宋淑玲, 潘萌, 馬曉東

(1.國家地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心, 北京 100037;2.中國地質(zhì)調(diào)查局自然資源綜合調(diào)查指揮中心， 北京 100055；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 北京 100193)

p,p’-DDT，即1,1,1-三氯-2-(4-氯苯)-2-(4-氯苯)乙烷,是一種有機(jī)氯農(nóng)藥和持久性有機(jī)污染物(POPs)。自20世紀(jì)40年代至80年代，p,p’-DDT被廣泛用于防治植物蟲害和一些傳染性疾病[1-3]。p,p’-DDE(1,1-二氯-2-(4-氯苯)-2-(4-氯苯)乙烯)是p,p’-DDT在環(huán)境中的一級(jí)代謝物和主要降解產(chǎn)物[4-5]。一些研究結(jié)果表明，與p,p’-DDT相比，p,p’-DDE在環(huán)境中更穩(wěn)定，能長期在各種介質(zhì)中存留，已在土壤、大氣、水和沉積物中被廣泛檢出[6-11]，可通過食物鏈轉(zhuǎn)移并在生物體內(nèi)積累[12-14]。自20世紀(jì)80年代p,p’-DDT被禁用以來，p,p’-DDE仍是人體中殘留水平最高的POPs[7,15-16]。近年來一些研究表明，p,p’-DDE對(duì)嬰兒和兒童表現(xiàn)出神經(jīng)毒性[17]，對(duì)人體健康的負(fù)面影響更大，如結(jié)直腸癌、帕金森病風(fēng)險(xiǎn)和干擾孕婦同型半胱氨酸代謝[18-20]。

但是，2002年世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布，重新啟用p,p’-DDT用于控制蚊子繁殖和預(yù)防瘧疾、登革熱和黃熱病[21]。因此，p,p’-DDE將長期占據(jù)人體中可檢測(cè)到POPs列表的首位。研究人員通過不同途徑調(diào)查人類p,p’-DDE暴露水平，估算其積累水平。例如，一些研究調(diào)查了大氣[22-23]、食物[24]和飲用水[25-26]中p,p’-DDE的殘留水平，并估計(jì)了人體每日攝入量(estimated daily intake,EDI)或暴露水平。此外，母乳通常被作為理想的生物介質(zhì)[27]用來監(jiān)測(cè)人體p,p’-DDE殘留水平或蓄積水平，估計(jì)哺乳期間的排泄速度(Ve)[28-30]，并評(píng)估哺乳期嬰兒暴露風(fēng)險(xiǎn)[31]。

目前大多數(shù)研究者通過測(cè)定哺乳期母乳中p,p’-DDE濃度，估算母體中“靜態(tài)”蓄積水平和嬰幼兒的每日攝入量，但無法獲取母體內(nèi)p,p’-DDE的EDI和“動(dòng)態(tài)”的富集速度(Va)以及長期變化趨勢(shì)。本文連續(xù)收集了捐贈(zèng)者第一次和第二次分娩后的母乳樣品，并采用有機(jī)氯農(nóng)藥常用的氣相色譜-電子捕獲法(GC-ECD)[32]檢測(cè)其中p,p’-DDE含量，用于：①調(diào)查當(dāng)?shù)嘏泽w內(nèi)p,p’-DDE的積累水平及變化趨勢(shì)；②估計(jì)兩個(gè)哺乳期內(nèi)p,p’-DDE的月排泄速度及其影響因素；③估算北京女性體內(nèi)p,p’-DDE的年富集速度。最終獲取北京女性體內(nèi)p,p’-DDE在哺乳期的排泄速度、長期富集速度和每日攝入量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品收集

