孟金柱，吳震洋，安清明，趙園園*

（1.銅仁學(xué)院貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州銅仁 554300；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

豬肉的品質(zhì)受多方面因素的影響，如品種、營(yíng)養(yǎng)、屠宰時(shí)的應(yīng)激程度、豬肉的保鮮方式等，而豬肉本身的理化特性是決定其品質(zhì)的根本因素。在很大程度上，豬肉的肌纖維類型及組成決定其理化特性，并進(jìn)一步影響其品質(zhì)[1]。肌肉由肌細(xì)胞組成，由于肌細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)，呈纖維狀，因此也稱為肌纖維。肌纖維由肌膜、肌漿和肌絲等構(gòu)成。肌肉收縮是細(xì)肌絲和粗肌絲的相對(duì)滑動(dòng)導(dǎo)致的，由2 條重鏈和多條輕鏈構(gòu)成的肌球蛋白在該過(guò)程中承擔(dān)著分子馬達(dá)的作用[2-3]。哺乳動(dòng)物的肌纖維根據(jù)肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain, MyHC）異構(gòu)體的不同分為4種類型，即慢速氧化型（Ⅰ型）、快速氧化型（ⅡA型）、中間型（ⅡX 型）和快速酵解型（ⅡB 型）。其中：Ⅰ型肌纖維因含有較多的肌紅蛋白而顏色紅潤(rùn)，同時(shí)也含有較多的線粒體，主要進(jìn)行有氧代謝，為慢氧化纖維，直徑較小。ⅡB型肌纖維顏色蒼白，因糖原和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）酶系含量較高，主要依靠糖酵解供能，直徑較大。ⅡA和ⅡX型肌纖維的理化特性則介于上述兩者之間[4]。

肌肉中肌纖維的組成和類型對(duì)肉品質(zhì)都有很大的影響，如：肌纖維橫截面積越大，肉質(zhì)性狀越差[5]；肌肉中ⅡB型肌纖維所占比例較高時(shí)，pH下降較快，易產(chǎn)生白?。╬ale,soft and exudative,PSE）肉，而Ⅰ型肌纖維的比例與pH 呈正相關(guān)[6]。肉色與肌纖維中的肌紅蛋白含量直接相關(guān)，Ⅰ型肌纖維中肌紅蛋白含量最高，又被稱為紅肌纖維，而ⅡB型肌纖維顏色蒼白，又被稱為白肌纖維，因此，Ⅰ型肌纖維所占比例較高時(shí)，肉質(zhì)紅潤(rùn)，肉色評(píng)分較高[7]。肌纖維直徑影響肌肉嫩度，ⅡB 型肌纖維直徑和橫截面積較大，在肌肉中所占比例較高時(shí)，肌肉的剪切力增加，嫩度降低[8]。肌內(nèi)脂肪含量與Ⅰ型肌纖維的含量呈正相關(guān)[9]，原因在于Ⅰ型肌纖維包含更多的中性脂質(zhì)，同時(shí)，Ⅰ型肌纖維中含有的高水平的磷脂質(zhì)與肉的多汁性呈正相關(guān)[10]。

黔北黑豬主要生長(zhǎng)在貴州省北部，具有性成熟早、繁殖力強(qiáng)、耐熱耐寒、抗病力強(qiáng)、儲(chǔ)脂能力強(qiáng)、肉質(zhì)好的特性[11]，但由于其生長(zhǎng)速度緩慢，經(jīng)濟(jì)效益低，近年來(lái)數(shù)量銳減。豬背最長(zhǎng)?。╨ongissimus dorsi muscle,LDM）主要由ⅡB型肌纖維構(gòu)成，腰大?。╬soas major muscle,PMM）則由較多的ⅡA 型肌纖維和ⅡX 型肌纖維及少量的ⅡB 型肌纖維構(gòu)成，相比較而言，PMM 具有更好的肉品質(zhì)，肉色鮮紅，脂肪含量高[10]。本研究通過(guò)檢測(cè)黔北黑豬LDM 和PMM中脂肪含量，結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)這2種肌肉中的差異表達(dá)基因，并利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)這些基因的功能進(jìn)行分析，擬篩選出與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的關(guān)鍵基因并加以驗(yàn)證，旨在揭示黔北黑豬肌內(nèi)脂肪沉積的分子機(jī)制，為黔北黑豬的保護(hù)、開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

