苑建偉,齊鵬翔*，侯小歌，高俊乾

(1.周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)牧工程學(xué)院，河南 周口 466000；2.周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466000)

紅曲霉屬真菌界、紅曲霉屬 (MonascusvanTieghem)，形態(tài)多為不規(guī)則的分支菌絲，菌絲多核具有大型液泡、線粒體和橫隔[1]；分生孢子單一或成串地生長于菌絲頂端，并從上至下逐漸成熟[2]。菌落有成絨氈狀、皮膜狀、皮膜狀少褶皺或具有輻射紋。

紅曲霉菌最顯著的特征是可以產(chǎn)生紅色色素，紅曲色素具有抑制脂肪酶衍生物活性的特點(diǎn)，對(duì)紅曲發(fā)酵過程中產(chǎn)生的D型氨基酸具有較高的抑制活性[3-4]。在紅曲發(fā)酵過程中，紅曲霉菌可以產(chǎn)生多種功能的次生代謝產(chǎn)物，包括抗抑菌物質(zhì)、膽固醇生物合成抑制劑、麥角固醇等[5]。一些科學(xué)研究表明，這些次生代謝產(chǎn)物具有抗炎[6-7]、抗氧化[8]活性，同時(shí)可以預(yù)防或改善高膽固醇血癥[9]、高脂血癥[10]、高血壓、糖尿病[11]、肥胖[12]、老年癡呆癥[13]等。近年來，紅曲霉已用于合成食品添加劑及化學(xué)藥物，世界各國掀起了食用綠色食品和天然藥物的熱潮[14-15]。紅曲作為藥食兼用的天然制品，正在引起消費(fèi)者和研究者的極大關(guān)注[16-19]。

本課題主要針對(duì)紅曲霉菌發(fā)酵的功能、發(fā)酵的特性以及在制曲中的應(yīng)用進(jìn)行研究，使人們了解到紅曲霉菌培養(yǎng)產(chǎn)生各種次級(jí)代謝產(chǎn)物的最優(yōu)發(fā)酵條件以及在最優(yōu)條件下對(duì)工業(yè)制曲的積極作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

本實(shí)驗(yàn)從某紅曲米中分離得到的紅曲霉菌，分別命名為F1、F2、F3。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

麥芽汁液體培養(yǎng)基[20]：麥芽粉與水按1∶6混合。37 ℃ 保溫30 min，52 ℃ 保溫60 min，65 ℃保溫約30 min，開始計(jì)時(shí)，每隔5 min測(cè)定糖化液與碘液反應(yīng)，藍(lán)色消失顯黃色時(shí)糖化結(jié)束，78 ℃保溫10 min，滅菌冷卻至室溫待用。

黃豆芽液體培養(yǎng)基[21]：取100 g黃豆芽，加水煮沸20 min后過濾，濾液定容至1000 mL，加葡萄糖50 g，pH自然，分裝滅菌。

1.2 主要儀器與設(shè)備

LRH系列的生化培養(yǎng)箱、SYQ-DSX-280B型不銹鋼壓力蒸汽滅菌器、HZQ-X300恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；101-型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅曲霉菌的分離、純化

1.3.1.1 紅曲霉菌株的分離與純化

分離：取5.0 g紅曲米放入100 mL三角瓶中，加入45 mL無菌水，在35 ℃、150 r/min恒溫振蕩器中振蕩15 min進(jìn)行活化，此濃度為10-1；用移液槍吸取1 mL加入到盛有9 mL的無菌水中，振蕩搖勻，濃度為10-2；依次進(jìn)行梯度稀釋，到10-5。用移液槍吸取10-3、10-4、10-53個(gè)梯度1 mL打入麥芽汁平板培養(yǎng)基中，用涂布涂勻，每個(gè)梯度兩個(gè)平行，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。

