李宇霄，李潤橋，付思慧，王嘉麟

腦卒中是指急性起病的以局灶性神經(jīng)功能缺損為共同特點的腦血管疾病，分為腦出血和腦梗死，其高發(fā)率、高殘疾率、高死亡率已成為全球性公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計，我國每年新發(fā)腦卒中病人約 200萬人，并以每年8.7%的速度增長[1]。研究指出，約有75%的腦卒中病人存在不同程度的殘疾，其中重度殘疾約占40%[2]。在諸多腦卒中后遺癥中，偏癱病人數(shù)位居前列，其中，80%的病人為痙攣性偏癱，痙攣性偏癱一般出現(xiàn)在發(fā)病3周后，主要由于腦卒中后神經(jīng)元受損，高級中樞對低級中樞的控制力減弱，導(dǎo)致肢體活動時阻力增加，協(xié)調(diào)性不佳，出現(xiàn)以痙攣為基礎(chǔ)的異常運動模式[3]。臨床主要表現(xiàn)為運動模式異常且粗大、腱反射亢進、肌張力增高等，并形成“偏癱步態(tài)”，即患肩壓低，上肢屈肌呈“挎籃子狀”，患肢抬高、下肢伸肌式呈“劃圈狀”[4]。痙攣性偏癱會引起患肢疼痛、關(guān)節(jié)攣縮甚至完全喪失肢體功能和自理能力，其治療費用比沒有腦卒中后痙攣狀態(tài)病人高出近4倍[5]。

目前，治療痙攣性偏癱主要是緩解肌肉痙攣，方法有口服、鞘內(nèi)注射、局部注射肌肉松弛劑、現(xiàn)代康復(fù)訓(xùn)練、外科手術(shù)等，存在療程長、療效差、費用昂貴、不良反應(yīng)多等缺點。一項系統(tǒng)評價分析結(jié)果顯示，采用芍藥甘草湯治療腦卒中后肢體痙攣，可以提高病人肢體運動功能，改善日常生活能力，顯著提高臨床有效率[6]。相關(guān)動物實驗證明，芍藥甘草湯可以緩解肢體痙攣、減輕神經(jīng)損傷[7-8]。芍藥甘草湯出自《傷寒論》，原文指出：“傷寒脈浮，自汗出，小便數(shù)，微惡寒，腳攣急……若厥愈、足溫者，更作芍藥甘草湯與之，其腳即伸?！狈街邪咨治犊?、酸，養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛；甘草味甘，補中益氣、緩急止痛，二者等量合用，酸甘化陰，養(yǎng)血平肝，緩解筋脈拘急，善治氣血虧虛型痙攣性疼痛，在《朱氏經(jīng)驗集》中有“去杖湯”的美稱。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)、分子對接預(yù)測分析芍藥甘草湯治療腦梗死后痙攣性偏癱的藥效成分和相關(guān)靶點，探討其作用機制，為后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物有效化學(xué)成分篩選及靶點獲取 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database，TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)檢索芍藥甘草湯藥物名稱(白芍、甘草)的有效化學(xué)成分，篩選條件為口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18。采用DurgBank(https://www.drugbank.ca/)、Uniprot(https://www.UniProt.org/)數(shù)據(jù)庫獲取藥物靶點。

1.2 疾病靶點和藥物-疾病共有靶點的獲取 采用基因名片數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)與OMIM-NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)數(shù)據(jù)庫提取疾病靶點。應(yīng)用R軟件中的Draw Venn Diagrams工具對提取到的藥物靶點與疾病靶點進行處理，獲得共有靶點。

1.3 藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 應(yīng)用 Cytoscape 3.7.1軟件，將藥物有效化學(xué)成分、藥物-疾病共有靶點導(dǎo)入，構(gòu)建藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 芍藥甘草湯治療缺血性腦卒中后痙攣性偏癱的核心靶蛋白相互作用(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用Bisogenet插件進行PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，應(yīng)用Cyto NCA插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，得出核心靶蛋白。