從貴州省德江縣農(nóng)祥牧業(yè)發(fā)展有限公司選取5頭健康的12 月齡黔北黑豬，屠宰后分別取2 cm×1 cm×1 cm 大小的位于最后肋附近的LDM 和倒數(shù)第4 肋附近的PMM 各5 塊，放入1.5 mL 離心管，然后置于液氮中進(jìn)行冷凍保存。本研究中所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都遵循國(guó)家有關(guān)法律和法規(guī)中規(guī)定的動(dòng)物福利和倫理原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肌肉組織中脂肪含量測(cè)定

采用索氏抽提法，稱取5 g肉樣放入濾紙筒，然后將濾紙筒放入索氏抽提器的抽提筒內(nèi)，連接已干燥至恒量的接收瓶，從抽提器冷凝管上端加入無(wú)水乙醚，水浴加熱，使無(wú)水乙醚不斷回流抽提10 h。取下接收瓶，回收無(wú)水乙醚，待接收瓶?jī)?nèi)溶劑剩余1～2 mL時(shí)在水浴鍋上蒸干，再于（100±5）℃條件下干燥1 h，放入干燥器內(nèi)冷卻0.5 h 后稱量。重復(fù)以上操作直至恒量，計(jì)算脂肪含量。

1.2.2 總RNA 提取、純化、建庫(kù)和測(cè)序

黔北黑豬LDM 和PMM 中的總RNA 采用購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司的Trizol（貨號(hào)：15596018）提取，隨后用購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司的RNeasy Mini 試劑盒（貨號(hào)：74104）純化，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，最后，采用購(gòu)自美國(guó)Thermo公司的NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)量其濃度。每個(gè)樣本取3 μg 總RNA 用于建庫(kù)和測(cè)序（n=5），委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成，其中測(cè)序采用Illumina Hiseq 2500平臺(tái)進(jìn)行。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及分析

測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)依次通過(guò)FastQC v0.10.8軟件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估并獲得有效讀長(zhǎng)（clean reads），經(jīng)Trinity v0.1.0-alpha 軟件重新組裝后，得到重疊群。使用CLC Genomics Workbench v21.0.2 軟件將重疊群與豬RefSeq 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得注釋基因。利用DESeq2 1.26.0 軟件分析差異表達(dá)的mRNA，并用GOseq 1.15.5 軟件和KOBAS 3.0 軟件對(duì)差異表達(dá)的mRNA 進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）以及京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）信號(hào)通路分析。

1.2.4 脂肪沉積相關(guān)基因的篩選

根據(jù)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）和NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中對(duì)差異表達(dá)的mRNA功能的報(bào)道，篩選脂肪沉積相關(guān)基因。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）驗(yàn)證

為驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)1.2.2節(jié)提取的總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，然后運(yùn)用NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Pick Primer程序設(shè)計(jì)篩選的脂肪沉積相關(guān)基因的特異性引物（表1），交由華大基因公司合成。qRT-PCR 采用北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyScript?Allin-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）試劑盒（貨號(hào)：AE341-02）建立20 μL 反應(yīng)體系：2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物（8 pmol）共0.8 μL，cDNA（100 ng）4 μL 以及ddH2O 5.2 μL。反應(yīng)設(shè)置5個(gè)樣本重復(fù)，4個(gè)技術(shù)重復(fù)，通過(guò)美國(guó)羅氏Light Cycler 480 熒光定量?jī)x進(jìn)行反應(yīng)。以β-Actin作為內(nèi)參基因，所有基因的表達(dá)水平用2－ΔΔCT法計(jì)算，并使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

表1 供試引物序列Table 1 Tested primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 黔北黑豬LDM 和PMM 的表型及脂肪含量

通過(guò)索氏抽提法檢測(cè)黔北黑豬LDM 和PMM中的總脂肪含量。結(jié)果表明，PMM 中的總脂肪含量極顯著高于LDM（P＜0.01），LDM 的顏色較為明亮，而PMM呈暗紅色（圖1）。

圖1 黔北黑豬LDM和PMM的表型及脂肪含量Fig.1 Phenotypic traits and fat contents of LDM and PMM of Qianbei black pigs