純化：用接種環(huán)挑取單菌落，在麥芽汁平板上劃線，30℃培養(yǎng)3～5 d。

1.3.1.2 紅曲霉菌形態(tài)觀察

載玻片濕室培養(yǎng)法[22]：準(zhǔn)備濕室：在培養(yǎng)皿底部鋪一張圓形濾紙片，濾紙片上依次放上“U”玻璃片擱架、載玻片、蓋玻片(兩片)，蓋上皿蓋，外用紙包扎，121 ℃滅菌20 min。取菌接種：用接種環(huán)挑取孢子，輕輕在載玻片上碰幾下，接種量要少，同一載玻片接種兩處。加培養(yǎng)基：用移液槍吸取少量融化冷卻45 ℃豆芽汁培養(yǎng)基滴到接種處，直徑約為0.5 cm。加蓋玻片：待培養(yǎng)基凝固前，用無菌鑷子將蓋玻片蓋上，輕輕按壓，要求蓋玻片與載玻片之間留有小縫隙。倒保濕劑：倒入約3 mL 20%的無菌甘油，使濾紙完全濕潤，蓋上皿蓋，30 ℃培養(yǎng)。觀察：定時(shí)用顯微鏡觀察紅曲霉菌生長情況，取16，24，32，48，72 h時(shí)間點(diǎn)。

1.3.2 紅曲霉菌的發(fā)酵特性研究

1.3.2.1 紅曲霉菌在不同溫度條件下的發(fā)酵特性

選擇豆芽汁液體培養(yǎng)基，15，20，25，30，35，40，45 ℃，培養(yǎng)5 d測(cè)定紅曲霉菌的酸度、色價(jià)、酯化力和糖化酶活力。其中，紅曲霉菌酸度的測(cè)定采用酸堿滴定法，色價(jià)的測(cè)定采用分光光度計(jì)法，采用滴定法測(cè)定酯化酶活力，采用紫外法測(cè)定酶活力[23-24]。

1.3.2.2 紅曲霉菌在不同酸性條件下的發(fā)酵特性

選擇豆芽汁液體培養(yǎng)基，調(diào)初始pH值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，培養(yǎng)5 d測(cè)定紅曲霉菌的酸度、色價(jià)、酯化力和糖化酶活力。

1.3.2.3 紅曲霉菌在不同酒精濃度條件下的發(fā)酵特性

選擇豆芽汁液體培養(yǎng)基，用無水乙醇調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始酒精濃度為1%、3%、5%、7%、9%，培養(yǎng)5 d測(cè)定紅曲霉菌的酸度、色價(jià)、酯化力和糖化酶活力。

1.3.2.4 紅曲霉菌在不同糖度條件下的發(fā)酵特性

選擇豆芽汁液體培養(yǎng)基，設(shè)置初始糖度分別為4%、6%、8%、10%、12%、14%，培養(yǎng)5 d測(cè)定紅曲霉菌的酸度、色價(jià)、酯化力和糖化酶活力。

1.3.3 紅曲霉菌在制曲中的應(yīng)用

1.3.3.1 紅曲霉菌種子液的制備

選擇初始pH 5.5、糖度10%、酒精度5%的麥芽汁液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5 d得到種子液。

1.3.3.2 紅曲霉應(yīng)用于麩曲的制備

將紅曲霉菌種子液以10%的接種量分別接種于500 mL三角瓶、1000 mL三角瓶和托盤的無菌麩皮中，30 ℃培養(yǎng)7～8 d，采用滴定法、干燥法、滴定法、皂化法測(cè)定麩曲的酸度、水分、糖化酶活力、酯化酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉菌的分離、純化與鑒定

2.1.1 紅曲霉菌的分離與純化

經(jīng)稀釋涂布法分離得到3株紅曲霉菌，對(duì)其編號(hào)為F1、F2、F3。挑取3株菌株的單菌落進(jìn)行純化，觀察發(fā)現(xiàn)F2生長最好、產(chǎn)紅色色素最多，所以選定F2菌株為供試菌種。