1.5 基因本體(GO)、京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 基于GO數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology，http://geneontology.org)對共有靶點進行生物學(xué)過程(BP)、分子功能(MF)、細胞成分(CC)分析，將結(jié)果按q值大小進行降序排列，繪制GO功能分析圖；基于KEGG通路數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，https://www.kegg.jp)對共有靶點發(fā)生作用的信號通路進行分析，將結(jié)果按P值大小進行降序排列，繪制KEGG通路富集分析圖。

1.6 成分-靶點-通路互作圖的構(gòu)建 篩選與疾病相關(guān)性強的信號通路，應(yīng)用 Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建成分-靶點-通路互作圖。

1.7 分子對接 將1.4中篩選得到的核心靶蛋白利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載核心蛋白所對應(yīng)的3D結(jié)構(gòu)，利用有機小分子生物活性(PubChem)數(shù)據(jù)庫中確定活性成分的化合物名稱、分子量和2D結(jié)構(gòu)。利用AutoDock Vina軟件(http://vina.scripps.edu/)對核心蛋白和活性成分進行分子對接，affinity kcal/mol值越低，代表結(jié)合能力越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。并采用Pymol軟件分析和觀察對接結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 藥物化學(xué)成分及靶點 本研究共收集芍藥甘草湯藥有效化學(xué)成分36種，預(yù)測藥物靶點572個，通過 UniProt數(shù)據(jù)庫將所有蛋白名稱轉(zhuǎn)換成基因名稱。芍藥甘草湯中，白芍有效成分13種，預(yù)測靶點984個；甘草有效成分23種，預(yù)測靶點2 507個，各中藥有效成分詳見表1。

表1 中藥有效成分

2.2 疾病靶點的獲取和藥物-疾病共有靶點的提取 在GeneCards與OMIM-NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行檢索，GeneCards數(shù)據(jù)庫設(shè)置條件為Relevance score≥25，將2個數(shù)據(jù)庫中所得的疾病靶點匯總并刪除重復(fù)，通過UniProt數(shù)據(jù)庫將所有蛋白名稱轉(zhuǎn)換成基因名稱，共獲得72個靶點，將其作為處方的候選靶標來源。將獲取的藥物靶點與疾病靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入R軟件，應(yīng)用 Draw Venn Diagrams工具獲得共有靶點41個，繪制韋恩圖。詳見圖1。

圖1 藥物-疾病共有靶點韋恩圖

2.3 構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖 將36種有效化學(xué)成分、41個共有靶點導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.1中，采用Network Analyze插件構(gòu)建藥物成分-靶點作用網(wǎng)絡(luò)，詳見圖2。核心靶蛋白為黃色方形，有效化學(xué)成分為橢圓形，不同顏色表示不同藥物，甘草為藍色，芍藥為紅色。根據(jù)度值得出排名前5位的關(guān)鍵活性成分有山萘酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、刺芒柄花素(formononetin)、刺果甘草查耳酮(glypallichalcone)、shinpterocarpin。由圖可知，芍藥甘草湯治療腦梗死后痙攣性偏癱是通過多成分、多靶點起效的。

圖2 藥物成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將共有靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1的Bisogenet 插件中，初步構(gòu)建共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，詳見圖3；應(yīng)用CytoNCA 插件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行進一步拓撲分析，篩選核心靶點，排名前5位的核心靶點分別是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、半胱氨酸蛋白酶3(CASP3)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶1(SOD1)。

2.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析 在GO數(shù)據(jù)庫和 KEGG 通路數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置條件為P值cutoff=0.05且q值cutoff=0.05，余采用原始設(shè)置。選取排名前30位的項目繪制圖形，詳見圖4、圖 5，橫坐標表示靶點個數(shù)，縱坐標表示生物學(xué)過程，顏色表示q值，顏色越偏紅色代表q值越小，顏色越偏藍代表q值越大。GO功能分析發(fā)現(xiàn)共有靶點主要參與了對營養(yǎng)水平的作用、對脂多糖的作用、突觸膜的固有成分等過程。KEGG通路富集分析提示主要參與腫瘤壞死因子信號通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE)-晚期糖基化產(chǎn)物(RAGE)信號通路、C型凝集素受體信號通路、Toll樣受體信號通路，白細胞介素-17信號通路。應(yīng)用 Cytoscape 3.7.1做可視化處理，構(gòu)建成分-靶點-通路互作圖，詳見圖 6。

