吳彩云，張曉榮，徐懷德，雷宏杰

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100）

我國果蔬資源豐富，但存在貯藏加工能力低和鮮銷狀況嚴峻的缺點，這就造成了果蔬原料的浪費，因此需要進一步深加工來解決上述問題。采用益生菌發(fā)酵技術(shù)開發(fā)具有特殊營養(yǎng)保健功能的發(fā)酵果蔬汁飲料，不僅可解決資源浪費，改善果蔬制品的風(fēng)味，還可增強其保健作用，豐富果蔬制品的花色品種，從而解決制約果蔬加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題[1]。

果蔬富含維生素、礦物質(zhì)、膳食纖維和抗氧化物質(zhì)，被認為是益生菌生長的良好基質(zhì)。益生菌發(fā)酵食品可增強黏膜屏障，降低血清膽固醇，刺激免疫系統(tǒng)，抑制腸道炎癥，減輕腹瀉癥狀和增強抗誘變活性[2-4]。益生菌可抑制攝入病原菌的生長，在維持人體胃腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)中起重要作用。發(fā)酵果蔬汁也迎合了素食主義者、乳糖不耐受和高膽固醇人群的需求[5]，顯示出較好的發(fā)展勢頭。

近年來，隨著人們對益生菌認識的不斷深入，有關(guān)益生菌用于果蔬汁飲料加工中的研究報道不斷增多[6-8]。本文主要綜述益生菌發(fā)酵果蔬汁過程中生物活性化合物的變化和功能特性評價，為其工業(yè)化生產(chǎn)和功能性開發(fā)提供參考。

1 益生菌發(fā)酵果蔬汁

益生菌發(fā)酵果蔬汁，指果肉破碎后接入對人體有益的益生菌，通過短時間的發(fā)酵后立即冷藏保存的活菌飲料。通過發(fā)酵，水果蔬菜的營養(yǎng)被最大限度的保留，并且發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量活性多糖、短鏈脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，還富含大量的活性益生菌，有利于腸道環(huán)境的改善和提高人體免疫能力。目前發(fā)酵果蔬汁屬于新興的產(chǎn)品，市場能見度較低，但由于其健康和營養(yǎng)特性，必將受到市場的歡迎。

益生菌發(fā)酵，是一個降糖產(chǎn)酸并形成多種次級代謝產(chǎn)物的過程，對風(fēng)味、口感、保質(zhì)期有積極影響。益生菌在果蔬中的存活往往比在乳制品中復(fù)雜，由于果蔬汁的天然酸度，高含量的多酚和不存在乳糖，可能會干擾某些微生物的生長和存活。但如表1所示，國內(nèi)外研究人員近年來做了許多工作，探討多種果蔬汁的益生菌發(fā)酵過程及生理特性。發(fā)酵所用原料、益生菌和發(fā)酵工藝的不同會得到不同的結(jié)論。例如Maldonado 等[9]用干酪乳桿菌、嗜熱乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合發(fā)酵了楊桃、番石榴、芒果和火龍果4 種熱帶水果，發(fā)現(xiàn)芒果和番石榴適宜發(fā)酵，但楊桃和火龍果中由于含有一定的抗?fàn)I養(yǎng)因子，阻礙了益生菌的生長，且感官接受率低，不適宜乳酸發(fā)酵。Chen 等[10]用4 種益生菌（嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌）分別發(fā)酵蘋果汁，得出以蘋果酸為代價生成乳酸是發(fā)酵樣品的共同特征，但在嗜酸乳桿菌中特別明顯。絕大多數(shù)果蔬汁通過發(fā)酵獲得了更佳的營養(yǎng)特性，原因是其生物活性分子在發(fā)酵過程中被轉(zhuǎn)化、降解并形成新的化合物，從而賦予發(fā)酵果蔬汁新的營養(yǎng)特性和功能特性。

表1 益生菌發(fā)酵果蔬汁Table 1 Fruit and vegetable juices fermented by probiotics

（續(xù)表1）

2 益生菌發(fā)酵果蔬汁過程中化學(xué)成分及生物活性物質(zhì)的變化

2.1 有機酸

有機酸在果蔬中含量豐富，在發(fā)酵過程中還會進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化所引起的含量和種類變化不僅對感官品質(zhì)有重要影響，也影響著發(fā)酵果蔬汁的化學(xué)穩(wěn)定性、可接受性、營養(yǎng)特性和貯藏質(zhì)量[24]。

