張 娟 史文嬌* 韓雪林 張 磊 李蘇濤,2 馮啟賢 李 妍,2 陽伏林* 周 晶

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，福州 350002)

圓葉決明是一種生長于熱帶地區(qū)的多年生豆科決明屬植物[1]，起源自北美洲、中美洲和南美洲北部[2]，適應(yīng)性極強，具有耐高溫、耐酸、耐旱、耐貧瘠等生理特征[3]。圓葉決明是我國亞熱帶地區(qū)為數(shù)不多的豆科牧草之一，其粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)含量高(初花期可達15%)，且無毒無異味，適口性較好，因此具備成為反芻動物優(yōu)質(zhì)牧草的潛質(zhì)。近年來，為了加快圓葉決明在廣東、福建等區(qū)域的應(yīng)用推廣，科研人員主要針對其品種繁育與生理生態(tài)特征開展了較多工作[4]。圓葉決明生長具有明顯的季節(jié)性，夏季生長茂盛，冬季枯黃，生物量低，無法滿足畜禽對全年優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)牧草的需求。因此，在實際牧草生產(chǎn)過程中，常用的做法是在牧草生產(chǎn)盛期對其進行刈割加工處理，以實現(xiàn)飼草料全年供求平衡。然而，我國南方地區(qū)多雨、潮濕，干草制備不易實現(xiàn)。所以，開展青貯技術(shù)的開發(fā)和利用研究有較好前景。研究表明，在青貯過程中，微生物變化是導(dǎo)致發(fā)酵飼料腐敗變質(zhì)的主要原因之一。因此，為更好預(yù)防青貯飼料的腐敗變質(zhì)，本試驗通過高通量測序方法鑒定青貯后不同處理之間微生物群落變化，相較于傳統(tǒng)的測定方法，該方法能夠更系統(tǒng)準(zhǔn)確鑒定物種多樣性和豐富度，從微觀角度分析青貯后微生物群落變化。

蘋果酸作為一種良好的新型青貯飼料添加劑，具有較強的抗氧化作用，可快速降低pH，減少蛋白質(zhì)水解，加速乳酸菌的生長，抑制酵母菌和霉菌的生長[5-6]，提高微生物氮產(chǎn)量，減少甲烷產(chǎn)量，提高飼料的利用率[7]。由于青貯原料表面乳酸菌含量較少，自然發(fā)酵較難，因此采用添加青貯飼料添加劑的方法來改善青貯飼料品質(zhì)。目前，國內(nèi)外青貯飼料添加劑主要采用乳酸菌，它可通過增強乳酸菌活動提高青貯原料中優(yōu)勢菌群相對豐度，降低pH，加速發(fā)酵，抑制有害菌增殖，從而提高青貯品質(zhì)[8-9]。目前，添加蘋果酸和乳酸菌對各類青貯原料的效果不一，其對圓葉決明青貯方面的研究尚未見報道。因此，本試驗旨在探究蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯品質(zhì)的影響，并結(jié)合高通量測序解析青貯后微生物群落變化，為后續(xù)圓葉決明作為青貯飼料在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

圓葉決明于2020年9月采自福建省漳州市漳浦縣萬安牧場種植區(qū)，距離地面8～10 cm處進行刈割。圓葉決明原料營養(yǎng)品質(zhì)見表1。蘋果酸(純度≥99.0%)購自某生物科技有限公司，嗜酸乳桿菌(活菌數(shù)≥5×1010CFU/g)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

表1 圓葉決明原料營養(yǎng)品質(zhì)(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Nutritional quality of raw materials of Chamaecrista rotundifolia (DM basis) %