圖4 GO功能分析

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 成分-靶點-通路圖

2.6 分子對接結(jié)果 以2.4得到的5個核心蛋白為配體，以芍藥甘草湯的36種活性成分為受體，利用AutoDock Vina軟件進行分子對接，得到的affinity(kcal/mol)值越低，代表結(jié)合能力越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。并采用Pymol軟件進行可視化處理。詳見圖7、圖8。

圖7 分子對接能量熱圖

圖8 核心蛋白和活性成分分子對接圖

3 討 論

中醫(yī)學(xué)中，痙攣性偏癱屬于“拘攣”“痙證”等范疇，《景岳全書·論治血氣》云：“偏枯拘急痿弱之類，本由陰虛氣中無血，則病為抽掣”，認為拘攣是由于陰虛氣血虧虛，無以濡養(yǎng)經(jīng)脈，表現(xiàn)為肢體攣急?！夺t(yī)貫·中風(fēng)要旨》云：“其手足牽掣，口眼歪斜，乃水不榮筋，筋急而縱也”，認為陰虛津液虧損，無以濡養(yǎng)經(jīng)脈而出現(xiàn)痙攣、拘急。由此可見，腦卒中后痙攣性偏癱其病位在筋，病因為腦卒中后風(fēng)火痰瘀阻滯肢體筋脈，氣血無以濡養(yǎng)筋脈，從而肢體拘急攣縮，治宜養(yǎng)血舒筋、緩急止痛。芍藥甘草湯中白芍味苦、酸，養(yǎng)血柔肝、斂陰止汗止痛；甘草味甘，補中益氣、緩急止痛，合用則酸甘化陰，養(yǎng)血舒筋，緩解筋脈拘攣，因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法對芍藥甘草湯治療腦梗死后痙攣性偏癱的作用機制進行了探討。首先利用TCMSP、DrugBank、GeneCards、OMIM-NCBI數(shù)據(jù)庫獲取了芍藥甘草湯的藥物活性成分、藥物靶點、疾病靶點及藥物-疾病共有靶點，利用 Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建了芍藥甘草湯的成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。構(gòu)建PPI視圖并進一步進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析得出排名前5位的核心靶點分別是：PTGS2、AKT1、CASP3、CAT、SOD1。PTGS2即環(huán)氧合酶2(COX2)，又稱前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2，是合成前列腺素(PGS)的限速酶，越來越多的證據(jù)支持氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥在腦缺血損傷進展中起著關(guān)鍵作用的觀點，PGS是腦內(nèi)主要的炎癥介質(zhì)，參與腦缺血損傷的病理生理過程[9-10]。PGS的生成由COX介導(dǎo)，其病理生理過程為：當腦出血發(fā)生后，釋放大量花生四烯酸(AA)，經(jīng)COX催化、細胞特異性合成酶代謝，生成5種PGS，這5種PGS與指定的G蛋白耦聯(lián)受體結(jié)合，引發(fā)對環(huán)磷酸腺苷(CAMP)循環(huán)、磷酸肌醇轉(zhuǎn)化和鈣動員的特異性反應(yīng)[11]。COX有兩種形式：COX1和COX2，其中COX2為誘導(dǎo)性酶，在正常條件下，可以促進基本腦功能的運行，如神經(jīng)元突觸活動、記憶鞏固、功能性充血[12]。研究表明，使用COX抑制劑可以減輕腦缺血后的神經(jīng)元損傷[9-10]。SOD1、CAT均為抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子，正常情況下，腦組織代謝產(chǎn)生的氧自由基、過氧化氫等活性氧的生成與清除屬于平衡狀態(tài)，當腦組織缺血缺氧后，平衡狀態(tài)被打破，腦組織內(nèi)活性氧增多，超過生理限度，引起神經(jīng)元損傷，其含量與活性與腦組織的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)[13]。CASP3是一種常被激活的死亡蛋白酶，催化多種細胞關(guān)鍵蛋白的特異性斷裂，是細胞凋亡過程最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶[14]。動物實驗證明，通過抑制CASP3蛋白的表達可以抑制腦缺血大鼠的腦細胞凋亡[15]。AKT包含3種亞型，分別為AKT1、AKT2和AKT3。其中AKT1能調(diào)節(jié)代謝、促進血管生成，與細胞增殖、細胞存活、生長密切相關(guān)[16]。AKT1基因與外周血管疾病、動脈粥樣硬化、閉塞性冠狀動脈疾病、斑塊易損性和心功能不全等密切相關(guān)[17-19]。而動脈粥樣硬化是腦卒中的主要誘發(fā)因素。