發(fā)酵期間，益生菌進行三羧酸循環(huán)，作為生物體三羧酸循環(huán)的中間體，蘋果酸參與多個不同的生化反應(yīng)，所以其含量處在動態(tài)變化中。李維妮等[13]發(fā)現(xiàn)益生菌在發(fā)酵過程中，不但利用蘋果酸合成乳酸等多種物質(zhì)，而且還利用其它物質(zhì)合成蘋果酸。蘋果酸-乳酸轉(zhuǎn)化是發(fā)酵過程中極其重要的一步，這不僅賦予了果蔬汁良好的發(fā)酵風(fēng)味，而且使果蔬汁具有調(diào)節(jié)人體腸道微環(huán)境、延長保質(zhì)期和抗菌的功效。蘋果酸-乳酸發(fā)酵是將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸來“軟化”葡萄酒和蘋果酒酸味的一種典型方法。蘋果酸和乳酸結(jié)構(gòu)不同，兩者之間的轉(zhuǎn)化是由一種蘋果乳酸酶介導(dǎo)的，即使它不涉及底物水平磷酸化，細菌也能從中獲得能量，并釋放CO2。然而Landete 等[25]發(fā)現(xiàn)了蘋果酸轉(zhuǎn)化的另一種代謝途徑，蘋果酸可以通過蘋果酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為丙酮酸，然后轉(zhuǎn)化成乙醇和乙酸鹽，這種代謝也以蘋果酸作為主要碳源。但到目前為止，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)的益生菌（干酪乳桿菌、糞腸球菌、牛鏈球菌）以這種方式來轉(zhuǎn)化蘋果酸。

檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，含量處于動態(tài)變化中，這可能是由于蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中益生菌將檸檬酸分解成丙酮酸和乙酸，也有很少一部分轉(zhuǎn)化為乳酸，其中間代謝產(chǎn)物還能產(chǎn)生乙偶姻和雙乙酰等風(fēng)味化合物，這些物質(zhì)對果蔬汁的風(fēng)味有較大影響。Hashemi 等[8]在發(fā)酵甜檸檬汁中發(fā)現(xiàn)檸檬酸是轉(zhuǎn)化乳酸的主要碳源，乳酸濃度增加量不足以補償檸檬酸的下降，從而導(dǎo)致發(fā)酵果汁酸度降低。

琥珀酸在蘋果酸-乳酸途徑中可通過部分丙酮酸氧化為乙酸和H+，H+再將延胡索酸還原得到琥珀酸，也可通過酒石酸分解而生成，但生成量較少。Dudley 等[26]研究表明，益生菌能夠利用三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的檸檬酸合成琥珀酸，同時還會產(chǎn)生乳酸等有機酸，直接影響果汁的酸味[13]。

蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等均可用于發(fā)酵過程中的微生物代謝。此外，復(fù)雜的自然環(huán)境和菌株的不同使微生物有機酸產(chǎn)量不同，代謝速度及代謝底物也不同，在這過程中，有機酸的釋放不僅降低了pH 值，提高了B 族維生素的穩(wěn)定性，而且還參與了香氣和有機酸之間的相互作用，例如，乳酸發(fā)酵主要產(chǎn)物是乳酸和乙酸，可以分別參與酯的形成（乳酸乙酯和乙酸乙酯）以及甲酸、乙酸、丙酸等芳香活性化合物[27]。酸化后的果蔬汁增加了貨架期和安全性，其中苯基乳酸被認為是延長發(fā)酵食品貨架期的主要抗真菌活性因子。

2.2 酚類化合物

酚類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物的主要類型之一，與果蔬汁的澀味、顏色和風(fēng)味等感官品質(zhì)直接相關(guān)[11]，此外，多酚類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有抗氧化活性、自由基清除能力、抗癌和抗炎活性等[19，24，28-29]?？扇苄远喾釉谏舷乐腥菀妆凰夂臀铡５行┤匀槐憩F(xiàn)出較低的生物利用度。此外，不溶性結(jié)合多酚（與多糖或蛋白質(zhì)共價結(jié)合的多酚）不能像可溶性多酚那樣被小腸吸收。因此，提高果蔬汁多酚類化合物的生物利用度，對最大程度上提高其保健功效至關(guān)重要。

