楊建強(qiáng)， 曹夢(mèng)琪， 王 袼， 胡姝婭， 王?；?*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山西 太谷 030801； 2. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所植被與環(huán)境變化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100093；3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 山西 太谷 030801)

土壤氮循環(huán)是陸地生態(tài)系統(tǒng)生物地球化學(xué)循環(huán)的重要過(guò)程之一[1]，硝化作用是土壤氮循環(huán)的關(guān)鍵過(guò)程[2-3]，一般認(rèn)為包括氨氧化和亞硝化兩個(gè)過(guò)程。氨氧化過(guò)程主要由氨氧化細(xì)菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)完成[4-6]。氨單加氧酶(Ammonia monooxygenase subsuit A，AmoA)是氨氧化作用的關(guān)鍵酶，編碼AmoA亞基的基因AOA-amoA，AOB-amoA被認(rèn)為是草地土壤硝化過(guò)程的核心[7]。由于amoA基因具有較強(qiáng)的保守性，常被作為研究氨氧化微生物的分子標(biāo)記[8]。

位于我國(guó)北方的內(nèi)蒙古草原是歐亞草原的典型代表，面積廣袤，從東到西草地類(lèi)型分別為草甸草原(降雨量385～449 mm)，典型草原(降雨量316～404 mm)和荒漠草原(降雨量168～281 mm)，是我國(guó)北方重要的畜牧業(yè)生產(chǎn)基地和生態(tài)安全屏障。AOA和AOB廣泛存在于陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)，但生態(tài)系統(tǒng)類(lèi)型、地理空間分布格局以及環(huán)境效應(yīng)導(dǎo)致AOA，AOB及其比例在空間上存在很大差異[9]。

Leininger等研究發(fā)現(xiàn)，在自然界中AOA豐度是AOB豐度的3 000倍[10]。另有研究發(fā)現(xiàn)AOA豐度在酸性森林土壤中隨pH降低而升高，AOB則相反，且AOA-amoA基因拷貝數(shù)及轉(zhuǎn)錄量比AOB-amoA基因高10～100倍[11]。土壤微宇宙試驗(yàn)結(jié)果表明：隨著溫度的升高，AOA與AOB豐度的比值增加，AOA豐度比AOB豐度高10倍[12]。對(duì)新西蘭草地的研究表明，在富含氮的草原土壤中，AOB是硝化作用的主要驅(qū)動(dòng)因子，AOA發(fā)揮的作用很小[12]。我國(guó)河南封丘的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，堿性土壤中AOB的豐度對(duì)硝化作用的貢獻(xiàn)大于AOA的豐度[13]。在湖南祁陽(yáng)的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期施氮肥處理引起土壤理化性質(zhì)的改變，顯著影響了AOA的豐度和群落結(jié)構(gòu)，而對(duì)AOB的影響不顯著[14]。青藏高原的研究結(jié)果表明：AOB豐度對(duì)養(yǎng)分添加響應(yīng)的敏感性高于AOA[15]。雖然對(duì)AOA和AOB豐度單點(diǎn)的試驗(yàn)研究較多，但是在較大的空間尺度比較研究不同草地類(lèi)型AOA和AOB豐度差異的研究報(bào)道還不多見(jiàn)，尤其在沿隨降水梯度變化的不同類(lèi)型草地生態(tài)系統(tǒng)土壤中AOA，AOB豐度及其比例的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，研究土壤AOA和AOB的豐度在不同草地類(lèi)型的特征將有助于我們更好地理解全球變化背景下草地土壤可利用養(yǎng)分與生產(chǎn)力的關(guān)系。2018年7―8月，本試驗(yàn)沿著內(nèi)蒙古從東到西，跨越1 000余km，調(diào)查了3種草地類(lèi)型，研究?jī)?nèi)蒙古不同類(lèi)型草地土壤AOA，AOB豐度的異同，旨在探討不同草地生態(tài)系統(tǒng)中的AOA和AOB豐度的差異和造成差異的原因，以及控制AOA和AOB豐度在不同草地類(lèi)型分布的主要因子。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