自2009年至2019年，項(xiàng)目組總計(jì)收集了61名志愿者的母乳樣品。所有的志愿者都是北京市常住居民，均簽訂了知情同意書，并填寫包括年齡、體重、職業(yè)和身高等信息的調(diào)查問卷。61名志愿者分娩后，每25～30天采集一個(gè)樣品，連續(xù)采集六個(gè)月。在61名志愿者中，43名志愿者捐獻(xiàn)了初次分娩后六個(gè)月哺乳期的母乳樣品，另外18名志愿者捐獻(xiàn)了第一次和第二次分娩后的母乳樣品，兩個(gè)哺乳期間隔6～7年。第一個(gè)哺乳期內(nèi)采集的樣品依次記作F1、F2、F3、F4、F5、F6，第二次分娩后采集的樣品依次記作S1、S2、S3、S4、S5、S6。每個(gè)樣品被采集到30mL潔凈玻璃瓶中，并加具有聚四氟乙烯內(nèi)襯的螺紋蓋后冷凍保存在家用冰箱中，直至轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。

本研究中只采用F1、F6、S1和S6的數(shù)據(jù)，計(jì)算哺乳期內(nèi)母乳中p,p’-DDE月平均排泄速度。志愿者及樣品信息見表1?？瞻缀涂瞻准訕?biāo)基質(zhì)為蒙牛純牛奶，脂肪含量36.0g/L，購自超市。

表1 志愿者及樣品信息Table 1 Information of donors and samples

1.2 主要試劑和材料

正己烷、丙酮、乙醇、乙醚、氨水和二氯甲烷：均為農(nóng)殘級(jí)，購自美國J&K Science公司、美國Honeywell和美國Fisher公司。

無水硫酸鈉：分析純，購自北京化學(xué)試劑廠。使用前在600℃馬弗爐中烘6h，放置干燥器中備用。

填充柱用凈化硅膠(60～100目)：購自青島海洋化學(xué)試劑公司。使用前在500℃馬弗爐中烘16h，然后在130℃下平衡16h，放置干燥器中備用。

含有p,p’-DDE的混合有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液(50.0μg/mL)和替代物(含有2,4,5,6-四氯間二甲苯和二丁基氯菌酸酯)標(biāo)準(zhǔn)溶液 (EPA8081農(nóng)藥混合替代物)：分別購自國家標(biāo)準(zhǔn)研究所和美國Sigma公司。

1.3 儀器及測(cè)試條件

2010GC System氣相色譜-電子捕獲儀(GC-ECD，日本Shimadzu公司)：配有Ai自動(dòng)進(jìn)樣器。進(jìn)樣口250℃，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積1.0μL；ECD溫度305℃。配有DM-5MS (50m×0.25mm×0.25μm)石英毛細(xì)管分析柱。升溫條件為：初始溫度120℃，以6℃/min升至220℃，繼續(xù)以2℃/min升至265℃，然后以20℃/min升至280℃保持8min，最后以50℃/min升至300℃并保持10min。

1.4 樣品提取與凈化

用移液器準(zhǔn)確量取10.0mL樣品，并稱量樣品質(zhì)量。將樣品轉(zhuǎn)移到150mL分液漏斗中，加入替代物、搖勻。向樣品中依次加入約5mL氨水、10mL乙醇和15mL乙醚，每次加入不同溶劑前都充分振搖、放氣、散熱。最后向樣品中加入25mL正己烷，充分振搖3min，靜置分層后，接收上層有機(jī)相。重復(fù)以上步驟一次，合并兩次有機(jī)相提取液，并用無水硫酸鈉除水后，將提取液旋轉(zhuǎn)濃縮至約10mL小體積，并轉(zhuǎn)移到恒重后的稱量瓶中，然后采用質(zhì)量恒重法計(jì)算脂肪的質(zhì)量和含量。用正己烷和少量的丙酮將脂肪復(fù)溶、定容至4.0mL，并保存到棕色、具蓋、密封性好的玻璃瓶中。