近年來，利用益生菌對酚類化合物進行生物轉(zhuǎn)化的研究越來越多。研究表明，益生菌具有去羧基、去酯化、去甲基化和去糖基化的能力。例如，益生菌已被證明能夠通過不同的糖基水解酶作用來釋放苷元引起多酚的生物轉(zhuǎn)化[30]。因此，多酚可以被益生菌轉(zhuǎn)化為具有更高生物利用度和生物活性的化合物。

益生菌發(fā)酵能促進枸杞汁中的綠原酸轉(zhuǎn)化成咖啡酸，酚酸脫羧酶可將對香豆酸代謝為對羥基苯丙酸或?qū)αu基苯甲酸，發(fā)酵可能使得植物細胞壁結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致單體酚增加[21]。Li 等[31]觀察到益生菌對蘋果汁中的酚類物質(zhì)進行了大量的代謝，增加了5-O-咖啡奎寧酸、槲皮素的含量，從而獲得較強的抗氧化活性，其原因可能是益生菌利用槲皮素結(jié)構(gòu)中的葡萄糖分子作為能源消耗，導(dǎo)致相關(guān)糖苷配基的產(chǎn)生，從而具有更高的自由基清除效果，導(dǎo)致抗氧化性的增強。通過益生菌發(fā)酵接骨木汁的單體酚分析可得到發(fā)酵過程中可消耗咖啡酸和原兒茶酚酸產(chǎn)生具有更高活性的二氫咖啡酸和兒茶酚[32]。在發(fā)酵石榴汁中，總酚含量的增加與發(fā)酵過程中游離酚類化合物的增加以及兒茶素和安石榴甙等新的酚類衍生物的產(chǎn)生有關(guān)[33]。由此可知，益生菌的存在促進了酚類化合物的簡單轉(zhuǎn)化和高分子酚類化合物的解聚，盡管酚類化合物有相同的骨架和基本結(jié)構(gòu)特征，但羥基的位置和數(shù)量對其生物學(xué)和功能性質(zhì)有重要影響[34]。益生菌可能會耗盡酚類化合物中可用的葡萄糖分子，從而產(chǎn)生具有更多羥基的游離糖苷鍵或降低對羥基的空間位阻，導(dǎo)致發(fā)酵過程中產(chǎn)生更多具有更高抗氧化活性的代謝物[11]。大量研究表明，酚類化合物具有抗氧化活性，可作為還原劑、自由基清除劑和單態(tài)氧淬滅劑，這些抗氧化性能主要歸因于氫原子轉(zhuǎn)移或向自由基提供電子。羥基肉桂酸和羥基苯甲酸的抗氧化機制也與它們修飾某些細胞信號過程的能力有關(guān)，這些過程可以提高抗氧化酶活性，從而降低氧化應(yīng)激[2]。

不同菌株具有不同的酚類特征可能是由于其特定酶的作用，例如植物乳桿菌能產(chǎn)生單寧酶（水解單寧并釋放葡萄糖和沒食子酸），單寧首先通過單寧酶的水解活性轉(zhuǎn)化為沒食子酸，后通過脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化為鄰苯三酚，從而具有更強的抗氧化活性（圖1）。

圖1 沒食子酸通過脫羧反應(yīng)轉(zhuǎn)化為鄰苯三酚[28]Fig.1 Gallic acid is converted to pyrogallol by decarboxylation[28]

這些酶能分解植物細胞壁的化學(xué)成分，水解酯鍵，將酚類化合物連接到細胞壁基質(zhì)上[19]。益生菌具有生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力，可將植物化學(xué)成分水解成簡單物質(zhì)，發(fā)酵液中總酚、黃酮、花青素高的原因可能是益生菌產(chǎn)生酯酶，會分解糖苷的酯鍵，釋放出可溶性和不溶性酚類化合物。解聚、異構(gòu)化、縮合和聚合反應(yīng)會引起樣品中植物化學(xué)成分的增加[35]。內(nèi)源性β-葡萄糖苷酶在增加豆乳中糖苷異黃酮的含量和改善豆乳的生物活性方面起重要作用[36]。在益生菌中對阿魏酸酯酶活性的研究尤為突出。阿魏酸酯酶可以從共軛酚酸中釋放對香豆酸、阿魏酸和咖啡酸。沒食子酸、鞣花酸、黃酮類化合物和黃烷-3-醇的釋放與酯酶活性有關(guān)。這種活性可增加吸收的游離酚酸的含量，同時也增加了從纖維中釋放結(jié)合酚酸的含量[28]。益生菌代謝途徑取決于其酶組合，由于植物化學(xué)成分的多樣性和各種生物轉(zhuǎn)化途徑，使得益生菌發(fā)酵就像迷宮（見圖2），走出迷宮的結(jié)果是生物活性化合物的高生物利用度和抗?fàn)I養(yǎng)因子的減少[37]。