本研究選擇中國(guó)北方草原內(nèi)蒙古草地樣帶，包括3個(gè)草甸草原采樣點(diǎn)(NM01，NM02，NM03)、4個(gè)典型草原采樣點(diǎn)(NM04，NM05，NM06，NM07)和3個(gè)荒漠草原采樣點(diǎn)(NM08，NM09，NM10)，共計(jì)10個(gè)采樣點(diǎn)(圖1)，采樣點(diǎn)之間距離100 km，緯度112.15°～123.51° E，經(jīng)度43.63°～44.59° N，海拔高度133～1 272 m，年平均氣溫(Mean annual temperature，MAT)變化范圍為0.10℃～5.19℃，年平均降水量(Mean annual precipitation，MAP)變化為168.29～448.47 mm。草甸草原采樣點(diǎn)位于森林-草原過(guò)渡帶的吉林和內(nèi)蒙古交界地區(qū)，氣候?yàn)闇貛Ъ撅L(fēng)氣候；典型草原分布于內(nèi)蒙古高原中部，氣候?yàn)闇貛Т箨懶詺夂颍换哪菰植荚趦?nèi)蒙古西部，屬于歐亞大陸腹地的溫帶干旱地區(qū)，氣候?yàn)闇貛Т箨懶詺夂?。不同草地?lèi)型的土壤狀況，植被群落及樣點(diǎn)地理信息見(jiàn)表1。

圖1 研究樣點(diǎn)設(shè)置示意圖

表1 采樣點(diǎn)地理位置、植被群落、土壤及微生物基本信息

1.2 樣品采集

2018年7月下旬開(kāi)始，沿著草甸草原-典型草原-荒漠草原10個(gè)樣點(diǎn)取樣，每個(gè)樣點(diǎn)8次重復(fù)。使用直徑3 cm的土鉆并采用梅花5點(diǎn)取樣法取0～10 cm表層土壤，過(guò)2 mm土篩，混合均勻，去除大的根系和石礫等雜質(zhì)。新鮮樣品采集完畢裝入封口袋中,裝入放有冰袋的保溫箱運(yùn)到距離采樣點(diǎn)最近的實(shí)驗(yàn)室，并置于-20℃冰柜冷凍保存，采樣結(jié)束后統(tǒng)一帶回中國(guó)科學(xué)院植物研究所分析測(cè)試中心立即進(jìn)行DNA的提取和qPCR的測(cè)定。

1.3 土壤DNA提取

稱(chēng)取0.25 g土壤樣品，采用MoBio公司的PowerSoil試劑盒(MoBio PowerSoil?DNA Isolation Kit MoBio Laboratories,Carlsbad,CA,USA)進(jìn)行土壤微生物總DNA的提取。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA片段大小，用NanoDrop分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies，USA)測(cè)定DNA濃度和純度。DNA樣品存儲(chǔ)在—80℃冰箱冷凍保存。

1.4 熒光定量PCR

AOA-amoA,AOB-amoA基因的實(shí)時(shí)定量PCR選用Fermentas公司生產(chǎn)的MaximaTMSYBR Green/ROXqPCR Master Mixture進(jìn)行。擴(kuò)增體系為20 μL，包含2 × ChamQ SYBR ColorqPCR Master Mix 10 μL，5 μM Primer F和Primer R各0.4 μL，Temple DNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。AOA-amoA，AOB-amoA基因序列引物及擴(kuò)增條件見(jiàn)表2。

表2 熒光定量PCR所用引物及擴(kuò)增條件

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

使用Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，對(duì)每個(gè)樣點(diǎn)AOA和AOB豐度按照不同草地類(lèi)型進(jìn)行單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。將不同樣點(diǎn)AOA，AOB豐度分別與地理、氣候、土壤、植物、微生物等影響因子進(jìn)行回歸分析并進(jìn)行了Pearson相關(guān)分析(IBM SPSS Statistics 25)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種草地類(lèi)型的AOA和AOB基因豐度的比較

