林萬華，劉 翠，張 文，林 昊，王珍珍

（1.廣東容大生物股份有限公司 511517；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 510640；3.清遠一生自然生物研究院有限公司 511517）

七清敗毒顆粒是中獸藥經(jīng)典處方，由黃芩、虎杖、白頭翁、苦參、板藍根、綿馬貫眾、大青葉七味中藥材組成，具有清熱解毒，燥濕止瀉的功效[1-2]，對畜禽多種細菌、病毒性疾病具有較好的防治效果，如白痢、感冒、傳染性支氣管炎等。本中藥配伍中黃芩和虎杖的象征成分為黃芩苷和虎杖苷；因此，鑒定黃芩苷和虎杖苷成分作為七清敗毒顆粒顆粒質(zhì)量判定依據(jù)?！吨袊F藥典》2015版二部對七清敗毒顆粒質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)是采用薄層色譜法，分別檢測其中是否含有黃芩苷、虎杖苷等成分[1][3]，此鑒別方法較繁瑣，并未對黃芩苷和虎杖苷做含量測定。為科學(xué)準(zhǔn)確評價七清敗毒顆粒質(zhì)量，本試驗采用HPLC法對七清敗毒顆粒中黃芩苷和虎杖苷含量同時測定的方法進行了研究。

1 儀器與材料

日本島津LC-20A高效液相色譜儀；超純水儀UPK-5T；超聲波儀；梅特勒—托利多天平MS105DU；黃芩苷對照品：Z0271109，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；虎杖苷對照品：111575-201603，中國食品藥品檢定研究院；樣品：七清敗毒顆粒2012003，廣東容大生物股份有限公司；試劑：甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為分析用純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相：乙腈-水-磷酸（25∶75∶0.1），色譜柱：島津C18 5u 4.6×250mm，檢測波長：315nm，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，進樣量：20μL

2.2 對照品溶液的配制

2.2.1 稀釋液：甲醇

2.2.2 黃芩苷對照品儲備液：精密稱取黃芩苷對照品10.0mg，置25mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，作為黃芩苷對照品儲備液。

2.2.3 虎杖苷對照品儲備液：精密稱取虎杖苷對照品10.0mg，置25mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，作為虎杖苷對照品儲備液。

2.2.4 混合對照品溶液：取上述1.3.2項下的對照品儲備液5.0mL及1.3.3項下對照品儲備液1.0mL到50mL容量瓶中，加稀釋液定容，搖勻，制成含黃芩苷40μg/mL、虎杖苷8μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 樣品溶液的配制

取七清敗毒顆粒適量，研細，置100mL棕色量瓶中，加甲醇40mL，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗

2.4.1 黃芩苷、虎杖苷系統(tǒng)適用性

取上述1.3.4項下的混合對照品溶液20μL按1. 2色譜條件下進樣，測定并計算柱效、分離度和拖尾因子（具體數(shù)據(jù)見表1）。

表1 黃芩苷、虎杖苷系統(tǒng)適用性試驗測定結(jié)果

2.5 線性實驗

2.5.1 黃芩苷、虎杖苷線性實驗

取上述1.3.2項黃芩苷對照品儲備溶液及1.3.3虎杖苷對照品儲備液分別稀釋成含黃芩苷5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、40.00μg/mL、100.00μg/mL，虎 杖 苷1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、8.00μg/mL、20.00μg/mL的系列混合對照品溶液，按1.2色譜條件測定，以峰面積對濃度進行線性比較，黃芩苷峰面積的回歸方程為：Y＝54836X-115539（R2＝0.9997），說明黃芩苷在5～100μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（具體見圖1），虎杖苷峰面積的回歸方程為：Y＝109836X-11176（R2＝0.9999），說明虎杖苷在1～20μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（具體見圖2）。