圖2 益生菌發(fā)酵植物性食品的代謝迷宮圖[37]Fig.2 Metabolic labyrinth of plant foods fermented by probiotics[37]

另外，發(fā)酵果蔬汁中多酚的含量和種類也取決于制備方法，如利用果膠酶從多糖結(jié)構(gòu)中釋放酚類化合物會使其發(fā)生變化，影響果汁的感官質(zhì)量和抗氧化活性[29]。超聲對總酚影響顯著，說明超聲過程中多酚類化合物發(fā)生了異構(gòu)化、聚合，解聚和縮聚反應(yīng)[35，38]。

2.3 揮發(fā)性化合物

益生菌發(fā)酵果蔬汁既具有乳酸發(fā)酵的特殊味道，又不失果蔬原料的自然風(fēng)味，從而構(gòu)成了發(fā)酵果蔬汁的獨特風(fēng)味，而揮發(fā)性化合物是評價果蔬汁品質(zhì)的重要指標(biāo)。

醇類物質(zhì)是益生菌發(fā)酵果蔬汁中一類重要的揮發(fā)性香氣成分。高級醇是指含有3 個碳原子以上的一元醇類的總稱，少量的高級醇能夠賦予果蔬汁淡雅的香氣[39]。醇類被認為是果蔬汁芳香譜中最主要的化合物之一，一般由相應(yīng)的醛通過脫氫酶催化的還原反應(yīng)形成，另外乳糖的代謝、甲基酮的還原、氨基酸的代謝都可生成相應(yīng)的醇，特別是在益生菌的作用下，這些反應(yīng)更加強烈[15]。醇類通常具有芳香、植物香，其閾值一般很低，對風(fēng)味的形成有不容忽視的作用，還可以作為其它芳香物質(zhì)的溶劑，從而對整體香氣貢獻更大。Chen 等[10]觀察到益生菌發(fā)酵蘋果汁產(chǎn)生了2-乙基己醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、乙酸乙酯等重要香氣組分。在發(fā)酵胡柚汁中觀察到醇類化合物含量顯著增加，其中L-香芹醇相對含量提高至3.29%，其它共有成分相對含量均提高到一半以上，同時檢測到大量新的醇類化合物。增加了發(fā)酵汁的香味復(fù)雜性[15]。

酯類物質(zhì)是發(fā)酵果蔬汁中一類含量多且種類豐富的香氣成分，一般具有芳香氣味或特定水果香味。酯的生物合成主要是以下兩條途徑：一是酯化，醇類和有機酸在酯酶的作用下生成酯類物質(zhì)；二是醇解，醇類和甘油酯或乙酰輔酶A 在?；D(zhuǎn)移酶或酯酶的作用下合成酯類物質(zhì)[40]。混合果汁發(fā)酵過程中酯類數(shù)量增加，發(fā)酵時間是影響發(fā)酵產(chǎn)物代謝活性和風(fēng)味特征的重要因素[27]。

除了醇類、酯類等主要的香氣物質(zhì)，果蔬汁發(fā)酵過程中還會產(chǎn)生其它種類的一些揮發(fā)性香氣成分，如醛類、酮類和酚類等，它們的含量雖然較低，但對果蔬汁的香氣也有貢獻，是使果蔬汁具有特征風(fēng)味的重要物質(zhì)[39]。

