網(wǎng)絡中起著至關重要的作用,而節(jié)點度數(shù)與節(jié)點中介性值越高的節(jié)點所具有的影響力越大,因此,對于關鍵基因的篩選可依據(jù)節(jié)點度數(shù)與節(jié)點中介性的值。

通過Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn),在成骨分化網(wǎng)絡中,節(jié)點度數(shù)與節(jié)點中介性同時大于或等于平均值(x)的節(jié)點有42個,節(jié)點度數(shù)大于或等于平均值+標準差(+s)的節(jié)點有30個,而節(jié)點中介性大于或等于平均值+標準差(+s)的節(jié)點有15個。具體分析這3種方法篩選出的節(jié)點后,本研究篩選關鍵基因的標準設定為節(jié)點度數(shù)與節(jié)點中介性同時大于或等于平均值+標準差(+s)[9],結果共篩選出14個成骨分化關鍵基因(表 1,圖 4A)。

表1 成骨分化關鍵基因的篩選Table 1 Screening of key genes for osteogenic differentiation

在成脂分化網(wǎng)絡中,節(jié)點度數(shù)與節(jié)點中介性同時大于或等于平均值()的節(jié)點有45個,節(jié)點度數(shù)大于或等于平均值+標準差(+s)的節(jié)點有35個,而節(jié)點中介性大于或等于平均值+標準差(+s)的節(jié)點有25個。以節(jié)點度數(shù)與節(jié)點中介性同時大于或等于平均值+標準差(+s)為篩選標準,結果顯示共篩選出20個成脂分化關鍵基因(表2,圖4B)。

圖4 關鍵基因所編碼蛋白質的PPI網(wǎng)絡圖(A)成骨分化關鍵基因對應的PPI網(wǎng)絡圖;(B)成脂分化關鍵基因對應的PPI網(wǎng)絡圖。Fig.4 PPI network diagram for screening key genes(A)PPI network diagram of key genes for osteogenic differentiation;(B)PPI network diagram of key genes for adipogenic differentiation.

表2 成脂分化關鍵基因的篩選Table 2 Screening of key genes for Adipogenic differentiation

2.5 成骨分化與成脂分化的共同關鍵基因

為了評估成骨分化關鍵基因與成脂分化關鍵基因之間的不同交互作用,利用Venny 2.1.0對成骨分化和成脂分化中的關鍵基因進行交互分析比較。結果見圖5,在14個成骨分化關鍵基因和20個成脂分化關鍵基因中,JUNB、SMAD2、SMAD3、MAPK13(mitogen-activated protein kinase 13)、BMP4(bone morphogenetic protein 4)、SRC 和 RUNX2等7個基因共同參與調控成骨分化與成脂分化。

圖5 成骨分化與成脂分化差異表達關鍵基因的韋恩圖7個成骨分化關鍵基因分別是HSP90、TP53、VEGFA、BMP2、CD44、NOTCH1和COL1A1;13個成脂分化關鍵基因分別是CCND1、IGF1、IGF1R、SOX2、SIRT1、MAPK8、PPARG、GAPDH、FOXO1、HDAC1、CDH2、TNF 和 SREBF1;7 個成骨分化和成脂分化共有的關鍵基因分別是 JUNB、SMAD2、SMAD3、MAPK13、BMP4、SRC 和 RUNX2。Fig.5 Venny diagram of the intersection of key genes differentially expressed between osteogenic differentiation and adipogenic differentiationThe 7 key genes for osteogenic differentiation are HSP90,TP53,VEGFA,BMP2,CD44,NOTCH1,COL1A1.The 13 key genes for adipogenic differentiation are CCND1,IGF1,IGF1R,SOX2,SIRT1,MAPK8,PPARG,GAPDH,FOXO1,HDAC1,CDH2,TNF,SREBF1.The 7 key genes shared by osteogenic differentiation and adipogenic differentiation are JUNB,SMAD2,SMAD3,MAPK13,BMP4,SRC,RUNX2.

3 討論

MSCs的一個重要特征是具有多系分化潛能[10],這一特性使其具有廣泛的臨床應用前景。分化潛能的穩(wěn)定保持是發(fā)揮MSCs治療作用的基礎。目前,針對MSCs成骨分化和成脂分化的研究以體外實驗和體內實驗為主,雖然生物信息學分析技術在疾病和基礎研究的基因篩查中已被廣泛使用,但對于MSCs成骨分化和成脂分化相關基因的系統(tǒng)生物學信息分析較少。本研究旨在通過生物信息學方法篩選MSCs發(fā)生成骨成脂分化的關鍵基因,試圖從生物信息角度發(fā)現(xiàn)成骨分化與成脂分化關聯(lián)的新思路,為MSCs異常成骨成脂分化的機制研究提供可探討的靶點基因,為臨床骨質疏松癥等成骨脂肪生成失衡相關疾病提供可能的治療靶點。