1.2 試驗設(shè)計

本課題組經(jīng)前期預(yù)試驗結(jié)果，得到圓葉決明青貯中蘋果酸適宜添加比例為1%(鮮重)。試驗設(shè)置對照組(CK組，無添加)、嗜酸乳桿菌組(試驗Ⅰ組，添加1×106CFU/g嗜酸乳桿菌)、蘋果酸組(試驗Ⅱ組，添加1%蘋果酸)、蘋果酸和嗜酸乳桿菌組(試驗Ⅲ組，添加1%蘋果+1×106CFU/g嗜酸乳桿菌)，每組3個重復(fù)，添加量均以鮮重為基礎(chǔ)，各組均勻噴灑10 mL配制好的添加劑與無菌水混合液。

1.3 青貯制作

將刈割的圓葉決明進行晾曬至干物質(zhì)(dry matter，DM)含量25%左右，使用鍘刀切至1～2 cm小段，然后將不同添加處理的蘋果酸和嗜酸乳桿菌均勻噴灑至晾曬后的圓葉決明，之后進行裝袋，每袋400 g，混合均勻，每組3個重復(fù)，使用真空密封機進行壓實抽氣。室溫儲存，青貯60 d拆封，取樣分析。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 營養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵特性

取200 g具有代表性的樣品，于65 ℃烘箱中烘干72 h，測定DM含量，將干燥樣粉碎過篩，測定基本營養(yǎng)指標(biāo)。CP含量采用KDN-103F自動定氮儀測定，中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量采用范式纖維法測定[10]，水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法測定[11]。

取10 g具有代表性的樣品，加入90 mL純水于4 ℃冰箱浸提24 h，經(jīng)4層紗布過濾得到浸提液，即時測定pH，剩余樣品分裝保存用于氨態(tài)氮(NH3-N)和有機酸含量的測定。氨態(tài)氮含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[12]，有機酸中乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)含量采用高效液相儀(CT0-10AS，日本島津公司)測定[13-14]。

1.4.2 微生物多樣性測定

1.5 數(shù)據(jù)分析

基礎(chǔ)數(shù)據(jù)利用Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)分析并繪制圖表，利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并采用Duncan氏法對數(shù)據(jù)進行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯營養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表2可知，與CK組相比，各試驗組DM和CP含量顯著升高(P<0.05)，但各試驗組之間無顯著差異(P>0.05)。與CK組相比，各試驗組NDF含量顯著降低(P<0.05)；其中，試驗Ⅱ組NDF含量顯著低于試驗Ⅰ和Ⅲ組(P<0.05)，試驗Ⅲ組NDF含量顯著低于試驗Ⅰ組(P<0.05)。與CK組相比，試驗Ⅱ和Ⅲ組ADF含量顯著降低(P<0.05)。與CK組相比，試驗Ⅲ組WSC含量顯著升高(P<0.05)，而試驗Ⅰ組WSC含量顯著降低(P<0.05)。

表2 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對葉決明青貯營養(yǎng)品質(zhì)的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on nutritional quality of Chamaecrista rotundifolia silage (DM basis) %

2.2 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯發(fā)酵特性的影響

由表3可知，與CK組相比，各試驗組pH顯著降低(P<0.05)；其中，試驗Ⅱ和Ⅲ組pH顯著低于試驗Ⅰ組(P<0.05)。與CK組相比，試驗Ⅱ和Ⅲ組氨態(tài)氮含量顯著降低(P<0.05)；其中，試驗Ⅲ組氨態(tài)氮含量顯著低于試驗Ⅱ組(P<0.05)。與CK組相比，各試驗組LA含量顯著增加(P<0.05)，但試驗組之間無顯著差異(P>0.05)。與CK組相比，試驗Ⅱ和Ⅲ組AA含量顯著降低(P<0.05)。與CK組相比，各試驗組PA含量顯著降低(P<0.05)；其中，試驗Ⅱ組PA含量顯著低于試驗Ⅰ和Ⅲ組(P<0.05)。

表3 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯發(fā)酵特性的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 3 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on fermentation characteristics of Chamaecrista rotundifolia silage (DM basis)