酮類化合物香味優(yōu)異持久，一般具有花香和果香風(fēng)味，其閾值要高于其同分異構(gòu)體醛，其中不飽和酮類具有較高的揮發(fā)性。大多數(shù)酮是脂肪酸通過微生物的氧化或脫羧途徑產(chǎn)生的[21，41]。益生菌發(fā)酵后一般酮類物質(zhì)會增加，對風(fēng)味起到加強作用，且隨著菌種不同增加的種類和相對含量不同，原因可能是酮類物質(zhì)是氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，而益生菌的加入對氧化反應(yīng)起到促進作用。

醛類化合物閾值較低，賦予香氣能力較強。高含量的醛類物質(zhì)可能會引起異味，消費者難以接受[41]。醛類化合物很少被檢測到，這可能是由于它們在基質(zhì)中的不穩(wěn)定性，容易被還原成醇或氧化成酸。

有機酸的變化與某些芳香活性物質(zhì)的產(chǎn)生顯著相關(guān)[27]。例如檸檬酸的降解通常會導(dǎo)致雙乙酰、乙縮醛、丁二醇和乙醛等發(fā)酵物的產(chǎn)生[42]。乙偶姻具有奶油或香草氣味，可以通過雙乙酰還原酶從2，3-丁二酮轉(zhuǎn)化而來，也可通過檸檬酸代謝產(chǎn)生[21]。2，3-丁二酮為發(fā)酵食品提供甜味和黃油味，與乙偶姻含量成正相關(guān)[43]。

在乳酸發(fā)酵過程中，有些揮發(fā)性化合物的生物合成與氨基酸的分解代謝直接相關(guān)[44]。L-天冬氨酸被認為是產(chǎn)生乙酰乙酸和雙乙酰等揮發(fā)性化合物的重要前體，還可以通過氨基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生α-酮酸草酰乙酸，其可被干酪乳桿菌催化分解為丙酮。高級醇的生成主要是由氨基酸轉(zhuǎn)換為酮酸，再脫羧變成醛，醛還原成為高級醇。通過上述途徑，纈氨酸、亮氨酸分別轉(zhuǎn)化為異丁醇和異戊醇，對發(fā)酵果蔬汁香氣有所影響。從呈味特征來看，蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸均表現(xiàn)為甜味；甘氨酸主要呈現(xiàn)鮮味和一定的酸味；纈氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸主要表現(xiàn)為苦味。益生菌發(fā)酵代謝大多是消耗眾多苦味氨基酸，生成一定的甜味氨基酸，使發(fā)酵果蔬汁口感更為協(xié)調(diào)[45]。Cui 等[43]發(fā)酵果蔬汁（蘋果∶胡蘿卜∶西紅柿∶黃瓜∶山楂=40∶25∶15∶15∶5） 得出干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌對鮮味貢獻大，植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌對酸味貢獻大。不同的益生菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生不同的代謝反應(yīng)，對產(chǎn)品的風(fēng)味也有不同的影響。

2.4 其它活性成分

除上述活性成分外，益生菌發(fā)酵果蔬汁中其它活性物質(zhì)的變化也對人體產(chǎn)生許多有利影響。例如乳酸發(fā)酵提高了馬齒莧汁中維生素B2的生物利用度[14]；益生菌在發(fā)酵過程中可降解蛋白質(zhì)形成生物活性肽，其一般由3 到20 個氨基酸組成，具有降血壓、降血脂、抗氧化、抗菌、調(diào)節(jié)免疫、保護骨骼等多種作用[4]；從發(fā)酵蔬菜中分離出的益生菌菌株能夠產(chǎn)生大量胞外多糖，具有在食品生物技術(shù)中應(yīng)用的潛力（即提高發(fā)酵產(chǎn)品的流變性能）[17]……益生菌發(fā)酵果蔬汁過程中化學(xué)成分及生物活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)變改善了食品成分的生物可及性和生物利用度，不僅延長了產(chǎn)品的貨架期，還賦予了新的保健功能，對人體產(chǎn)生各種有益影響。