準(zhǔn)確分取2.0mL提取濃縮液，用硅膠填充柱凈化(30cm×8mm內(nèi)徑,填充6g硅膠)。首先將2.0mL樣品轉(zhuǎn)移到柱頭，先用10mL正己烷預(yù)淋洗硅膠柱，然后再依次用10mL正己烷和25mL二氯甲烷洗脫液洗脫目標(biāo)物，并接收洗脫液。將洗脫液濃縮，并用環(huán)己烷定容至1.0mL，等待分析。

1.5 質(zhì)量保證

在進(jìn)行實(shí)際樣品分析前，采用本方法分析了三個(gè)濃度水平(0.40、4.00和10.0ng/mL)、五次重復(fù)的新鮮牛奶的添加樣品模擬實(shí)驗(yàn)，以目標(biāo)物平均回收率(R)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評(píng)估分析方法的準(zhǔn)確度和精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明p,p’-DDE的檢出限為6.0μg/kg lipids，p,p’-DDE和替代物二丁基氯菌酸酯回收率令人滿意，平均回收率分別分布在59.8%～120.5%區(qū)間(平均值為81.3%)和40.2%～119.3%區(qū)間(平均值為68.9%)，RSD平均值分別為19%和22%。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS statistic 22.0(IBM)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS 軟件中的雙變量相關(guān)性，對(duì)母乳中p,p’-DDE濃度與母乳脂肪含量、志愿者年齡、志愿者體重指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。兩者是否具有相關(guān)性的判別標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)相關(guān)系數(shù)r>0.5和皮爾森參數(shù)p<0.05時(shí)，認(rèn)為具有典型相關(guān)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩個(gè)相鄰哺乳期母乳中p,p’-DDE殘留水平

本研究中，18名母親連續(xù)兩次分娩間隔時(shí)間為6～7年。采集18名母親兩個(gè)哺乳期的樣品后，假設(shè)哺乳期中排泄速度不變，根據(jù)第一個(gè)哺乳期F1和F6樣品中p,p’-DDE檢測(cè)濃度，計(jì)算了哺乳期母乳中p,p’-DDE排泄速度，并估算F10(第一個(gè)哺乳期內(nèi)第10個(gè)月)中p,p’-DDE的濃度。將兩個(gè)哺乳期的F1、F6、F10、S1、S6中p,p’-DDE的濃度進(jìn)行比較，如圖1所示。

圖1 志愿者連續(xù)兩個(gè)哺乳期母乳中p,p’-DDE濃度比較(六個(gè)月哺乳期內(nèi))Fig.1 Residue levels of p,p’-DDE in breast milks from same donors within two consecutive lactations

圖1展示了每個(gè)哺乳期內(nèi)母乳中p,p’-DDE的濃度變化趨勢(shì)，以及兩個(gè)哺乳期間母體內(nèi)p,p’-DDE濃度的蓄積或富集特征。首先，對(duì)于每個(gè)哺乳期，首個(gè)樣品F1(或S1)中p,p’-DDE的殘留水平均高于F6(或S6)。這表明，在哺乳期內(nèi)母乳中的p,p’-DDE濃度表現(xiàn)出持續(xù)下降的特點(diǎn)，即母體內(nèi)p,p’-DDE不斷排出體內(nèi)，體內(nèi)p,p’-DDE蓄積濃度呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。這一研究結(jié)果與其他研究者一致[28-30]。其次，大多數(shù)志愿者第二個(gè)哺乳期S1中p,p’-DDE的濃度普遍高于F10中的值，而一些志愿者S1中p,p’-DDE的濃度甚至高于F6中的值。S1高于F10或F6則表明在分娩間隔期內(nèi)，志愿者體內(nèi)的p,p’-DDE是一種濃度凈增加過程，即富集和累積過程。志愿者體內(nèi)p,p’-DDE濃度的增加，應(yīng)該與飲食、空氣、環(huán)境和接觸性暴露相關(guān)[26,33-35]。