2.3 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯微生物多樣性的影響

2.3.1 OTU分析

以97%的一致性進行OTU聚類，4組共得到1 919個不同的OTU。由圖1可知，與CK組相比，各試驗組OTU數(shù)量明顯增加，4組OTU數(shù)量依次為試驗Ⅲ組>試驗Ⅰ組>試驗Ⅱ組>CK組。其中，4組中核心OTU數(shù)量為151個，CK組及試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組特有OTU數(shù)量分別為51、150、112、248個。

CK：對照組 control group；Ⅰ： Ⅰ組 group Ⅰ；Ⅱ：group Ⅱ； Ⅲ：group Ⅲ。下圖同 the same as below。圖1 青貯后微生物OTU分布Venn圖Fig.1 Venn diagram of microbial OTU distribution after silage

稀釋曲線能夠反映測序數(shù)據(jù)量的合理性及樣品的物種豐富度[15]。由圖2可知，樣本測序數(shù)據(jù)量為40 120個，隨著測序數(shù)據(jù)量的增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明本次測序結(jié)果較為合理。

圖2 各組稀釋曲線Fig.2 Dilution curves of each group

2.3.2 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯微生物α多樣性的影響

α多樣性分析包含群落物種多樣性和豐富度的分析，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)用于估計群落樣本中包含的物種總數(shù)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用來描述群落多樣性(物種豐富度和均勻度)。由表4可知，與CK組相比，試驗Ⅲ組Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)顯著增加(P<0.05)；其中，試驗Ⅲ組Shannon指數(shù)顯著高于試驗Ⅰ和Ⅱ組(P<0.05)，試驗Ⅲ組ACE指數(shù)顯著高于試驗Ⅰ組(P<0.05)。

表4 各組α多樣性分析Table 4 Alpha diversity analysis of each groups

2.3.3 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯門水平微生物群落組成的影響

由圖3和表5可知，各組圓葉決明青貯門水平微生物群落組成無明顯差異，其中CK組優(yōu)勢菌門主要為厚壁菌門(Firmicutes，73.20%)、變形菌門(Proteobacteria，23.45%)，兩者總相對豐度達96.65%。與試驗Ⅰ組相比，試驗Ⅱ和Ⅲ組厚壁菌門相對豐度顯著下降(P<0.05)。與CK和試驗Ⅰ組相比，試驗Ⅱ和Ⅲ組藍藻菌門(Cyanobacteria)相對豐度顯著增加(P<0.05)；其中，試驗Ⅱ組藍藻菌門相對豐度顯著高于試驗Ⅲ組(P<0.05)。與CK組相比，試驗Ⅲ組擬桿菌門(Bacteroidota)相對豐度顯著增加(P<0.05)。

Firmicutes：厚壁菌門；Cyanobacteria：藍藻菌門；Proteobacteria：變形菌門；Actinobacteriota：放線菌門；Bacteroidota：擬桿菌門；Halanaerobiaeota：鹽厭氧菌門；Campilobacterota：彎曲桿菌門；unidentified_Bacteria：不明細(xì)菌；Deinococcota：脫氨基可卡因菌門；Acidobacteriota：酸桿菌門；Others：其他。圖3 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯門水平微生物群落組成的影響Fig.3 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on microbial community composition at phylum level of Chamaecrista rotundifolia silage

表5 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯優(yōu)勢菌門相對豐度的影響Table 5 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on dominant bacterial phyla relative abundance of Chamaecrista rotundifolia silage %

2.3.4 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯屬水平微生物群落組成的影響

由圖4和表6可知，各組圓葉決明青貯屬水平優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium_sensu_stricto_12)、腸桿菌屬(Enterobacter)等。與CK組相比，試驗Ⅰ和Ⅱ組乳桿菌屬相對豐度顯著增加(P<0.05)；其中，試驗Ⅰ組乳桿菌屬相對豐度顯著高于試驗Ⅱ和Ⅲ組(P<0.05)。與CK組相比，各試驗組梭狀芽孢桿菌屬、果膠桿菌屬(Pectobacterium)相對豐度顯著降低(P<0.05)。與CK組相比，試驗Ⅱ和Ⅲ組未被定義葉綠體(unidentified_chloroplast)相對豐度顯著增加(P<0.05)；其中，試驗Ⅱ組未被定義葉綠體相對豐度顯著高于試驗Ⅲ組(P<0.05)。與CK組相比，試驗Ⅲ組普氏梭菌屬(Faecalibacterium)相對豐度顯著增加(P<0.05)。

