張銀翠， 姚 拓， 趙桂琴， 徐 茜， 王振龍， 包 康， 撖冬榮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070)

土壤鹽漬化是干旱半干旱地區(qū)作物減產(chǎn)的主要因素[1]。我國干旱區(qū)鹽漬化土壤面積大，分布廣，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展。解決該問題的傳統(tǒng)方法是培育耐鹽品種，但往往不能有效改善。相比之下，由于微生物對植物具有顯著有益作用，利用微生物改良鹽堿地以及提高植物抗逆性越來越受到人們關(guān)注[2]。大多植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)生長于中性環(huán)境，難以在鹽堿環(huán)境中生存，則導(dǎo)致非耐鹽促生菌菌肥在鹽堿地不能發(fā)揮促進(jìn)植物生長的作用[3]，因此需要篩選耐鹽PGPR，為鹽堿地制作有效的微生物肥料。黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)是耐鹽抗旱灌木，在我國西北荒漠地區(qū)分布廣泛[4]，多年來一直是該地區(qū)的建群種[5]，在干旱、鹽堿地區(qū)可作為土壤改良的物種，黑果枸杞根際促生菌可能具備高耐鹽性，因此，其PGPR的篩選對耐鹽微生物資源開發(fā)具有重要意義。

植物根際促生菌是存在于植物根際的一類能夠促進(jìn)和保護(hù)植物生長發(fā)育的有益菌，促使植物適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境[6]，但PGPR的促生特性受到環(huán)境因素，尤其是各類脅迫的嚴(yán)重影響，Upadhyay等發(fā)現(xiàn)PGPR隨鹽度增加失去了對植物的促生能力[7]。目前有研究表明將耐鹽PGPR接種于作物的種子或幼苗后，可有效緩解鹽脅迫對作物造成的傷害[8]，如在鹽脅迫下將Bacillussp. SR-2-1/1和Bacillussp. SR-2-1接種于馬鈴薯根際，可調(diào)節(jié)植物的離子吸收(增加K+和Ca2+吸收以及減少Na+吸收)達(dá)到緩解鹽脅迫的作用[1]。耐鹽菌(0%～20% NaCl)Klebsiellasp.兼具多種促生特性，可通過改善燕麥幼苗的生化和生理狀況，幫助其提高NaCl脅迫的耐受水平[10]。迄今為止，許多研究表明耐鹽PGPR在減輕不同作物鹽脅迫上都有重要作用，如小麥和大豆等[10,11]，目前關(guān)于促生菌促進(jìn)植物耐鹽性的研究多集中于植物地上部分的分析，對根系研究相對較少。

根是植物在長期適應(yīng)陸生生活環(huán)境中逐漸發(fā)展和完善的營養(yǎng)器官，具有固定植物，吸收、輸導(dǎo)土壤中的水分養(yǎng)分，合成和儲藏營養(yǎng)物質(zhì)，繁殖等多方面的功能。因而根系無論對植物基本的生長發(fā)育還是對植物響應(yīng)外界環(huán)境都至關(guān)重要[12]，根系表現(xiàn)型的適應(yīng)性是對土壤環(huán)境條件變化的反應(yīng)[13]，根系形態(tài)決定植物對土壤水分和養(yǎng)分的吸收利用，從而影響植物地上部功能的發(fā)揮[14]。根系形態(tài)學(xué)特征包括根形態(tài)和根構(gòu)型，根系形態(tài)一般用根的數(shù)量、總根長、根表面積、根體積、根分枝數(shù)、根毛的數(shù)量和長度等參數(shù)來描述，根構(gòu)型是指同一根系中不同類型的根在生長介質(zhì)中的空間造型和分布[15]。研究表明根長、根重和吸收面積等指標(biāo)在一定程度上能反映根構(gòu)型[16]。

燕麥(AvenasativaL.)是一種重要的飼料作物，盡管研究表明其具有一定的耐鹽性，但與大麥、小麥和苜蓿等其他作物相比，對鹽分更為敏感[9]。本研究通過從前期分離自黑果枸杞根系的菌株中重篩優(yōu)良菌株并分類鑒定，探究鹽脅迫下接種PGPR對燕麥根系形態(tài)的影響，以期為耐鹽促生菌的開發(fā)篩選菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株 對照菌株醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)P19由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供，溶解無機磷量254.0 μg·mL-1，溶解有機磷量35.5 μg·mL-1，固氮酶活性864.9 nmol·mg-1protein·h-1。

