馬世琦 鄧秀玲 吳亞男 韓晶晶 趙 陽(yáng) 喬一蕓 王海生▲

1.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院門診辦公室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的肝癌組織學(xué)亞型，占全世界原發(fā)性肝癌的80%以上[1]。 在全球范圍內(nèi)，HCC 是與癌癥相關(guān)死亡的第四大最常見原因，其五年生存率僅為18%，是僅次于胰腺癌的第二大致命腫瘤[2-3]。 由于大部分HCC 患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于進(jìn)展期，而全身化療的中位生存時(shí)間也不到1 年，治療效果不理想[4]。阿拉嘎斑布是我國(guó)的傳統(tǒng)蒙藥，是芫菁科昆蟲的干燥蟲體，其具有破血逐瘀、散結(jié)消癥、滋補(bǔ)腎陽(yáng)、調(diào)理體素、增強(qiáng)抵抗力等功效[5]，其有效藥物成分主要為斑蝥素（cantharidin，CTD），分子式C10H12O4，分子量196.2 D。 有關(guān)CTD 的提取方法不盡相同，主要有震蕩?kù)o置提取法、超聲波震蕩提取法、冷浸提取法、堿水提取法、熱回流提取法等[6-9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，芫菁蟲體不同部位的CTD 產(chǎn)率有差別，其中產(chǎn)率最高的部位為蟲體的腹部，并且發(fā)現(xiàn)干燥蟲體較活體蟲體能獲得更多的CTD[10]。CTD 對(duì)多種人類惡性腫瘤均表現(xiàn)出顯著的抗癌活性，如對(duì)喉癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、皮膚癌等多種腫瘤的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用[11-14]。但是，CTD 對(duì)肝癌抑制作用的具體分子機(jī)制目前仍不完全清楚。本研究選用蒙藥阿拉嘎斑布蟲體作為研究藥物，使用課題組前期通過混合法提取的CTD 作為實(shí)驗(yàn)用藥，研究其對(duì)HepG2 細(xì)胞的影響，并通過RNA 測(cè)序， 嘗試從分子水平及基因表達(dá)譜的角度對(duì)CTD 治療肝癌的分子機(jī)制進(jìn)行研究， 為蒙藥用于肝癌的治療提供新的線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

HepG2 細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽生物科技有限公司；阿拉嘎斑布干燥蟲體購(gòu)自內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司；CTD 標(biāo)準(zhǔn)品及PI細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；MTT 試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Caspase-GloR3/7 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自普洛麥格北京生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus Total RNA 提取試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究所用的HepG2 細(xì)胞株， 于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，2~3 d 傳代一次。

1.2.2 CTD 母液的配制 將課題組前期提取的CTD 白色粉末用含1‰二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液進(jìn)行超聲溶解配制母液， 使用時(shí)再用完全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置 空白對(duì)照組（Blank）：不含細(xì)胞，加只含有1‰ DMSO 藥物溶劑的完全培養(yǎng)液；溶劑對(duì)照組（Mock）：含正常目的細(xì)胞，加只含有1‰ DMSO藥物溶劑的完全培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)組（CTD）：含正常目的細(xì)胞，加含有相應(yīng)濃度CTD 的含藥培養(yǎng)液。

1.2.4 MTT 法檢測(cè)增殖 于3 塊96 孔板內(nèi)接種細(xì)胞，每組三個(gè)復(fù)孔，孵育24 h 后加藥處理，分別于24、48、72 h 后檢測(cè)光密度（optical density，OD）值。 實(shí)驗(yàn)分為Blank 組、Mock 組和 CTD 組， 其中 CTD 組的濃度分別為 0.05、0.1、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024 μmol/L。使用 Graphpad prism 5 軟件進(jìn)行半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）數(shù)值計(jì)算。

1.2.5 Caspase 3/7 熒光法檢測(cè)凋亡 于96 孔板內(nèi)接種細(xì)胞，每組三個(gè)復(fù)孔，孵育48 h 后加藥處理，48 h后加Caspase 3/7 反應(yīng)液檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.4。

1.2.6 流式細(xì)胞儀PI 單染法檢測(cè)細(xì)胞周期 于6 孔板內(nèi)接種細(xì)胞，每組三個(gè)復(fù)孔，孵育24 h 后加藥處理，48 h 后收集細(xì)胞，于4℃冰箱固定24 h，加入Rnase A溶液和PI 染色液后上機(jī)檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)分為Mock 組和CTD 組，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.7 測(cè)序技術(shù)檢測(cè)差異表達(dá)的mRNA 收集足量細(xì)胞，采用Trizol 法提取總RNA 后進(jìn)行建庫(kù)，質(zhì)檢合格后，采用Illumina 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行RNA seq，隨后進(jìn)行差異基因篩選，并進(jìn)行富集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT 法檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果見圖1。CTD 對(duì)HepG2 的抑制呈現(xiàn)一定程度的劑量-時(shí)間依賴，且 24、48、72 h 的 IC50分別為54.420、9.892、4.132 μmol/L，48 h 對(duì)應(yīng)曲線的線性效果最佳。因此，參考 48 h 的 IC50值，將 10 μmol/L 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的CTD 藥物濃度。

圖1 CTD 作用于HepG2 的劑量反應(yīng)曲線

2.2 Caspase 3/7 熒光法檢測(cè)結(jié)果

Caspase 3/7 熒光法檢測(cè)結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，加藥作用 48 h 后，MOCK 組熒光強(qiáng)度為 7661.67±108.87，CTD 組為 24 310.00±305.50，與 MOCK 組比較，CTD組熒光強(qiáng)度有明顯的增強(qiáng)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），CTD 是 HepG2 凋亡的有效誘導(dǎo)物。