文中通過文獻挖掘摘選出217個與MSCs成骨分化有關的DEGs或基因產(chǎn)物和227個成脂分化有關的DEGs或基因產(chǎn)物。GO分析顯示,成骨分化相關基因或基因產(chǎn)物主要與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控和負調控、成骨細胞分化等過程有關,參與細胞體的組成,介導的分子功能有轉錄因子結合、生長因子活性等(圖1);成脂分化相關基因或基因產(chǎn)物主要與轉錄正調控、DNA模板化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控和負調控等過程有關,參與胞質溶膠、SMAD蛋白復合物等的組成,介導的分子功能主要集中在蛋白質結合、轉錄因子結合等(圖2)。KEGG通路富集分析結果表明,成骨分化差異基因主要涉及調節(jié)干細胞多能性的信號通路、TGF-β信號通路、Hippo信號通路等(圖1D);成脂分化差異基因則主要涉及癌癥的途徑、調節(jié)干細胞多能性的信號通路、AMPK信號通路等(圖2D)。當前,成骨分化的分子途徑研究以BMP通路和Wnt/β-catenin通路最為經(jīng)典[11],TGF-β信號通路、Hippo信號通路作為成骨分化的重要途徑也已被報道[12],我們的結果提示這兩條通路或許可以得到更高的關注。MSCs的多能性與其分化特性緊密聯(lián)系[13],故推測干細胞多能性信號通路參與其成骨分化和成脂分化的發(fā)生發(fā)展過程。研究報道,脂肪源性干細胞參與促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和復發(fā)過程,與癌癥具有顯著相關性,腫瘤微環(huán)境對周圍組織脂肪微環(huán)境的調控起著重要作用[14],或許這可以解釋成脂分化與癌癥途徑的密切相關性。另外,AMPK作為脂代謝的調控分子,可以通過磷酸化脂質合成過程中的一系列酶對脂肪代謝進行轉錄調控,這可能與AMPK信號通路在MSCs成脂分化差異基因的通路分析結果中具有顯著性有關。

MSCs成骨與成脂分化之間存在一種理論上的反向關系,即MSCs向成骨方向分化的同時會抑制其成脂方向的分化[15]。骨質疏松癥是骨與脂肪形成不平衡的代表性疾病之一,常以成骨生成減少、脂肪生成增多為特點[16]。MSCs成骨或成脂分化方向的不同取決于不同的信號通路及其調控的轉錄因子。許多信號通路遵循成骨和成脂分化之間的反向平衡,即成骨/抗成脂作用(或反之)。這些信號通路包括Wnt/β-catenin信號通路、HH(Hedgehog)信號和Nell-1信號等[15]。成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)[17]、TGF-β1[18]和Notch信號通路[19]同樣支持這種反向平衡關系。但也有一些信號通路例外,它們具有促成骨/促成脂的雙向性。BMP信號通路是參與誘導成骨分化的中樞信號通路之一,在骨形成中起著至關重要的作用[20]。但已有研究發(fā)現(xiàn),BMP通過SMAD1/5/8和MAPK激活可誘導脂肪形成,這可能是由于誘導的劑量和結合受體類型不同[21]。從劑量來看,較低濃度的BMP-2可誘導脂肪生成,而較高濃度的BMP-2則有利于成骨分化[22]。從受體類型來看,BMPR-IA信號轉導一般可誘導成脂效應,而BMPR-1B信號通路則可誘導成骨作用[23]。同樣,胰島素樣生長因子-Ⅰ (insulin like growth factor 1,IGF-Ⅰ)被發(fā)現(xiàn)既有促成骨又有促成脂的作用[24]。

文中篩選出了14個成骨分化關鍵基因和20個成脂分化關鍵基因(圖4),其中7個基因(JUNB、SMAD2、SMAD3、MAPK13、BMP4、SRC、RUNX2)為兩者共有(圖5),推測這7個基因在成骨成脂雙向調節(jié)的通路中起關鍵作用。我們通過文獻分析發(fā)現(xiàn),SMAD2、SMAD3、MAPK13、BMP4 和 JUNB 均與成骨或成脂雙向調控的BMP信號通路有關[16,25]。典型BMP信號通路依賴兩個絲氨酸-蘇氨酸激酶細胞表面BMP受體(BMPRs)結合而產(chǎn)生作用。BMPR-Ⅱ在與BMP配體結合后啟動信號傳遞,隨后招募、磷酸化和激活參與MSCs分化的BMPRIA和BMPR-IB,進而磷酸化并激活調節(jié)型SMAD1/5/8,調節(jié)型SMAD結合物進入細胞核激活或抑制基因的表達[23,25～26]。在非典型BMP信號通路中,MAPK、胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signalregulated kinase,ERK)和c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)等下游BMP信號被激活,影響脂肪分化轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ),從而發(fā)生成脂分化[25～26]。

此外,在篩選出的成骨分化關鍵基因(圖4A)中,我們發(fā)現(xiàn)血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為成骨分化相關因子鮮有提及,但有文獻證實其在成骨分化以及軟骨分化過程中具有重要的作用[27～28]。研究發(fā)現(xiàn),VEGFA可以調節(jié)成骨分化早期骨發(fā)育時周圍血管的調節(jié)因子[28]。這提示VEGFA可作為骨生成障礙疾病骨發(fā)育早期的可能治療靶點。腫瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)作為腫瘤抑制因子已被人們所熟知,Tataria等[29]發(fā)現(xiàn)p53抑癌基因的缺失會促進MSCs成骨分化,這進一步證實TP53在骨腫瘤(例如骨肉瘤)發(fā)生過程中對MSCs的成骨分化調控具有重要意義,可作為骨腫瘤的可能治療靶點。在篩選出的成脂分化關鍵基因(圖4B)中,腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)除了是促炎性因子,同時也是脂肪組織代謝的重要調節(jié)因子[30～31],這提示TNF可能作為炎癥相關疾病中MSCs成脂分化的重要靶點發(fā)揮作用。

綜上所述,本文通過對成骨分化和成脂分化相關基因的生物信息學篩選,得到了調節(jié)兩者平衡的關鍵基因,為治療骨與脂肪生成失衡相關疾病(例如骨質疏松癥)探索了可能機制。對于篩選的成骨成脂分化關鍵基因,本課題組擬進行進一步的生物學實驗驗證。