2.2 黔北黑豬LDM 和PMM 中的差異表達(dá)基因

對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行去雜、注釋和差異表達(dá)分析后，按每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄中每百萬(wàn)映射讀取的片段數(shù)（fragments per kilobase of transcript per million mapped reads, FPKM）＞0.5，|log2（差異倍數(shù)）|＞1 及校正后的P值（q值）＜0.05 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共獲得162 個(gè)差異表達(dá)基因（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2021.01.191），其中96個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，66個(gè)基因表達(dá)上調(diào)（圖2）。

圖2 黔北黑豬LDM和PMM差異表達(dá)基因火山圖Fig.2 Volcano plot of differentially expressed genes in LDM and PMM of Qianbei black pigs

2.3 黔北黑豬LDM 和PMM 中差異表達(dá)基因的GO 功能富集

對(duì)162個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果共分為3 大類，其中，生物學(xué)過(guò)程（biological process）11組，細(xì)胞組分（cellular component）7組，分子功能（molecular function）8 組。在生物學(xué)過(guò)程中富集最多基因的是心臟肌肉收縮和細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)，在細(xì)胞組分中富集最多基因的是胞質(zhì)和線粒體內(nèi)膜，在分子功能中富集最多基因的是運(yùn)輸活性和血紅素結(jié)合（圖3）。

圖3 黔北黑豬LDM與PMM差異表達(dá)基因GO分析Fig.3 GO analysis of differentially expressed genes between LDM and PMM of Qianbei black pigs

2.4 黔北黑豬LDM 和PMM 中差異表達(dá)基因的KEGG 信號(hào)通路分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14 條信號(hào)通路（圖4），其中參與基因最多的是代謝途徑（15.54%），肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)的通路包括過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR）信號(hào)通路（6.76%）、脂肪酸代謝（4.05%）、脂肪酸降解（3.38%）、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路（3.38%）、非酒精性脂肪肝?。?.05%），參與這些通路的基因包括SLC27A1、FABP3、CPT2、ACSL1、SCD、LPL、NR1H3、PPARA、CPT1B、RXRG、ACADVL、ACAA2、PRKAG2、COX2、COX1、SDHD。

圖4 黔北黑豬LDM與PMM差異表達(dá)基因KEGG通路分析Fig.4 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes between LDM and PPM of Qianbei black pigs

2.5 qRT-PCR 驗(yàn)證分析

利用NCBI 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述脂肪沉積相關(guān)基因的功能進(jìn)行分析，結(jié)果篩選出6 個(gè)脂肪沉積相關(guān)基因，即LPL、SDHD、PPARA、COX2、PRKAG2和SCD。通過(guò)qRT-PCR對(duì)這6個(gè)基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果（圖5）表明，這6個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)跟高通量測(cè)序結(jié)果一致：LPL、PPARA和COX2在LDM 中的表達(dá)量顯著或極顯著低于PMM（P＜0.05或P＜0.01），SDHD的表達(dá)量也呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，但差異不顯著；PRKAG2和SCD在LDM 中的表達(dá)量顯著或極顯著高于PMM（P＜0.05或P＜0.01）。

圖5 肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)基因在黔北黑豬LDM與PMM中的相對(duì)表達(dá)情況Fig.5 Relative expression levels of intramuscular fat deposition related genes in LDM and PMM of Qianbei black pigs

3 討論

與大白豬和長(zhǎng)白豬等引進(jìn)品種相比，我國(guó)本地豬種肉質(zhì)好，主要表現(xiàn)為顏色鮮紅、無(wú)PSE肉，保水力好，肌纖維直徑較低、密度大，肌內(nèi)脂肪含量高[12]。肌內(nèi)脂肪含量是豬肉嫩度、大理石紋、多汁性、風(fēng)味等的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，并且肌內(nèi)脂肪含量與肌纖維類型和組成緊密相關(guān)。Ⅰ型肌纖維中脂肪含量是ⅡB型肌纖維的3倍[13]。以Ⅰ型肌纖維為主的半膜肌比以ⅡB型肌纖維為主的背最長(zhǎng)肌含有更高水平的總脂肪、甘油三酯和磷酸[14]。本研究中，對(duì)LDM 和PMM 的脂肪含量進(jìn)行檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)，PMM 中的脂肪含量極顯著高于LDM。這可能是由于PMM由較多的ⅡA型肌纖維和ⅡX型肌纖維及少量的ⅡB型肌纖維構(gòu)成，而LDM主要由ⅡB型肌纖維組成。