3 益生菌發(fā)酵果蔬汁過程中功能變化

3.1 抗氧化

大量研究表明，益生菌發(fā)酵制品具有較強抗氧化活性的原因主要有兩個，第一是益生菌自身具有的抗氧化活性。例如在面臨過多氧自由基時，益生菌會產(chǎn)生超氧化物歧化酶（SOD 酶）、過氧化氫酶、硫醇類等活性抗氧化性物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌的抗氧化機制大致有4 種：1）抵抗氧脅迫作用；2）調(diào)控信號通路途徑；3）清除自由基系統(tǒng)；4）抑制脂質(zhì)過氧化和金屬離子影響[46]。當(dāng)益生菌面臨過多活性氧（ROS）威脅時，自身可通過以上抗氧化機制的一種或多種協(xié)助來清除ROS[47]。在抗氧化富集方面，具有β-葡萄糖苷酶活性的益生菌（嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、長雙歧桿菌等）具有增加異黃酮糖苷配基的能力。嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌可產(chǎn)生淀粉酶、乳酸脫氫酶、肽酶、蛋白酶等活性酶，將原料基質(zhì)轉(zhuǎn)化為功能分子，特別是植物乳桿菌產(chǎn)生的酶如酚酸脫羧酶、苯酚氧化酶、蛋白酶和單寧酸酶等，這些酶與不同基質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化相關(guān)，從而造成不同的抗氧化活性。

第2 個原因是果蔬汁在益生菌發(fā)酵作用下所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性。氨基酸在抗氧化反應(yīng)中起著重要的作用，其主要是作為電子供體，因其具有疏水性，能夠直接與自由基結(jié)合，形成有利于發(fā)揮其抗氧化性及能夠螯合金屬離子等的構(gòu)象。發(fā)酵還可使氨基酸轉(zhuǎn)氨生成α-酮酸，進一步降解產(chǎn)生醛類、多酚類和羧酸等抗氧化活性物質(zhì)。因此益生菌自身的抗氧化活性與發(fā)酵過程中代謝物質(zhì)所產(chǎn)生的活性物質(zhì)共同增強了益生菌發(fā)酵制品的抗氧化活性[47]。

其次抗氧化活性還受酚類化合物分子結(jié)構(gòu)的影響[21]，而這種結(jié)構(gòu)依賴于附著在基本糖苷配基上的基團[48]。在發(fā)酵桑葚汁中，觀察到1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基清除率都呈增加趨勢[11]。DPPH 的增加可能歸因于總酚的增加和可能存在質(zhì)子性質(zhì)的與DPPH 自由基反應(yīng)的組分。ABTS 與酚氧上芳香苯環(huán)與自由電子對共振產(chǎn)生的酚羥基和離域電子有關(guān)。黃酮類化合物與抗氧化之間的關(guān)系可能與酸度及酚羥基的數(shù)量有關(guān)。它們的芳香苯環(huán)與酚氧上的自由電子對之間的共振引起電子離域的增加，從而增加了它們對自由基的清除能力。Estefanía 等[7]發(fā)酵石榴汁的結(jié)果顯示，鐵離子還原力（FRAP）活性的大小可能與兒茶素的降解有關(guān)。另外發(fā)酵石榴汁還能消除活性氧和調(diào)節(jié)從外周單個核細胞合成免疫介質(zhì)，抑制K562 腫瘤細胞生長。酚類生物活性物質(zhì)在植物化學(xué)成分中的健康相關(guān)功能以及作為抗氧化營養(yǎng)抑制劑的潛力主要是由于幾種酚酸在組合中的不同比例和濃度及其相互協(xié)同作用，從而決定了對人體健康的相關(guān)生物功能[6]。在發(fā)酵蘋果汁中，觀察到發(fā)酵前后DPPH 和ABTS 趨勢不同，是因為其轉(zhuǎn)移基質(zhì)不同，DPPH 是基于電子轉(zhuǎn)移機制，而ABTS 是基于氫原子轉(zhuǎn)移機制。

