桑育黎，劉景玉，郭方巖，辛躍強(qiáng)，石 磊，陳海剛，郝延軍

(1.遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.華潤三九(郴州)制藥有限公司，湖南 郴州 423000；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥科學(xué)院，遼寧 沈陽 110032)

0 引言

狹山野豌豆為豆科野豌豆屬植物，味甘、性平，具有活血、解毒、通絡(luò)、行水的功效，為蒙藥透骨草山野豌豆的變種，在民間亦作透骨草被廣為使用.臨床上多用在祛風(fēng)除濕、活血止痛等病癥.通過前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，中國藥典狹山野豌豆具有多種黃酮類化學(xué)成分.目前多采用黃酮類化合物作為指標(biāo)性成分對(duì)野豌豆屬透骨草藥材進(jìn)行質(zhì)量控制[1].實(shí)驗(yàn)以狹山野豌豆主要活性成分總黃酮含量為測定指標(biāo)，對(duì)狹山野豌豆黃酮類化學(xué)成分的富集工藝進(jìn)行了研究[2].

1 儀器與試劑

粉碎機(jī)RRHP-100型(香港歐凱萊芙有限公司)；電子天平(萬分之一)(北京賽多利斯科學(xué)儀器系統(tǒng)有限公司)；恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；無水乙醇(分析純)(天津市康科德科技有限公司)；大孔樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)；層析柱(沈陽瑞寶玻璃廠)；乙腈(色譜純)(德國Merk公司)；磷酸(色譜純)(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；超純水器(法國MILLIPORE).

2 實(shí)驗(yàn)材料

狹山野豌豆2015年09月采集于遼寧省朝陽市朝陽縣小塔子，經(jīng)遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院王維寧教授鑒定為豆科(Leguminosae)野豌豆屬(ViciaL.)狹山野豌豆(V.amoenaFisch.Var.angustaFreyn.).樣品保存于遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測院中藥標(biāo)本室.

3 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

3.1 樣品溶液制備

精密稱取狹山野豌豆藥材粉末(4號(hào)篩)200 g，置5 000 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇溶液4 000 mL(按1∶20體積比例)，加熱回流1 h，提取2次，提取溫度為90 ℃，提取液合并，蒸干，蒸餾水溶解，定容至1 000 mL.

3.2 大孔樹脂預(yù)處理

將10種大孔樹脂用蒸餾水浸泡過夜，使其充分膨脹.再依次用30%、50%、70%、95%乙醇水溶液沖洗，直至95%乙醇水溶液流出液與蒸餾水(體積比5∶1)混合[3]，液體不渾濁.再依次用95%、70%、50%、30%乙醇水溶液以及水沖洗各大孔樹脂，最終用蒸餾水沖洗至無醇味，備用.

3.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸附篩選

3.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，見表1；體積流量1.0 mL·min-1；紫外檢測波長為350 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL[4].

3.3.2 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

精密稱定10種經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂各1 g(干燥無水)，置于50 mL錐形瓶中，分別加入50 mL質(zhì)量濃度為0.17 g·mL-1生藥溶液(5種黃酮苷濃度c0為0.640 4 mg·mL-1)，時(shí)時(shí)振搖(120 r/min)，振搖2 h，過濾，取續(xù)濾液.按“3.3.1”項(xiàng)下色譜條件，測定5種黃酮苷含量，計(jì)算，結(jié)果見表1.

3.3.3 靜態(tài)解吸附試驗(yàn)

取上述過濾得到的10種大孔樹脂，分別置于50 mL錐形瓶中，分別加入50 mL 70%乙醇水溶液，時(shí)時(shí)振搖(120 r/min)，振搖2 h，過濾，取續(xù)濾液.按“3.3.1”項(xiàng)下色譜條件，測定5種黃酮苷含量，計(jì)算.結(jié)果見表1，數(shù)據(jù)表明HPD-826對(duì)狹山野豌豆總黃酮吸附與解吸附效果最好，適于狹山野豌豆總黃酮的富集.

表1 10種大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4 HPD-826型大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

3.4.1 上樣濃度對(duì)HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮影響試驗(yàn)

稱取5份經(jīng)過預(yù)處理的HPD-826型大孔樹脂各10 g(干燥)濕法裝于各層析柱(Φ1.5 cm×20 cm)中，分別取0.2 g/mL生藥質(zhì)量濃度的樣品50，100，200，400，800 mL，經(jīng)過稀釋或濃縮定容至200 mL，超聲溶解，使樣品充分溶解，分別上柱，控制流速為2 mL·min-1，收集流出液，過濾，以5種黃酮苷含量為指標(biāo)進(jìn)行檢測[5].實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1.

由圖1可以看出：當(dāng)上樣質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 g/mL時(shí)，HPD-826型大孔樹脂對(duì)狹山野豌豆總黃酮的吸附率達(dá)到93.26%，其余濃度均低于90%.因此，將上樣濃度定為0.1 g/mL.

圖1 上樣濃度對(duì)HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮的影響

3.4.2 pH對(duì)HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮影響實(shí)驗(yàn)

分別量取樣品溶液(總黃酮質(zhì)量濃度為0.385 6 mg·mL-1)100 mL，共5份，其中4份用1 mol·L-1HCl溶液或1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH范圍1～2、3～4、5～6、7～8.將上述5份溶液依次加入HPD-826型大孔樹脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，控制流速為2 mL·min-1，收集流出液，過濾，以5種黃酮苷含量為指標(biāo)進(jìn)行檢測.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2.