1.1.2供試種子 供試燕麥為‘白燕7號’，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院惠贈。

1.1.3主要培養(yǎng)基 無機磷培養(yǎng)基(Pikovskaky，簡稱PKO)，金氏(King)培養(yǎng)基[17]；LB培養(yǎng)基；固氮培養(yǎng)基(Nitrogen free medium,NFM)[18]。

1.2.1促生菌篩選 將前期分離保存的菌株在LB培養(yǎng)基中活化，依次接種于PKO和NFM培養(yǎng)基，篩選出現(xiàn)溶磷圈及在NFM培養(yǎng)基上生長快速的菌株，測定以下特性。

1.2 方法

1.2.2菌株促生特性測定 溶無機磷量：菌株接種于無機磷(PKO)液體培養(yǎng)基，于28℃，140 r·min-1的搖床上培養(yǎng)10天。培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液在4℃，10 000 r·min-1條件下離心15 min，收集上清液，用鉬藍(lán)比色法測定磷含量[18]。采用乙炔還原法檢測菌株固氮酶活性[18]。分泌IAA量采用salkowski比色法[17]。產(chǎn)ACC(1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid)脫氨酶特性的定性測定采用Penrose和Glick的方法[19]。

1.2.3菌株耐鹽性評價 菌株接種于分別含有1%～15%NaCl的固體LB培養(yǎng)基上，每個處理3次重復(fù)，于28℃下培養(yǎng)5 d，觀察其生長情況。將具有強耐鹽性的促生菌接種于含有1%(LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，3%，5%，7%，9%，11%，13% NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r·min-1培養(yǎng)，24 h測定OD600值[20]。

1.2.4優(yōu)良耐鹽促生菌鑒定 按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取菌株DNA，通用引物27F(5′-GAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′)和 1492r(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rDNA片段，擴增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min共35個循環(huán)。72℃延伸5 min；4℃∞，擴增產(chǎn)物送北京奧科公司測序，將16SrDNA序列在Ezbiocloud網(wǎng)站與細(xì)菌模式菌株的序列進(jìn)行比對，選擇相似性較高的序列下載，使用MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.5菌株促生效果測定 供試種子消毒：挑選顆粒飽滿的燕麥種子，2% NaClO浸泡3 min表面消毒，無菌水沖洗4～5次。置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿上20℃下催芽(發(fā)芽最適溫度15～25℃)。

菌懸液制備：供試菌株接種于裝有100 mL液體LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，28℃,180 r·min-1培養(yǎng)24 h，6 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，用50 mL無菌水沖洗菌體，使菌體懸浮液在OD600達(dá)0.6左右。

半固體培養(yǎng)基制備：配制全量Hoagland營養(yǎng)液，加0.2%瓊脂滅菌，按400 mL每杯分裝于高15 cm，口直徑9 cm，底部直徑5.5 cm的塑料杯(塑料杯在使用前清洗后用75%酒精滅菌，無菌水洗2～3次，置于紫外燈下滅菌10 min)中，用封口膜封口，待冷卻凝固備用。

試驗設(shè)計：采用雙因素完全隨機區(qū)組設(shè)計，因素一為促生菌接種，無菌水為對照，因素二為NaCl濃度，設(shè)3個處理，處理一：無鹽脅迫，不加NaCl；處理二：0.6% NaCl；處理三：0.9% NaCl。每個處理3次重復(fù)。將發(fā)芽后苗長約5 cm的幼苗移栽于制備好的半固體培養(yǎng)基，每杯種4株，24 h后在幼苗根系接種20 μl菌體懸液，22℃，16 h光照8 h黑暗的生長室培養(yǎng)30 d后收獲。測定株高，地上部鮮重，Scan Wizard EZ掃描儀掃描根系。