3.2 抑菌

使用益生菌發(fā)酵果蔬汁是一種獲得更安全和有更長貨架期的產(chǎn)品的有效策略，因為它能延遲或防止常見的有害細菌的生長。

在大多數(shù)情況下，有害菌株生長的抑制歸因于益生菌的有機酸和其胞外代謝產(chǎn)物。Luana 等[49]利用3 種菌株發(fā)酵乳清，抗真菌結(jié)果分析表明，發(fā)酵液對鐮刀菌屬真菌（念珠菌屬、禾本科菌屬和黃萎病原菌屬）具有較好的抗菌活性，而對曲霉屬和青霉屬真菌的抗性較弱。在評估的無細胞上清中，乳酸、乙酸和苯基乳酸被確定為具有抗真菌作用的代謝物，中和處理后抗真菌活性喪失。上清液的中和及過氧化氫酶處理降低或消除了對病原菌的拮抗活性，這表明抑制病原菌生長的最主要因素是環(huán)境的低pH 值[50]。酸通常具有抗菌作用，因為其干擾細胞膜電位，降低細胞內(nèi)pH 值，抑制活性轉(zhuǎn)運和多種代謝功能。在發(fā)酵甜檸檬汁中觀察到發(fā)酵液對沙門氏菌的抑制性大于大腸桿菌[8]，這是因為乳酸與革蘭氏陰性外膜相互作用可以增加膜的通透性，從而使其它抗菌化合物進入細菌。發(fā)酵甜菜汁對李斯特菌的抑制性較大，可能是由于乳酸和檸檬酸的存在[22]，也可能是由于細菌蛋白的存在，主要是細菌素。

細菌素是由細菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的具有生物活性的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物（蛋白質(zhì)聚集體、脂糖蛋白、糖蛋白等），這些化合物具有抗菌活性，旨在中和微生物競爭，促進優(yōu)勢菌群，有助于防止食物被潛在致病菌污染[28]，它們對革蘭氏陽性菌具有獨特的殺菌作用。Vaithiyanathan 等[22]通過傅里葉紅外光譜檢測到益生菌發(fā)酵甜菜汁產(chǎn)生了芳香原胺基，說明發(fā)酵甜菜汁中可能存在細菌蛋白，有助于發(fā)酵液的抗菌性。它們的合成在細胞中受核糖體調(diào)控，但機制尚不清楚，大多數(shù)細菌素具有窄譜，但具有廣譜活性，Nisin 是被應(yīng)用的防腐劑。

抑真菌活性可能也與酚類化合物的產(chǎn)生有關(guān)。一般來說，羥基在酚類化合物中的位置會顯著影響抗菌活性。沒食子酸、肉桂酸等酚酸通過改變細胞膜的疏水性，局部破裂或形成孔等引起膜的不可逆變化，導(dǎo)致細胞內(nèi)成分泄漏。黃酮類化合物的抑菌機制可能是由于它們能夠與細胞壁形成復(fù)合物，從而抑制細胞生長。槲皮素的抑菌機理部分是由于抑制了DNA 回旋酶的活性[51]。類黃酮、單寧等酚類物質(zhì)可通過細胞膜來擴散，降低膜的流動性，引起細胞液平衡失調(diào)，這可能是其抑菌的原因之一[52]。

另外過氧化氫、雙乙酰和抗菌肽等，這些都有很強的抑菌能力，可抑制多種致病菌[53]。

3.3 調(diào)節(jié)腸道菌群

腸道菌群是一個容易被人忽略但對人類健康做出重大貢獻的“器官”，具有多種生理功能：維持上皮屏障、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、產(chǎn)生不同的代謝物、抑制病原體黏附在腸道表面等。一些胃腸和非胃腸疾病與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)，例如炎癥性腸病[54]。

益生菌是公認的具有“保護作用” 的腸道菌群，對人體有多種益處[55]，如減少乳糖不耐癥、降低血清膽固醇水平、控制腸道感染、刺激免疫系統(tǒng)和抗癌活性。此外，它們還能促進短鏈脂肪酸和氨基酸（精氨酸、半胱氨酸和谷氨酰胺）在內(nèi)的黏膜必需營養(yǎng)物質(zhì)的形成。

在腸道中，益生菌幫助宿主維持正常的黏膜內(nèi)環(huán)境平衡，保護黏膜免受毒素、過敏原和病原體等有害因素的傷害[56]。益生菌的健康作用依賴于它們增強營養(yǎng)狀況和腸道微生物群平衡能力以及調(diào)節(jié)宿主免疫的能力，這使它們能夠改善生物失調(diào)和代謝及免疫功能失調(diào)[2]。Estefanía 等[3]以番茄和斐濟果作為植物乳桿菌的可發(fā)酵載體，試驗得出發(fā)酵番茄汁對腸道屏障完整性改善作用最大，經(jīng)消化沒有增加TEER，但黏附作用良好。有報道證明蔓越莓汁的蘋果酸和檸檬酸的濃度會導(dǎo)致Caco-2 細胞屏障完整性的喪失，但低pH 值不會影響TEER，當(dāng)其有機酸濃度下降時，對屏障完整性有積極影響[57]。Raffaella 等[14]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵馬齒莧汁能明顯降低促炎介質(zhì)和活性氧的含量，還能抵消炎癥刺激對Caco-2 細胞的破壞。