圖1 黃芩苷線性范圍數(shù)據(jù)圖

圖2 虎杖苷線性范圍數(shù)據(jù)圖

2.5.2 黃芩苷、虎杖苷測定線性色譜圖

圖3 黃芩苷、虎杖苷測定線性液相色譜圖

2.6 重復(fù)性試驗

2.6.1 黃芩苷、虎杖苷重復(fù)性試驗

精密吸取1.3.4混合對照品溶液適量，按1. 2項色譜條件測定，進樣5次，獲得黃芩苷峰面積的RSD為0.1%，虎杖苷峰面積的RSD為0.09%，表明該色譜條件對黃芩苷和虎杖苷檢測的重復(fù)性良好。具體見表2。

表2 黃芩苷進樣重復(fù)性數(shù)據(jù)

2.7 回收率試驗

2.7.1 黃芩苷、虎杖苷回收率試驗

精密取已知黃芩苷含量（6.5mg/mL）、虎杖苷含量（0.78mg/mL）的同一批樣品約0.50g（共9份）置于100mL容量瓶中，分別加入上述1.3.2項下的對照品儲備液4.0mL、5.0mL、6.0mL及1.3.3項下對照品儲備液0.8mL、1.0mL、1.2mL，按上述1.4項要求處理，進樣測定。測定并計算黃芩苷的平均回收率為99.9% ，虎杖苷的平均回收率為100.06%。具體見表3、表4。

表3 黃芩苷回收率試驗數(shù)據(jù)

表4 虎杖苷回收率試驗數(shù)據(jù)

2.8 混合對照品溶液的測定

取上述1.3.4項下的黃芩苷、虎杖苷混合對照品溶液，按1.2色譜條件下進樣，測得黃芩苷、虎杖苷混合對照品色譜圖譜如下（圖4）。

圖4 黃芩苷、虎杖苷液相色譜圖

2.9 供試品的測定

取3批七清敗毒顆粒樣品及對照品溶液，按外標(biāo)法測定，每批樣品進樣2次，計算樣品中黃芩苷、虎杖苷含量（圖譜見圖5）。3批七清敗毒顆粒樣品的含量測定結(jié)果分別為黃芩苷6.51mg/g、6.50mg/g、6.51mg/g，虎杖苷0.78 mg/g、0.78mg/g、0.79mg/g。

圖5 七清敗毒顆粒樣品的液相色譜圖

3 討論

3.1黃芩藥材中的黃芩苷含量測定液相條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（C18色譜柱），以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動相；檢測波長為280nm；虎杖藥材中虎杖苷含量測定液相條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（23∶77）為流動相；檢測波長為306nm[1]。黃芩苷在波長為280nm、316nm處有最大吸收，虎杖苷在217nm、306nm、314nm處有最大吸收。從藥典中可以明確，黃芩苷的含量測定采用280nm作為檢測波長，而虎杖苷則選擇了306nm作為檢測波長。本方法參考了藥典檢測條件，選擇了315nm波長兼顧兩個被測成分在314nm～316nm中有最大吸收，以保證檢測的最大靈敏度。

3.2 在流動相確立方面，參考了中國獸藥典黃芩苷、虎杖苷檢測的色譜條件，結(jié)合侯麗麗[2]、黃良永[5]等方法研究結(jié)果，確立了高效液相色譜法同時測定七清敗毒顆粒中黃芩苷、虎杖苷含量的方法：乙腈—水—磷酸（25∶75∶0.1），色譜柱：島津C18 5u 4.6×250mm，檢測波長：315nm，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，進樣量：20μL；其中在流動相中增加0.1%的磷酸，起到適當(dāng)調(diào)節(jié)流動相的pH改變色譜峰型作用。

3.3為避免黃芩苷與虎杖苷兩個物質(zhì)的檢測響應(yīng)值相互影響，特做了兩個標(biāo)準(zhǔn)品的濃度檢測嘗試，最終確立黃芩苷在濃度為 5～100μg/mL，虎杖苷在濃度為 1～20μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測峰相應(yīng)值大小相當(dāng)，積分條件統(tǒng)一。該方法具有線性范圍寬、分析時間短、樣品前處理簡便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點，為其質(zhì)量判定提供了更科學(xué)的依據(jù)。