Lactobacillus：乳桿菌屬；Clostridium_sensu_stricto_12：梭狀芽孢桿菌屬；unidentified_chloroplast：未被定義葉綠體；Enterobacter：腸桿菌屬；Ochrobactrum：蒼白桿菌屬；Methylobacterium-Methylorubrum：甲基桿菌屬；Faecalibacterium：普氏梭菌屬；Pectobacterium：果膠桿菌屬；Weissella：魏斯氏菌屬；Others：其他。圖4 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯屬水平微生物群落組成的影響Fig.4 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on microbial community composition at genus level of Chamaecrista rotundifolia silage

表6 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯優(yōu)勢菌屬相對豐度的影響Table 6 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on dominant bacterial genus relative abundance of Chamaecrista rotundifolia silage %

2.3.5 各組之間圓葉決明青貯微生物群落的差異物種

由圖5可知，通過LEfSe分析(線性判別分析分?jǐn)?shù)>4)對圓葉決明青貯微生物群落的差異物種進行分析，4組中共找到27個相對豐度差異的物種。門水平差異物種為試驗Ⅱ中藍藻菌門；屬水平差異物種為試驗Ⅰ中乳桿菌屬，試驗Ⅱ組中未被定義葉綠體，試驗Ⅲ組中山羊葡萄球菌屬(Staphylococcus_caprae)、普拉梭菌屬(Faecalibacterium_prausnitzii)和殼聚糖酶產(chǎn)生菌屬(Mitsuaria)。CK組在門水平和屬水平均無差異物種出現(xiàn)。

Lachnospirales：無色螺旋菌目；Lachnospiraceae：螺旋藻科；Rhizobiaceae：根瘤菌科；Staphylococcus_caprae：山羊葡萄球菌屬；Oscillospirales：示波螺旋目；Mitsuaria：殼聚糖酶產(chǎn)生菌屬；Mitsuaria：松江菌屬；Ruminococcaceae：瘤胃球菌科；Faecalibacterium_prausnitzii：普拉梭菌屬；Staphylococcus：葡萄球菌；Lactobacillus_pantheris：混合乳酸桿菌；unidentified_chloroplast：未被定義葉綠體；Chloroplast：葉綠體；Cyanobacteria：藍藻菌門； Bacilli：桿菌綱；Lactobacillales：乳桿菌目；Lactobacillus：乳桿菌屬；Lactobacillus_rhamnosus：鼠李糖乳桿菌；Lactobacillus_zymae：乳酸桿菌；Clostridia：梭狀芽胞桿菌；Lactobacillus_dextrinicus：乳酸桿菌屬。圖5 各組之間圓葉決明青貯微生物群落的差異物種Fig.5 Different species of Chamaecrista rotundifolia microbial community silage among all groups

3 討 論

3.1 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯營養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵特性的影響