2.2 分娩次數(shù)對(duì)母乳中p,p’-DDE 殘留水平的影響

一般來說，研究者認(rèn)為分娩次數(shù)對(duì)母乳中p,p’-DDE的殘留水平有影響。許多研究已經(jīng)證明，母乳單位脂肪中p,p’-DDE濃度與分娩次數(shù)之間存在負(fù)相關(guān)性[36]，即分娩次數(shù)越多，母體內(nèi)p,p’-DDE濃度越低。在目前的研究中，本工作給出了最新的研究結(jié)果。盡管對(duì)于18名志愿者，S1中p,p’-DDE濃度并不總是低于F6(第一個(gè)哺乳期內(nèi)采集的最后一個(gè)樣本)，但明顯低于F1中p,p’-DDE的濃度(如圖1所示)。同時(shí)比較了相同年齡的初次分娩和二次分娩志愿者，在哺乳期內(nèi)母乳中p,p’-DDE的平均值。例如，本研究中，61名志愿者大多數(shù)初次分娩年齡在26～31歲之間，其中18名志愿者在6年或7年后，即在32～36歲第二次分娩。分析結(jié)果表明，32～36歲初次分娩志愿者F1中的p,p’-DDE均高于同年齡二次分娩母親的S1中p,p’-DDE濃度(圖2)。這表明，當(dāng)母親年齡相同時(shí)，母乳單位脂肪中p,p’-DDE濃度與分娩的次數(shù)有關(guān)。

P0、P25、P50、P75和P100分別表示最小值、最小四分位值、中值、較大四分位值和最大值。圖2 初次分娩和二次分娩志愿者(32～36歲)F1和S1中p,p’-DDE濃度的箱式分布圖Fig.2 Comparison of average residue levels of p,p’-DDE in F1 samples and S1 samples from mothers at age of 32-36 years old (Each box shows the median as a square, P25 and P75 as a box, and the lowest P0 and highest P100 values as whiskers)

2.3 兩個(gè)哺乳期內(nèi)p,p’-DDE排泄速度的比較

本研究中，計(jì)算了18名母親第一個(gè)和第二個(gè)哺乳期p,p’-DDE的排泄速度(Ve，μg/kg lipids/month)。分析結(jié)果的平均值列于表2。當(dāng)分別去除F1和F6的最大值和最小值后，第一個(gè)哺乳期排泄速度為18.9μg/kg lipids/month，第二個(gè)哺乳期排泄速度為16.8μg/kg lipids/month。因此，母乳中的p,p’-DDE在這兩個(gè)哺乳期內(nèi)排泄速度不同，第一個(gè)哺乳期內(nèi)排泄速度大于第二個(gè)哺乳期內(nèi)。

假設(shè)F1和S1中p,p’-DDE濃度代表哺乳期開始時(shí)母體中p,p’-DDE的原始蓄積水平，由于F1中p,p’-DDE濃度明顯高于S1中濃度，則第一個(gè)哺乳期中p,p’-DDE的排泄速度大于第二個(gè)哺乳期的研究結(jié)果初步表明，哺乳期母乳中的排泄速度和人體內(nèi)的原始蓄積水平之間可能存在相關(guān)性。本文統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論。在這里，SPSS被用于分析排泄速度和原始蓄積水平之間的相關(guān)性(假設(shè)它等于F1中的值)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果為r=0.709和p=0.01，即兩者有顯著的正相關(guān)性。

2.4 北京女性體內(nèi)p,p’-DDE的富集速度

盡管許多學(xué)者將母乳中的p,p’-DDE濃度用于研究人體中的暴露或蓄積水平，或計(jì)算哺乳期母體中p,p’-DDE的排泄速度，但鮮有學(xué)者以母乳中p,p’-DDE估算和評(píng)價(jià)人體中p,p’-DDE的富集速率。本研究通過測(cè)試間隔時(shí)間為t年的兩個(gè)連續(xù)哺乳期母乳中p,p’-DDE濃度，以公式(1)估算人體中p,p’-DDE在兩個(gè)哺乳期間的富集速度或蓄積速度。