通過構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，得到關(guān)鍵活性成分有kaempferol(山萘酚)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)formononetin(刺芒柄花素)、glypallichalcone(刺果甘草查耳酮)、shinpterocarpin等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，山萘酚和刺芒柄花素均有抗炎、抗氧化應(yīng)激、清除自由基、抑制腫瘤生長等作用[20-22]。研究表明，芒柄花黃素對小鼠腦缺血再灌注損傷有保護作用，可能是通過降低相關(guān)炎性因子的表達、抑制炎癥反應(yīng)來實現(xiàn)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，山萘酚具有抗血小板聚集和抗血小板過度活化的作用[24]。β-谷甾醇有抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗癌、降低膽固醇水平和雌激素樣作用[25]。β-谷甾醇可增加抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子的活性，降低過氧化氫酶活性，從而發(fā)揮清除自由基作用；β-谷甾醇有血管生成作用，有助于缺血再灌注損傷小鼠的運動功能的恢復(fù)[26-27]。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)共有靶點主要參與了對營養(yǎng)水平的作用、對脂多糖的作用、突觸膜的固有成分等過程。KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)芍藥甘草湯治療腦梗死后痙攣性偏癱的信號通路主要涉及腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、AGE-RAGE信號通路、C型凝集素受體信號通路、白細胞介素-17信號通路等。腦梗死或再灌注后，使炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等大量釋放，致抗氧化應(yīng)激相關(guān)因子過度消耗，生成細胞毒性物質(zhì)，而炎性因子TNF-α反過來會刺激和產(chǎn)生炎性因子，引發(fā)炎癥聯(lián)級反應(yīng)[28-29]。研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物可能是通過抑制腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)蛋白表達，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用實現(xiàn)的[30]。腦血管意外發(fā)生后，分布在神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞的Toll樣受體家族(TLRs)被激活表達，刺激產(chǎn)生大量炎性因子，從而加重腦組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，對糖尿病合并腦缺血損傷大鼠使用某藥物后，通過抑制toll樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(Myd88)信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以減輕腦組織損傷[31]。在發(fā)生腦缺血之前，對大鼠進行TLRs預(yù)處理，會抑制TNF-α以及其他由NF-κB 誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎性因子，并通過非依賴性MyD88 信號通路，促進干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素調(diào)節(jié)因子β，可以減輕腦缺血損傷后的炎癥聯(lián)級反應(yīng)、缺血再灌注損傷、腦水腫、減少腦梗死面積，最終產(chǎn)生腦缺血耐受，保護腦組織作用[32]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選分析芍藥甘草湯和腦梗死后痙攣性偏癱的相關(guān)靶點，構(gòu)建成分-靶點-通路互作網(wǎng)絡(luò)圖，進行了有效成分和核心蛋白的分子對接，結(jié)果顯示，活性成分和核心蛋白對接良好。芍藥甘草湯治療腦梗死后痙攣性偏癱的可能機制是通過調(diào)控PTGS2、AKT1、CASP3、CAT、SOD1等核心蛋白發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、清除自由基、減少炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生實現(xiàn)的，體現(xiàn)了芍藥甘草湯多成分、多靶點、多通路協(xié)同治療疾病的特點，為臨床治療腦梗死后痙攣性偏癱及進一步研究相關(guān)機制提供理論依據(jù)。