圖2 CTD 對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響

2.3 流式細(xì)胞儀PI 單染法檢測(cè)的 CTD 對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀PI 單染法檢測(cè)結(jié)果見圖3（封三）。與MOCK 組比較， 加藥作用 48 h 后，G0/G1期和 S 期下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而 G2/M 期則明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），CTD 可將 HepG2細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期。

圖3 CTD 對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響

2.4 測(cè)序技術(shù)檢測(cè) CTD 對(duì) HepG2 細(xì)胞 mRNA 差異表達(dá)譜的影響

2.4.1 差異基因篩選結(jié)果 mRNA 差異基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4（封四）。 當(dāng)差異基因篩選的閾值為|log2（Fold Change）|＞2 且 Padj＜0.05 時(shí) ，mRNA 差 異 基 因 共 計(jì)6293 個(gè)，其中5694 個(gè)差異表達(dá)水平升高，599 個(gè)差異表達(dá)水平下降。

2.4.2 差異基因富集分析結(jié)果 差異mRNA 靶基因的GO 功能富集和KEGG 通路富集結(jié)果分別見圖5~6（封四），篩選條件均為 Padj＜0.05。 GO 功能富集選擇顯著性最明顯的一個(gè)注釋， 即為endoplasmic reticulum lumen（P＜0.05），屬于 cellular component 類目。KEGG通路富集主要富集在p53 signaling pathway、PI3KAkt signaling pathway、Apoptosis、MicroRNAs in cancer以及多種代謝途徑（P＜0.05），差異基因可能通過這些不同的功能及通路調(diào)控HepG2 細(xì)胞的生物進(jìn)程。 對(duì)于以上篩選出的顯著差異表達(dá)mRNA，通過大量的查閱文獻(xiàn)并結(jié)合GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，以及按照差異基因相對(duì)表達(dá)量的變化倍數(shù)從高到低進(jìn)一步篩選出mRNA 共計(jì)18 個(gè)基因，其中14 個(gè)基因表達(dá)水平上調(diào)，4 個(gè)基因表達(dá)水平下調(diào)， 結(jié)果見表1，這些基因在CTD 作用于HepG2 細(xì)胞時(shí)可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。

表1 顯著差異表達(dá)的mRNA 基因匯總表

3 討論

本研究將阿拉嘎斑布的有效成分CTD 選為研究藥物，以HepG2 細(xì)胞為研究對(duì)象，先后從CTD 作用于HepG2 細(xì)胞后的細(xì)胞增殖、凋亡和周期分布三個(gè)角度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示，CTD 可顯著抑制HepG2的增殖，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)凋亡和觸發(fā)細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期有關(guān)。

為了進(jìn)一步研究CTD 抑制肝癌的作用機(jī)制，本研究采用RNA-seq 測(cè)序技術(shù)， 從mRNA 基因差異表達(dá)譜的角度研究CTD 抑制肝癌的分子機(jī)制。 最終篩選出18 個(gè)顯著差異表達(dá)的mRNA， 這些基因參與調(diào)控多種信號(hào)通路如p53 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、p38-MAPK 信號(hào)通路等。

雙特異性磷酸酶（dual specificity phosphatase,DUSP）、CDKN1A 和 CDK1 是以上篩選出的顯著差異表達(dá)的mRNA。DUSP 屬于酪氨酸磷酸酶中的亞家族，其在體內(nèi)可參與調(diào)控多種信號(hào)途徑， 與腫瘤關(guān)系密切[15-16]。 DUSP1 是 DUSP 的家族成員之一， 研究表明DUSP1 可通過對(duì)MAPK 信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)性調(diào)控從而對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖進(jìn)行抑制[17-19]，提示DUSP1 在肝癌中發(fā)揮的是抑癌作用， 與本研究的測(cè)序結(jié)果一致，即用 CTD 處理 HepG2 細(xì)胞后， 與對(duì)照組比較，CTD 組的DUSP1 mRNA 表達(dá)水平上調(diào)， 可以推測(cè)DUSP1 在CTD 的抗肝癌過程中發(fā)揮重要作用。

CDKN1A，又名P21，是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的抑制劑，其對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控具有關(guān)鍵作用[20-21]。 研究發(fā)現(xiàn)，CDK1 是CDKN1A 的重要靶標(biāo)，CDKN1A 通過下調(diào)CDK1 使其活性受到抑制，從而將細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期[22]。 這表明CDKN1A 和CDK1 在調(diào)控細(xì)胞周期階段轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用，與本研究的結(jié)果一致，即將CTD 作用于HepG2 細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，CTD 組 HepG2 細(xì)胞被阻滯于G2/M 期，且 CTD 組的CDKN1A mRNA 表達(dá)水平上調(diào)， 而CDK1 mRNA 表達(dá)水平下調(diào)， 提示CDKN1A 對(duì)CDK1 的負(fù)性調(diào)控可能是CTD 將 HepG2 細(xì)胞阻滯于G2/M 期的重要環(huán)節(jié)。

以上這些基因中，一部分已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道其與肝癌或者其他腫瘤在分子機(jī)制上的關(guān)系，但絕大多數(shù)均未從CTD 的角度進(jìn)行過分析研究， 而本研究目前的結(jié)果已表明這些基因可能會(huì)是CTD 抑制肝癌的重要應(yīng)答基因，因此這些基因?qū)?huì)是本研究下一步繼續(xù)深入研究CTD 抑制肝癌分子機(jī)制的研究對(duì)象。