3.4 其它功能特性

除以上功能外，益生菌發(fā)酵果蔬汁還能去除抗?fàn)I養(yǎng)因子如植酸[58]（見圖3）、皂苷、氰化物等，有利于礦物質(zhì)和維生素的保存。據(jù)報道，乳酸發(fā)酵胡蘿卜、甜菜根和甘薯提高了鐵的生物利用度；植物乳桿菌CCFM8610 在果蔬汁中對鎘具有很好的吸附能力[59]；還能提高食物的消化率，降低血清膽固醇等。

圖3 發(fā)酵過程中植酸鹽的酶促降解[58]Fig.3 Enzymatic degradation of phytate during fermentation[58]

4 問題與展望

發(fā)酵果蔬汁盡管對人體具有諸多益處，但益生菌在貨架期的穩(wěn)定性及飲用后在人體胃腸道的存活能否達到健康標(biāo)準(zhǔn)是學(xué)者們的研究熱點。為了使宿主受益，益生菌必須在加工、儲存和消化道等惡劣環(huán)境中保持一定的活性[5]。

第一種解決方案是微膠囊技術(shù)。微膠囊是將菌體包埋在包材中而微囊化，保證在生產(chǎn)和貯藏過程中的高活菌數(shù)，并在胃腸環(huán)境中獲得一定的抵御胃酸、膽汁、消化酶的能力，最后能以很高的活菌數(shù)定殖于腸黏膜發(fā)揮作用。Dimitrovski 等[60]將乳酸菌包埋在海藻酸鈣中用來發(fā)酵蘋果汁使其在貯藏期間穩(wěn)定性有所提高。Diego 等[61]將果汁和益生菌進行噴霧干燥，為獲得更高的益生菌存活率添加了不同類型和組合的壁材對其微膠囊化，結(jié)果顯示麥芽糊精和菊粉比例為1∶1 時效果最好，具有更高的酚類和花青素保留率，對ABTS 和DPPH 自由基的活性也更高。

第二種解決方案是固定化。Mantzourani 等[62]用小麥麩皮來固定化副干酪乳桿菌K5 細胞，以山茱萸為發(fā)酵原料，制備了一種新型的具有共生潛力的飲料。Roberts 等[5]選用果膠來固定化細胞，因為其對化學(xué)試劑敏感性較低，對胃腸環(huán)境有抵抗力，有利于益生菌在胃腸條件下的生存。Fijalkowski等[63]利用葡萄球菌產(chǎn)的細菌纖維素作為載體來支持固定化益生菌，為益生菌的存活提供了一個新的思路。

除穩(wěn)定性外，我國的益生菌發(fā)酵果蔬汁關(guān)鍵技術(shù)研究還存在諸多問題。首先，益生菌發(fā)酵果蔬汁飲料目前處于實驗室研究階段，所用益生菌多為牛奶發(fā)酵菌株，但由于其利用果蔬產(chǎn)酸的能力有限且耐酸性差，因此開發(fā)出具有優(yōu)良發(fā)酵性能的果蔬發(fā)酵專用菌株并用于發(fā)酵果蔬汁飲料是該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。

其次，盡管近年來國內(nèi)外對果蔬發(fā)酵益生菌的分離鑒定和一般生物學(xué)特性做了不少研究，但其中是否還存在具有開發(fā)潛力的益生菌菌株以及如何將其應(yīng)用于發(fā)酵果蔬的生產(chǎn)，是亟待開展的研究課題。在果蔬發(fā)酵專用菌的篩選方面，應(yīng)逐步將高效篩選技術(shù)與科學(xué)的體內(nèi)功能性評價體系相結(jié)合，選育既有優(yōu)良果蔬發(fā)酵特性又有利于人體腸道微生態(tài)平衡的功能性果蔬發(fā)酵專用益生菌株。最后，要提高發(fā)酵果蔬制品的穩(wěn)定性，加快功能型益生菌發(fā)酵果蔬食品的研發(fā)，大力推進益生菌發(fā)酵果蔬制品的產(chǎn)業(yè)化。