對(duì)內(nèi)蒙古3種草地類(lèi)型的AOA和AOB的amoA基因拷貝數(shù)結(jié)果分析表明，每克干土的AOA-amoA基因拷貝數(shù)介于8.1×106～1.3×109個(gè)之間，AOB-amoA基因拷貝數(shù)介于2.3×106～2.9×107個(gè)之間。相同草地類(lèi)型中AOA的豐度均高于AOB豐度。在3種草地類(lèi)型中，AOA豐度變化趨勢(shì)為：典型草原>荒漠草原>草甸草原。其中典型草原與草甸草原的AOA豐度差異顯著(P<0.05)。而3種草地類(lèi)型中AOB豐度和AOA/AOB均無(wú)顯著差異(圖2)。

圖2 內(nèi)蒙古3種草地類(lèi)型AOA，AOB的amoA基因拷貝數(shù)及其比值

2.2 3種草地類(lèi)型的AOA，AOB豐度的影響因素

如表3、表4所示，將地理、氣候、土壤、植物、微生物5個(gè)方面的影響因子與AOA，AOB豐度進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。其中地理因子選擇海拔高度；氣候因子選擇年均溫和年降水；土壤因子選擇土壤總有機(jī)碳含量、土壤容重和土壤pH；植物因子選擇地上生物量和地下生物量；微生物因子選擇細(xì)菌和真菌豐度、微生物生物量碳和微生物生物量氮含量。結(jié)果表明AOA豐度與海拔高度、土壤總有機(jī)碳含量、植物地下生物量、細(xì)菌和真菌豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與年均溫、土壤容重和土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)；AOB豐度與細(xì)菌和真菌豐度、微生物生物量碳含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與土壤總有機(jī)碳、微生物生物量氮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與年均溫呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

表3 地理、氣候和土壤因子與AOA，AOB豐度的Pearson相關(guān)分析

表4 植物和微生物因子與AOA，AOB豐度的Pearson相關(guān)分析

3 討論

3.1 氨氧化微生物功能基因豐度在不同草地類(lèi)型的分布特征

本研究結(jié)果表明內(nèi)蒙古3種不同草地類(lèi)型土壤中AOA豐度均顯著高于AOB的豐度。Leininger等研究發(fā)現(xiàn)，原始土壤和農(nóng)業(yè)土壤中AOA的豐度是AOB豐度的3000倍[10]。Adair等發(fā)現(xiàn)AOA豐度是AOB豐度的17～1 600倍[16]。在森林、草地以及海洋等生態(tài)系統(tǒng)中的研究表明，AOA豐度高于AOB豐度[17-19]。AOA的豐度雖然比AOB的豐度高，但是否在硝化過(guò)程中發(fā)揮作用還需要與硝化速率建立關(guān)系來(lái)判斷[20]，因此僅利用AOA豐度推測(cè)硝化作用的大小存在一定的局限性。在對(duì)我國(guó)北方四類(lèi)土壤中AOA和AOB的活性與硝化作用關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)：在氨氮含量較高的濕地土壤中氨氧化速率由AOB主導(dǎo)，而在氨氮含量較低的草原土壤、農(nóng)田土壤中氨氧化速率則由AOA主導(dǎo)[21]。本研究選區(qū)的樣地均為天然草地，AOA與AOB豐度結(jié)果與已有研究一致，即AOA的豐度高于AOB的豐度。3種不同草地類(lèi)型中，AOA豐度變化趨勢(shì)為典型草原>草甸草原>荒漠草原。由于不同草地類(lèi)型所處地理位置的差異以及不同的經(jīng)緯度和海拔高度對(duì)年均溫的影響，造成了不同草地類(lèi)型土壤微生物組成與結(jié)構(gòu)的差異，從而影響了AOA和AOB豐度的差異。