1.2.6數(shù)據(jù)處理及分析 用Microsoft Excel 2010進(jìn)行原始數(shù)據(jù)整理，SPSS 24.0進(jìn)行單因素方差分析和主成分分析。首先利用Kolmogorov-Smirnov和方差齊性檢驗各指標(biāo)是否為正態(tài)分布和方差齊性，Kolmogorov-Smirnov檢驗表明各指標(biāo)的P值均大于0.05，說明各指標(biāo)均為正態(tài)分布，此外，對這些指標(biāo)進(jìn)行方差齊性檢驗(對部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行了取對數(shù)(ln)處理)，P值均大于0.05，說明符合方差齊性。然后使用單因素方差分析，在P<0.05的顯著水平上采用多重比較檢驗差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離篩選與促生特性

獲得2株目標(biāo)菌株，編號分別為LrM1和LrM2，LrM1解Ca3(PO4)240.0 mg·L-1，分泌IAA 30.0 μg·mL-1，固氮酶活性117.0 nmol C2H4·h-1·mL-1，沒有產(chǎn)ACC脫氨酶的特性；LrM2固氮酶活性280.0 nmol C2H4·h-1·mL-1，解Ca3(PO4)25.6 mg·L-1，無分泌IAA特性，但具有產(chǎn)ACC脫氨酶的特性。

2.2 促生菌的耐鹽性

NaCl濃度低于5%時，隨脅迫程度的增加3菌株的生長受到抑制。NaCl濃度在5%～7%時LrM2和P19的生長出現(xiàn)上升的現(xiàn)象，LrM1在此濃度下仍處于被抑制的狀態(tài)。大于7%時各菌株隨鹽濃度增大OD600值顯著下降，NaCl濃度9%時LrM1幾乎不再生長，OD600值為0.032，11% NaCl脅迫時LrM2和P19 OD600分別為0.012和0.013。

圖1 PGPR在不同NaCl濃度LB培養(yǎng)基中的生長曲線

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株LrM2的16S rDNA序列在Ezbiocloud網(wǎng)站模式菌株比對結(jié)果顯示與Bacillushalotolerans和Bacillusstercoris的相似度最高，均為98.81%；LrM1的16S rDNA序列在Ezbiocloud網(wǎng)站模式菌株比對結(jié)果顯示與Paenibacilluspeoriae和Paenibacilluspolymyxa的相似度最高,分別為99.85%和99.42%。使用MEGA7.0軟件選擇鄰近法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示：LrM1處于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)大的分支中，與Paenibacilluspeoriae聚在一起；LrM2處于芽孢桿菌(Bacillus)大的分支中，與Bacillushalotolerans和Bacillusmojavensis在一個分支上。即LrM1為Paenibacilluspeoriae，LrM2為Bacillussp.。

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.4 不同鹽濃度下促生菌對燕麥根系形態(tài)的影響

2.4.1對燕麥總根長和根直徑的影響 不同鹽濃度下，促生菌對燕麥總根長和根直徑的影響不同(圖3)。無NaCl脅迫時，3株促進(jìn)菌接種顯著促進(jìn)根長的增加，LrM2和P19抑制根直徑的增大(P<0.05)。NaCl濃度為0.6%時，抑制LrM1對根長的促進(jìn)作用，LrM2和P19顯著促進(jìn)根長增加，3株菌對根直徑?jīng)]有影響。NaCl濃度為0.9%時，根長顯著減小，與無鹽脅迫時未接種菌株的處理相比顯著下降71.4%，3個接種處理與對照無差異，LrM1抑制根系的增粗，P19處理的根系直徑最大，但兩者與對照相比都未達(dá)到顯著差異(P<0.05)

圖3 不同NaCl濃度下促生菌對燕麥根長和根系直徑的影響

2.4.2對燕麥根系總表面積和總體積的影響 無NaCl脅迫時，3株促生菌顯著促進(jìn)根系總表面積增大，LrM1和P19顯著促進(jìn)根體積增加(P<0.05)。NaCl濃度為0.6%時，LrM2和P19對根系表面積和體積的增大具有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)。NaCl濃度為0.9%時，3株促生菌處理的根系總表面積和總體積與不接菌處理沒有差異(P<0.05)(圖4)。