2.1.2 菌種觀察

通過平板菌落和鏡檢觀察特征(見圖1)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)煙色紅曲霉菌的F2菌株在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基生長良好，菌落初為白色，老熟后為橙紅色，菌落呈絨狀。菌絲具有橫隔，多核，分枝多而不規(guī)則。分生孢子梗由菌絲生出，頂部產(chǎn)生分生孢子，以向基式生出26個(gè)成串。

圖1 不同時(shí)間紅曲霉菌的生長狀況

2.2 紅曲霉菌的發(fā)酵特性研究

2.2.1 紅曲霉菌在不同溫度條件下的發(fā)酵特性

由圖2可知，不同溫度均會(huì)對(duì)煙色紅曲霉菌產(chǎn)酸、產(chǎn)色素、酯化酶活力和糖化酶活力產(chǎn)生不同程度的影響。當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，煙色紅曲霉菌的產(chǎn)酸最高，為1.2 mL/dL，產(chǎn)酸較高的溫度范圍為30～35 ℃，工業(yè)化生產(chǎn)一些需要產(chǎn)酸發(fā)酵的工藝可以控制溫度在30～35 ℃。 煙色紅曲霉菌產(chǎn)色素最高的溫度為35 ℃，產(chǎn)色素最佳的溫度范圍為30～40 ℃。煙色紅曲霉菌酯化酶活力最高的是30 ℃，可達(dá)到19.94 U/mL；酯化酶活力較高的溫度范圍為30～35 ℃。當(dāng)溫度為35 ℃時(shí)，糖化酶活力最高，此時(shí)糖化酶活力27.6 U/mL，糖化酶活力較高的溫度范圍為30～35 ℃。綜合考慮，煙色紅曲霉菌在溫度30～35 ℃發(fā)酵特性最為明顯，所以在制曲工藝中可以控制溫度在30～35 ℃。

圖2 不同溫度對(duì)煙色紅曲霉菌產(chǎn)酸、產(chǎn)色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響Fig.2 The effect of different temperatures on acid production, pigment production, esterification enzyme activity and saccharification enzyme activity of Monascus fuliginosus Sato

2.2.2 煙色紅曲霉菌在不同酸性條件下的發(fā)酵特性

由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基的pH為6.0時(shí)，煙色紅曲霉菌產(chǎn)酸最高，為3.6 mL/dL；產(chǎn)色素最高的pH為5.0；酯化酶活力最高的pH為6.0，所以對(duì)于產(chǎn)色素要求較高的發(fā)酵工藝可以控制pH在5.5～6.0，此時(shí)酶活力為20.15 U/mL。pH≥4每?jī)蓚€(gè)梯度間酯化力差距不大，酯化力最適的酸度范圍在pH 4.0～7.0，所以對(duì)于產(chǎn)乙酸乙酯要求較高的工藝，可以將培養(yǎng)液酸度控制在pH 4～7。糖化酶活力最高的pH為5.0，酶活力為18.92 U/mL，所以對(duì)一些糖化酶活力要求較高的工藝可以控制酸度pH為4.0～5.5。綜合考慮，煙色紅曲霉菌發(fā)酵最適的酸度范圍為pH 5.0～6.0。

圖3 不同pH對(duì)煙色紅曲霉菌產(chǎn)酸、產(chǎn)色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響Fig.3 The effect of different pH values on acid production, pigment production, esterification enzyme activity and saccharification enzyme activity of Monascus fuliginosus Sato

2.2.3 煙色紅曲霉菌在不同酒精濃度條件下的發(fā)酵特性

酒精度對(duì)煙色紅曲霉菌產(chǎn)酸、產(chǎn)色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響見圖4。

圖4 不同酒精度對(duì)煙色紅曲霉菌產(chǎn)酸、產(chǎn)色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響