本試驗通過添加蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明進行青貯處理，主要目的是通過快速降低pH，抑制CP降解，提高圓葉決明青貯飼料品質(zhì)。pH的快速降低可抑制有害菌活性，防止蛋白質(zhì)降解。本試驗結(jié)果顯示，所有添加劑處理的青貯飼料pH顯著降低，表明該添加劑均能有效改善圓葉決明青貯品質(zhì)，這一結(jié)論與Ke等[16]研究結(jié)果一致。有機酸、氨態(tài)氮是判定青貯飼料品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)，是乳酸菌與有害菌競爭的代謝產(chǎn)物。AA、PA在提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性方面均具有良好的效果[17]，AA具有很好的抑菌作用，可有效抑制開窖后腐敗菌的繁殖[18]；PA可抑制好氧菌、酵母菌及梭菌增殖[19]，從而減少營養(yǎng)物質(zhì)的降解，保障青貯飼料品質(zhì)。本試驗中，試驗Ⅱ和Ⅲ組AA、PA含量顯著低于CK組，可能是因為pH的快速降低抑制有害菌增殖，發(fā)酵過程以同型發(fā)酵為主[20]，并且隨著青貯的持續(xù)發(fā)酵，乳酸菌含量不斷積累，蘋果酸同時會向LA轉(zhuǎn)變[21]，因此這也導(dǎo)致添加試驗Ⅱ組LA含量顯著升高，AA含量顯著下降。有機酸的添加會使秸稈軟化濕潤，纖維結(jié)構(gòu)松散，有利于NDF和ADF含量的降低[22]。本試驗中，試驗Ⅱ和Ⅲ組NDF和ADF含量顯著低于CK組，表明添加蘋果酸具有降低NDF和ADF含量的效果；而與試驗Ⅱ組相比，試驗Ⅲ組NDF和ADF含量均升高，表明混合添加蘋果酸和乳桿菌對降低圓葉決明青貯纖維含量有抑制作用。李孟偉等[23]在研究蘋果酸對反芻動物生長性能和瘤胃發(fā)酵的影響中發(fā)現(xiàn)，蘋果酸作為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，可有效提高CP含量和木質(zhì)纖維素的表觀消化率，減少青貯飼料氨態(tài)氮的產(chǎn)生。本試驗中，試驗Ⅱ組氨態(tài)氮含量顯著低于CK組，與上述結(jié)果一致；試驗Ⅱ和Ⅲ組DM、CP、WSC含量顯著升高。這說明添加蘋果酸和嗜酸乳桿菌可減少DM損失，抑制蛋白質(zhì)水解，原因可能是蘋果酸為整個青貯過程提供了更多的發(fā)酵底物[24]；嗜酸乳桿菌能夠加快發(fā)酵進程，抑制有害菌活性，減少底物損耗，從而保證青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。但本試驗中，與CK組相比，試驗Ⅰ組WSC含量顯著減少，可能是添加嗜酸乳桿菌加大了對發(fā)酵底物的需求，從而使青貯飼料的WSC含量顯著降低。

3.2 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯微生物多樣性的影響

青貯是一個微生物群落演變的過程，主要是有益菌逐漸主導(dǎo)，抑制有害菌群生長的過程[25]。α多樣性主要反映微生物群落物種豐富度、多樣性及測序深度，主要通過Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)來評價物種的豐富度，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來評價物種的多樣性。李莉等[26]在研究象草中添加纖維素酶和淀粉青貯30 d后發(fā)現(xiàn)，添加纖維素酶和淀粉組Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于對照組。本試驗中，試驗Ⅲ組OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)均高于CK組，表明試驗Ⅲ組物種多樣性和豐富度較高；但在本試驗中，試驗Ⅰ組Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)低于CK組，ACE指數(shù)高于CK組，表明添加嗜酸乳桿菌有益于圓葉決明青貯乳酸桿菌增殖，抑制有害菌增殖。

本試驗通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，圓葉決明青貯后門水平優(yōu)勢菌群為厚壁菌門和變形菌門，其次為藍藻菌門，與He等[27]研究結(jié)果一致。厚壁菌門是革蘭氏陽性菌，主要包括產(chǎn)芽孢、非產(chǎn)芽孢和支原體菌群，可降解大分子物質(zhì)，如纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)等[28]，厚壁菌門和變形菌門可同時降解纖維類物質(zhì)，為微生物活動提供更多底物[29]。變形菌門是一類革蘭氏陰性菌，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等[30]，可與乳酸菌競爭底物，且會導(dǎo)致CP含量下降和氨態(tài)氮含量的升高。擬桿菌門可做為糖、淀粉等非纖維性碳水化合物的主要分解者[31]，可有效改善動物腸道微生物環(huán)境。藍藻菌門作為熱帶牧草的主要微生物，在發(fā)酵過程中通常會被乳桿菌屬和腸桿菌屬所代替[32]。