(1)

式中：Va代表蓄積速度；C0代表前一個(gè)哺乳期結(jié)束時(shí)母乳中p,p’-DDE的濃度；C1是第二個(gè)哺乳期開始時(shí)母乳中p,p’-DDE的濃度；t代表兩個(gè)哺乳期的間隔時(shí)間(年)，本研究中t取均值6年。

為了估算Va，將S1中的p,p’-DDE作為C1的最佳值。與此同時(shí)，研究中所有母親都堅(jiān)持母乳喂養(yǎng)10～12個(gè)月，故取F10中p,p’-DDE的濃度設(shè)為C0。根據(jù)表2所示的平均排泄速度來估計(jì)F10中的p,p’-DDE?？紤]到樣本數(shù)量有限，用表2中描述的三種方法(取所有值計(jì)算、去極值計(jì)算、取P25～P75

表2 p,p’-DDE的排泄速度和富集速度Table 2 Excretion speed and accumulating speed of p,p’-DDE

區(qū)間值計(jì)算)分別計(jì)算出三組F1、F6、F10和Ve值，然后給出Va的范圍。計(jì)算結(jié)果表明，Va區(qū)間范圍為10.9～14.9μg/kg lipids/year。同時(shí)我們假設(shè)，母體每日p,p’-DEE所有攝入量都蓄積或富集在體內(nèi)，即忽略體內(nèi)每日排出量，則可估計(jì)出EDI值的范圍為29.8～40.8ng/day/kg.b.w.。

3 結(jié)論

p,p’-DDE是近年來北京市居民母乳中殘留濃度最高的POPs。在本研究中，通過連續(xù)采集兩次哺乳期母乳樣品和檢測(cè)p,p’-DDE濃度，并假設(shè)所有志愿者暴露水平和母乳分泌量無顯著差異，探索性地研究不同哺乳期內(nèi)母乳中p,p’-DDE排泄速度與影響因素，以及估算母體p,p’-DDE的每日攝入量和富集速度。研究結(jié)果初步表明，哺乳期內(nèi)母乳中p,p’-DDE濃度總是持續(xù)下降；母乳中p,p’-DDE的排泄速度與原始蓄積水平有關(guān)，并且第一次哺乳期內(nèi)排泄速度高于第二個(gè)哺乳期；北京女性體內(nèi)p,p’-DDE仍然是一種凈增加趨勢(shì)，年富集速度范圍為10.9～14.9μg/kg lipids/year，其值相當(dāng)于哺乳期月排泄速度；北京女性p,p’-DDE每日攝入量(EDI)范圍為29.8～40.8ng/day/kg b.w.，明顯低于世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)對(duì)DDT的建議值，即20μg/day/kg b.w.。

隨著全球人體中p,p’-DDE蓄積水平不斷降低，準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)p,p’-DDE在人體中的富集速度，預(yù)測(cè)人體中p,p’-DDE風(fēng)險(xiǎn)值的出現(xiàn)時(shí)間或窗口期，對(duì)人體p,p’-DDE暴露風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)、環(huán)境中p,p’-DDE管理和控制政策的制定與實(shí)施更具有指導(dǎo)意義。本研究嘗試采用連續(xù)哺乳期母乳中p,p’-DDE濃度來估算母體中p,p’-DDE富集速度和每日攝入量，進(jìn)一步拓展了母乳中p,p’-DDE濃度指示意義和范圍。研究結(jié)果使母體中p,p’-DDE濃度不僅可以指示某個(gè)時(shí)間點(diǎn)或短期內(nèi)母體p,p’-DDE暴露水平，同時(shí)可以指示某個(gè)時(shí)間段或長期內(nèi)母體p,p’-DDE的富集速度和每日攝入量，而富集速度的正負(fù)值大小則能更直接反映人體p,p’-DDE的暴露或蓄積風(fēng)險(xiǎn)，以及發(fā)展趨勢(shì)。