圖4 不同NaCl濃度下促生菌對燕麥根表面積和根體積的影響

2.4.3對燕麥根尖數(shù)和分支數(shù)的影響 無NaCl脅迫時僅P19顯著促進(jìn)根尖數(shù)增加，但3個接種處理均促進(jìn)分支數(shù)增加(P<0.05)。NaCl濃度為0.6%時，LrM2和P19顯著促進(jìn)根尖數(shù)和分支數(shù)增加(P<0.05)。NaCl濃度為0.9%時，各接種處理對根尖數(shù)和分支數(shù)均無影響(P<0.05)(圖5)。

圖5 不同NaCl濃度下促生菌對燕麥根尖數(shù)和分支數(shù)的影響

2.5 燕麥根系指標(biāo)的主成分分析及綜合評價

3株促生菌接種后燕麥6個根系指標(biāo)彼此間存在差異，且各指標(biāo)間具有一定相關(guān)性，故采用主成分分析法對6個根系指標(biāo)進(jìn)一步分類簡化。將6個指標(biāo)轉(zhuǎn)化為2個主成分，根據(jù)特征值大于1進(jìn)行提取，特征值大于1的主成分共2個，其方差貢獻(xiàn)率分別為69.8%和22.3%。累積方差貢獻(xiàn)率為92.1%，評價的6項根系形態(tài)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為2個不相關(guān)的綜合指標(biāo)，達(dá)到對原信息降維的目的(表1)。

主成分載荷矩陣反映了各指標(biāo)在主成分中的作用方向及大小程度。由表1可知，第1主成分代表了燕麥根系總信息的69.8%，主要反映根系吸收面積的大小，第2主成分代表了燕麥根系總信息的22.3%，主要反映根系橫向生長和縱向生長情況，但總根長(—0.298)載荷值的絕對值較大，說明鹽脅迫抑制根系的縱向發(fā)展時根的橫向發(fā)展得到促進(jìn)。

表1 燕麥根系指標(biāo)的主成分載荷矩陣、特征值和方差貢獻(xiàn)率

以 2個主成分的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重，構(gòu)建菌株促進(jìn)燕麥耐鹽性的綜合評價模型：Dn=69.761×F1+22.336×F2。根據(jù)上述綜合評價模型計算出各促生菌在鹽脅迫下對燕麥促生作用的綜合評價分值，分值越高，促生作用越強。由表2可知，菌株LrM2的主成分綜合得分最高，LrM1綜合得分最低，即LrM2促生作用最強，LrM1最弱(表2)。

表2 不同菌株促生能力的主成分得分

2.6 PGPR對燕麥株高及鮮重的影響

不同鹽濃度下，促生菌對株高和鮮重影響不同(圖6)。無NaCl脅迫時，LrM2和P19處理顯著促進(jìn)株高和鮮重增大(P<0.05)。NaCl濃度為0.6%時，LrM1和LrM2促進(jìn)株高增大，僅LrM2接種顯著促進(jìn)鮮重增加。NaCl濃度為0.9%時，與未脅迫對照處理相比株高和鮮重分別降低43.8%和67.0% (P<0.05)，各接種處理對對株高及鮮重沒有促進(jìn)作用。

圖6 不同NaCl濃度下促生菌對燕麥株高和葉鮮重的影響

3 討論

本試驗篩選出2株耐鹽促生菌，LrM1在液體LB培養(yǎng)基中鹽濃度為9% 時生長受抑制，LrM2在液體LB培養(yǎng)基中鹽濃度達(dá)11%時生長受抑制，經(jīng)鑒定LrM2為Bacillus屬，LrM1為Paenibacilluspeoriae。鹽生植物根際微生物具較強耐鹽性可能是其根際的離子強度較高，因此根際促生菌也適應(yīng)高鹽度[21]。有研究者從黃河三角洲鹽堿地田菁根際土[20]中分離出一株腸桿菌屬(Enterobacter)耐鹽細(xì)菌，顯著促進(jìn)田菁發(fā)芽率，在玉米盆栽試驗中對光合作用、株高、根長等都有促進(jìn)效果；有濱海鹽生植物補血草根際土壤[22]中分離出高耐鹽性促生菌的報道，目前鮮有黑果枸杞根際耐鹽促生菌的研究。