3.2 不同草地類(lèi)型AOA，AOB豐度的控制因子解析

通過(guò)分析3種草地的地理因子、氣候條件、土壤理化性質(zhì)、植被生產(chǎn)力及微生物特征5類(lèi)影響因子與AOA豐度的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)海拔及其主導(dǎo)的年均溫與AOA豐度具有顯著的相關(guān)性。已有的研究表明土壤pH值是驅(qū)動(dòng)AOA和AOB分布的主要因子[22-23]，與本研究結(jié)果存在差異，這可能是因?yàn)楸狙芯空{(diào)查的3種草地類(lèi)型中，土壤pH值呈中性或弱堿性，所以沒(méi)有與AOA和AOB的分布建立起顯著的關(guān)系。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，在降水梯度上AOA并沒(méi)有表現(xiàn)出與水分顯著的相關(guān)性，這與本研究取樣樣帶有關(guān)，由于取樣年是一個(gè)比較干旱的年份，低于常年平均降水量，而本研究的草地土壤都是中性偏堿，因此AOB在樣帶土壤的硝化作用中發(fā)揮著積極的作用，導(dǎo)致AOA與年平均降水量關(guān)系不顯著。另外，分析不同草地類(lèi)型的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在草甸草原和典型草原，土壤總有機(jī)碳含量對(duì)AOA的豐度具有顯著影響；在荒漠草原，年均溫和銨態(tài)氮含量起到了重要作用。在草甸草原影響AOB豐度的主導(dǎo)因子為微生物生物量碳含量；典型草原的主導(dǎo)因子為年均降水量；荒漠草原的主導(dǎo)因子為地上生物量及土壤銨態(tài)氮含量。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，AOB豐度與年均溫呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，與在貢嘎山的研究結(jié)果不一致。貢嘎山草地的研究結(jié)果表明，隨著海拔的上升，溫度下降，土壤微生物活性降低，導(dǎo)致AOA，AOB豐度降低[24]。因此，在內(nèi)蒙古草原，干旱年份的土壤溫度是導(dǎo)致AOA和AOB豐度在不同草地類(lèi)型產(chǎn)生差異的主要原因，同時(shí)也反映了地理因子在調(diào)控土壤微生物的空間分布方面發(fā)揮著重要作用。本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)植物地上生物量與土壤AOA和AOB的豐度具有顯著的相關(guān)性，而AOA和AOB參與的硝化過(guò)程為植物提供了可利用氮，因此需要繼續(xù)深入挖掘植物與參與氮轉(zhuǎn)化的土壤微生物的關(guān)系。

3.3 研究展望

本研究表明AOA的豐度與海拔呈顯著正相關(guān)，而AOB豐度與海拔高度的關(guān)系不顯著。已經(jīng)證實(shí)AOA對(duì)逆境的抵抗力更強(qiáng)[25-26]，而AOB對(duì)于溫度、降水及養(yǎng)分條件的變化更敏感[27]，所以AOB豐度與地理因子之間的關(guān)系需要進(jìn)一步深入探究。在自然生態(tài)系統(tǒng)，多重復(fù)雜的影響因子難以區(qū)分，因此單獨(dú)分析某個(gè)影響因子的作用不容易實(shí)現(xiàn)，利用控制試驗(yàn)可以在某種程度實(shí)現(xiàn)因子的區(qū)分。未來(lái)利用高通量測(cè)序分析AOA，AOB的群落組成與結(jié)構(gòu)，與氮轉(zhuǎn)化過(guò)程相結(jié)合，探究不同土壤環(huán)境、地理因素等條件下AOA，AOB的種群變化、物種多樣性，能夠更加明確區(qū)域氨氧化微生物的優(yōu)勢(shì)物種。針對(duì)內(nèi)蒙古典型草原氨氧化微生物的研究現(xiàn)狀，需要運(yùn)用高通量測(cè)序和宏基因組測(cè)序的技術(shù)手段，獲得更加準(zhǔn)確和全面的微生物數(shù)據(jù)，從而探明內(nèi)蒙古草原不同草地類(lèi)型土壤微生物參與氮循環(huán)過(guò)程的異同。

4 結(jié)論

在3種草地類(lèi)型中AOA豐度均顯著高于AOB豐度。不同草地類(lèi)型其中AOA豐度變化趨勢(shì)為典型草原>草甸草原>荒漠草原，其中地理因素及其所引起的溫度水分變化影響了氨氧化微生物的活性，也對(duì)AOA和AOB豐度產(chǎn)生了影響，AOA和AOB豐度受多種因素綜合控制，未來(lái)研究土壤功能微生物應(yīng)該在大的時(shí)間尺度和空間尺度展開(kāi)更加具體的研究，將草地土壤功能微生物與養(yǎng)分循環(huán)過(guò)程建立關(guān)聯(lián)，為預(yù)測(cè)草地土壤氮素的可利用性和生產(chǎn)力提供依據(jù)。