由圖4可知，當(dāng)酒精度為7%時(shí)煙色紅曲霉菌產(chǎn)酸最高，酸度為1.6 mL/dL，產(chǎn)酸較高的酒精度范圍為7%～9%；當(dāng)酒精度為5%時(shí)，煙色紅曲霉菌產(chǎn)色素最高；當(dāng)酒精度為1%時(shí)，酯化酶活力最高，可達(dá)到19.9 U/mL，酯化酶活力最適的酒精度范圍為1%～5%，所以對(duì)于一些產(chǎn)乙酸乙酯要求較高的企業(yè)可以控制酒精度在1%～5%；糖化酶活力最高的酒精度是5%，為18.9 U/mL。綜合考慮，煙色紅曲霉菌發(fā)酵最適的酒精度范圍為5%左右。

2.2.4 煙色紅曲霉菌在不同糖度條件下液體培養(yǎng)基發(fā)酵特性

不同糖度對(duì)煙色紅曲霉菌產(chǎn)酸、產(chǎn)色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響見圖5。

圖5 不同糖度對(duì)煙色紅曲霉菌產(chǎn)酸、產(chǎn)色素、酯化酶活力和糖化酶活力的影響Fig.5 The effect of different sugar content on acid production, pigment production, esterification enzyme activity and saccharification enzyme activity of Monascus fuliginosus Sato

由圖5可知，煙色紅曲霉菌產(chǎn)酸最高的糖度是10%，為1.4 mL/dL；產(chǎn)色素最高的糖度是10%，為2.38；產(chǎn)酯化酶活力最高的糖度是8%，為21.12 U/mL；糖化酶活力最高的糖度是10%，為21.29 U/mL；綜合考慮，煙色紅曲霉菌發(fā)酵最適糖度為8%～10%。

2.3 煙色紅曲霉菌在不同容器中的發(fā)酵特性

在最優(yōu)的發(fā)酵條件下，不同容器的煙色紅曲霉菌在麩皮擴(kuò)大培養(yǎng)中的酸度、水分含量、酯化酶活力和糖化酶活力的影響見圖6。

圖6 不同容器擴(kuò)大培養(yǎng)對(duì)煙色紅曲霉菌的酸度、水分含量、酯化酶活力和糖化酶活力的影響Fig.6 The effect of amplification culture in different containers on acidity, moisture content, esterification enzyme activity and saccharification enzyme activity of Monascus fuliginosus Sato

由圖6可知，擴(kuò)大培養(yǎng)的酸度最高的是托盤，為2.4 mL/dL；最低的是1000 mL三角瓶，為1.05 mL/dL，托盤產(chǎn)酸量普遍大于三角瓶。水分最高的為1000 mL三角瓶，為75%；水分最低的是托盤，為15%；托盤培養(yǎng)水分小于三角瓶。糖化酶活力最高的是托盤，為112 U/mL；最低的是500 mL三角瓶，為64 U/mL；托盤糖化酶活力普遍大于三角瓶。酯化力最高的是托盤，為16.79 U/mL；最低的是1000 mL三角瓶，為6.29 U/mL；托盤酯化力普遍大于三角瓶。綜合考慮，煙色紅曲霉菌在麩皮發(fā)酵中托盤培養(yǎng)最好。

3 結(jié)論

通過分離，純化共得到3株煙色紅曲霉菌，挑選出長勢(shì)最好的一株煙色紅曲霉菌F2，經(jīng)初步鑒定,菌株F2為煙色紅曲霉菌。該菌株產(chǎn)酸最適條件為溫度30 ℃、pH 6.0、酒精度7%、糖度10%；產(chǎn)色素最適條件為溫度35 ℃、pH 5.0、酒精度5%、糖度10%；酯化酶活力最適條件為溫度30 ℃、pH 6.0、酒精度1%、糖度8%；糖化酶活力最適條件為溫度35 ℃、pH 5.0、酒精度5%、糖度10%。1000 mL三角瓶水分最高，為75%；酸度、酯化酶活力、糖化酶活力托盤培養(yǎng)最高，分別為2.4 mL/dL、16.79 U/mL、112 U/mL。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為實(shí)際工業(yè)制曲生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)，具有一定的參考意義。