根系是連接植物地上與地下部分的唯一樞紐，向地上部傳輸水分與營養(yǎng)，最先遭受鹽脅迫，對土壤鹽分的變化敏感度最高。逆境條件下，良好的根系形態(tài)有利于植物對土壤養(yǎng)分的有效吸收及利用，對耐鹽性至關(guān)重要[23-24]。鹽脅迫后根形態(tài)指標(biāo)發(fā)生明顯變化，總根長、根尖數(shù)、根表面積、根系體積和分枝數(shù)均顯著減小，接種促生菌LrM2和P19后對0.6% NaCl脅迫的各根系形態(tài)指標(biāo)有不同程度的促進(jìn)作用，但對0.9%NaCl脅迫的根系形態(tài)參數(shù)沒有影響，可能是該脅迫抑制菌株的促生特性，促生能力減弱，不足以緩解鹽脅迫對燕麥根系生長的抑制[26]。

根系長度的增大有利于提高根系在土壤中的分布范圍，是促進(jìn)植物營養(yǎng)和水分獲取的一個重要策略[25]。根系分支直接關(guān)系到作物對土壤水分的吸收和利用，較大的根系表面積和根體積有利于植物大范圍的吸收水分和養(yǎng)分[27-28]。LrM2和P19顯著促進(jìn)0.6% NaCl脅迫燕麥總根長、表面積、體積、根尖數(shù)和分支數(shù)的增加，兩菌株可能通過改變根系形態(tài)特征，促使植物根系在脅迫環(huán)境中擴展，吸收足夠的水分和營養(yǎng)來保證燕麥的正常生理需求，前人對強抗旱隴中苜蓿根系形態(tài)特征的研究也得出相似的結(jié)果[29]。

PGPR的促生特性受到環(huán)境因素特別是鹽脅迫的嚴(yán)重影響[30],如Muhammad Tahir等[1]發(fā)現(xiàn)，隨著鹽度的增加，兩株芽孢桿菌的促生特性受到嚴(yán)重限制。LrM1耐鹽性較LrM2低，可能其促生特性更易受鹽脅迫的抑制，導(dǎo)致對燕麥的促生作用差。PGPR產(chǎn)生的ACC脫氨酶將植物乙烯前體ACC裂解為氨和α-酮丁酸，降低逆境植物的乙烯產(chǎn)量，從而促進(jìn)根系生長[31-32]。由此可見，菌株LrM2可能有助于植物緩解鹽脅迫，最終改善植物根系以及增加地上生物量。

冠層是水分散失的通道，植物經(jīng)歷持續(xù)水分脅迫后會通過減少地上生物量來降低蒸騰耗水量[33]。鹽脅迫最終導(dǎo)致植物產(chǎn)生生理干旱而出現(xiàn)上述結(jié)果，本試驗接種LrM2顯著促進(jìn)脅迫時根系生長，根系形態(tài)的改變是一種“開源”策略，即植物在逆境下以根系形態(tài)的適應(yīng)性變化保證捕獲最大限度的水源[34]，緩解植物的水分脅迫，地上部分得以生長。Swapnil Sapre等將一株Klebsiellasp.促生菌接種于鹽脅迫的燕麥，也得出顯著促進(jìn)葉鮮重增加的結(jié)果[9]。

主成分分析顯示LrM2在脅迫條件下對根系生長促生作用最顯著，對地上生物量、株高分析結(jié)果和根系分析結(jié)果一致，也是LrM2促生作用最強。雖然P19和LrM2耐鹽性相差不大，但鹽脅迫時接種P19與對照相比沒有促進(jìn)株高增加，且生物量下降，可能是P19在脅迫條件下能生長，但失去對燕麥的促生作用。綜上所述,有望將LrM2用于制作鹽堿地微生物肥料，但應(yīng)用方面還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

菌株LrM2具固氮、溶磷和產(chǎn)生ACC脫氨酶等促生特性，且耐鹽性較高，顯著促進(jìn)0.6%NaCl脅迫燕麥的地上生物量和株高增加，明顯改善總根長、根表面積、根體積、分支數(shù)和根尖數(shù)等形態(tài)參數(shù)，有開發(fā)成鹽堿地微生物肥料的潛力。