由圖2可以看出：上樣液體pH范圍應(yīng)定為5～6.

圖2 pH對(duì)HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮影響試驗(yàn)

3.4.3 HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮泄漏曲線考察試驗(yàn)

將pH 5～6樣品水溶液(總黃酮質(zhì)量濃度為0.377 89 mg·mL-1)，加入預(yù)處理好的HPD-826型大孔樹脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，調(diào)節(jié)流速為2 mL·min-1進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，按樹脂床體積數(shù)收集流出液，過濾，以5種黃酮苷含量為指標(biāo)進(jìn)行檢測.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3.

由圖3可以看出：在工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)若為單個(gè)樹脂柱時(shí)上樣體積為5倍樹脂床體積，若為多個(gè)樹脂柱串聯(lián)時(shí)，則最宜上樣體積為15倍樹脂床體積.

圖3 泄漏曲線考察試驗(yàn)結(jié)果

3.4.4 洗脫劑對(duì)HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮影響試驗(yàn)

分別量取pH 5～6樣品水溶液(總黃酮濃度為0.377 89 mg·mL-1)200 mL，分別加入4根預(yù)處理好的HPD-826型大孔樹脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，調(diào)節(jié)流速為2 mL·min-1進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，濾過.先用水洗脫至近無色，再分別用30%、50%、70%和95%乙醇水溶液洗脫至近無色[6]，洗脫液過濾.將樣品流出液和洗脫液以5種黃酮苷含量為指標(biāo)進(jìn)行檢測.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4.

根據(jù)圖4，最終選取70%乙醇水溶液作為洗脫劑的最佳濃度.

圖4 洗脫劑對(duì)HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮影響試驗(yàn)

3.4.5 HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮洗脫曲線考察實(shí)驗(yàn)

將pH 5～6樣品水溶液(總黃酮質(zhì)量濃度為0.359 25 mg·mL-1)200 mL，加入預(yù)處理好的HPD-826型大孔樹脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，調(diào)節(jié)流速為2 mL·min-1進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，過濾.先用水洗脫至近無色，再70%乙醇水溶液洗脫，以3 mL·min-1流速進(jìn)行洗脫，按樹脂床體積數(shù)收集洗脫液，過濾，將樣品流出液和洗脫液按“3.3.1”項(xiàng)下色譜條件，以5種黃酮苷含量為指標(biāo)進(jìn)行檢測.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5.

由圖5可以看出：10倍樹脂柱床體積為最佳洗脫液體積.

3.4.6 HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮純化工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將pH 5～6樣品水溶液(總黃酮質(zhì)量濃度為0.359 25 mg·mL-1)，加入預(yù)處理好的HPD-826型大孔樹脂柱(Φ1.5 cm×20 cm，10 g)中，上樣體積為5倍樹脂柱床體積，調(diào)節(jié)流速為2 mL·min-1進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，收集流出液，過濾.先用水洗脫至近無色，再70%乙醇水溶液洗脫，以3 mL·min-1流速進(jìn)行洗脫，洗脫體積為10倍樹脂床體積數(shù)，收集洗脫液，過濾，將樣品流出液和洗脫液按“3.3.1”項(xiàng)下色譜箱件，以5種黃酮苷含量為指標(biāo)進(jìn)行檢測.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 HPD-826型大孔樹脂純化總黃酮工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

4 結(jié)果與討論

1)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)狹山野豌豆中可分離得到多個(gè)黃酮類化合物，狹山野豌豆的提取物對(duì)與免疫相關(guān)的TLR2、TLR4受體有激活作用[1]，且水提取物作用強(qiáng)度大于 95%醇提取物，推測狹山野豌豆的免疫調(diào)節(jié)作用可能來自黃酮類成分，因此優(yōu)化狹山野豌豆總黃酮的富集工藝十分重要.

2)在前期實(shí)驗(yàn)中，得到通過乙酸乙酯萃取的方法富集狹山野豌豆總黃酮，其結(jié)果為3.147 0 mg/g，而通過HPD-826型大孔樹脂對(duì)狹山野豌豆總黃酮富集，其結(jié)果為3.289 6 mg/g，因此，選取大孔樹脂更適合狹山野豌豆總黃酮的富集，且經(jīng)過10種大孔樹脂對(duì)比，篩選出HPD-826為最佳型號(hào).

3)本試驗(yàn)對(duì)上樣質(zhì)量濃度影響進(jìn)行考察，依次為0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 g/mL，在質(zhì)量濃度為0.1 g/mL時(shí)吸附率最大.對(duì)pH進(jìn)行考察，范圍依次1～2、3～4、5～6、7～8，在pH為5～6范圍時(shí)吸附率最大.對(duì)洗脫劑進(jìn)行考察，雖然95%乙醇水溶液對(duì)總黃酮的解吸附率最高，但考慮節(jié)約資源選取70%乙醇水溶液.因此，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，pH為5～6，洗脫劑為70%乙醇水溶液，洗脫體積為10倍樹脂床柱體積時(shí)，HPD-826對(duì)狹山野豌豆總黃酮的富集效果最佳.