通過進一步分析圓葉決明青貯后微生物群落變化，結(jié)果表明，各組微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，各組優(yōu)勢菌屬均為乳桿菌屬，但經(jīng)屬水平物種注釋及LEfSe分析，試驗Ⅰ組乳桿菌屬相對豐度高達87.05%，顯著高于CK組。乳桿菌屬是厚壁菌門的一種菌屬，在青貯過程中能產(chǎn)生LA，快速降低pH[33]，同時會抑制有害菌的滋生，進而減少CP、WSC含量的降解。Yang等[34]研究結(jié)果表明青貯飼料中LA含量與乳桿菌屬相對豐度呈正相關(guān)。本試驗中，試驗Ⅱ和Ⅲ組LA含量顯著高于CK組，且試驗Ⅱ和Ⅲ組乳桿菌屬相對豐度顯著低于試驗Ⅰ組，這可能是由于添加的蘋果酸導(dǎo)致較強的酸性環(huán)境反而抑制乳酸菌的活性[35]，從而使得乳桿菌屬相對豐度顯著降低；且通過α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，試驗Ⅰ組的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)較低，表示該組微生物多樣性較低，因此添加嗜酸乳桿菌使得乳酸菌能夠快速主導(dǎo)整個發(fā)酵過程，從而抑制有害菌的增殖，當(dāng)乳桿菌屬成為優(yōu)勢菌群時，微生物多樣性呈下降狀態(tài)[36]。研究表明，梭狀芽孢桿菌屬、腸桿菌屬均可利用青貯飼料的LA和WSC，產(chǎn)生丁酸[37-38]，阻止乳酸菌生長，且可通過氧化還原反應(yīng)導(dǎo)致青貯飼料的腐敗變質(zhì)[39]。腸桿菌屬的存在可能會消耗底物產(chǎn)生氨態(tài)氮，同時促進青貯飼料蛋白質(zhì)的降解，破壞青貯飼料的營養(yǎng)成分，這也可能是導(dǎo)致試驗組氨態(tài)氮含量較低的主要原因。本試驗中，各試驗組LA含量顯著增加，梭狀芽孢桿菌屬和腸桿菌屬相對豐度降低，說明各試驗組通過發(fā)酵產(chǎn)生的LA足以將pH降低至抑制腸桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬增殖的水平，使其有助于提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)；試驗Ⅱ和Ⅲ組較低的AA含量可能是試驗組較低的腸桿菌屬相對豐度抑制了將LA轉(zhuǎn)變?yōu)锳A的過程[40]，因此導(dǎo)致試驗Ⅱ和Ⅲ組AA含量顯著降低。此外，通過LEfSe分析，顯示試驗Ⅲ組中屬水平差異物種為普拉梭菌屬。研究表明，普拉梭菌屬是糞桿菌屬種的唯一種屬，其自身有助于丁酸鹽的產(chǎn)生[41]，在生產(chǎn)中丁酸多以丁酸鹽和丁酸甘油酯的形式存在，較高含量的丁酸會促進有害微生物分解蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)，因此較高的普拉梭菌屬相對豐度會降低青貯飼料品質(zhì)。

4 結(jié) 論

蘋果酸和嗜酸乳桿菌均能有效改善圓葉決明青貯營養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵特性，具體表現(xiàn)在DM、CP和LA含量升高，氨態(tài)氮含量下降；并且能夠改善圓葉決明青貯微生物的結(jié)構(gòu)和組成，具體表現(xiàn)在乳桿菌屬相對豐度增加，變形菌門、梭狀芽孢桿菌屬、腸桿菌屬相對豐度降低。本試驗條件下，以單獨添加嗜酸乳桿菌青貯效果較好。

致謝：

感謝福建農(nóng)林大學(xué)莊益芬教授在青貯試驗過程中的指導(dǎo)；感謝福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳鑫珠、黃秀聲、楊有泉等老師在試驗材料與試驗菌株獲取方面的幫助。