石崗[12]對(duì)深縣豬和杜洛克豬的LDM 進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果獲得282個(gè)差異表達(dá)基因，其中170個(gè)上調(diào)，112個(gè)下調(diào)。王志秀[15]對(duì)滇南小耳豬、藏豬、長(zhǎng)白豬和杜洛克豬進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果在滇南小耳豬-藏豬組和長(zhǎng)白豬-杜洛克豬組中共篩選出差異表達(dá)基因315 個(gè)，其中上調(diào)基因140 個(gè)，下調(diào)基因175個(gè)，并鑒定出27個(gè)與脂肪沉積相關(guān)的基因，主要參與脂肪代謝、脂肪酸合成等過(guò)程。龐喆[16]對(duì)高脂肪組和低脂肪組延邊黃牛的LDM 進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果共獲得38 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因有25個(gè)，下調(diào)基因有13個(gè)。石斌剛[17]在對(duì)不同月齡天祝白牦牛LDM的高通量測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)10個(gè)脂肪沉積相關(guān)的候選基因，其中4 個(gè)上調(diào)，6 個(gè)下調(diào)。本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)，在黔北黑豬LDM 和PMM 中共發(fā)現(xiàn)162 個(gè)差異表達(dá)基因，其中96 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，66 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，最終篩選出6 個(gè)與脂肪沉積相關(guān)的候選基因。qRT-PCR 結(jié)果表明，LPL、PPARA、COX2在LDM 中的表達(dá)量顯著或極顯著低于PMM（P＜0.05 或P＜0.01）；PRKAG2和SCD在LDM 中的表達(dá)量顯著或極顯著高于PMM（P＜0.05或P＜0.01）。

脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase, LPL）又被稱為清除因子脂肪酶[18]。研究表明，在豬中LPLmRNA 表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈不同程度的正相關(guān)[19]，其通過(guò)水解脂蛋白中的甘油三酯，為組織利用和儲(chǔ)存提供游離脂肪酸，同時(shí)，通過(guò)調(diào)控肌肉和脂肪中的血漿甘油三酯的表達(dá)來(lái)決定脂肪沉積的程度[20]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARA）通過(guò)抑制1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC）、腫瘤壞死因子受體超家族成員6（tumor necrosis factor receptor superfamily member 6,TNFRSF6/FAS）、硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-coenzyme A desaturase, SCD）等脂肪酸從頭合成基因的表達(dá)，從而抑制甘油三酯的合成，防止甘油三酯的積累[21]?；罨蟮腜PARA，通過(guò)調(diào)節(jié)脂聯(lián)素的活性使胰島素的敏感性增強(qiáng)，進(jìn)一步促進(jìn)脂肪酸氧化酶mRNA的表達(dá)，最終促進(jìn)脂質(zhì)分解代謝[22]。蛋白激酶腺嘌呤核糖核苷酸激活的非催化亞基γ2（protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma 2,PRKAG2）作為腺嘌呤核糖核苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）家族重要的成員，在肌肉脂肪代謝、能量代謝等方面發(fā)揮著巨大作用[23]。JING 等[24]通過(guò)對(duì)高、低剩余采食量的豬骨骼肌進(jìn)行高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，PRKAG2 在骨骼肌能量代謝過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。SCD 在動(dòng)物肌肉組織中大量表達(dá)并參與單不飽和脂肪酸的形成，SCD基因的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)甘油三酯和脂肪酸的合成[25]。鈣離子濃度對(duì)脂質(zhì)含量具有一定的調(diào)節(jié)作用，其濃度的升高會(huì)促進(jìn)SCD基因的表達(dá)，使脂肪酸的合成量進(jìn)一步增加[26]。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)檢測(cè)黔北黑豬LDM 與PMM 中的總脂肪含量，發(fā)現(xiàn)PMM 中的脂肪含量極顯著高于LDM。利用高通量測(cè)序在2種肌肉中獲得162個(gè)差異表達(dá)基因。通過(guò)GO、KEGG 分析并結(jié)合功能查找，共篩選出6個(gè)與脂肪沉積相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中LPL、PPARA、COX2、PRKAG2和SCD在LDM和PMM 中的表達(dá)情況存在顯著差異，推測(cè)這些基因能夠促進(jìn)或抑制肌內(nèi)脂肪沉積。本研究結(jié)果為深入探究黔北黑豬肌內(nèi)脂肪沉積的分子機(jī)制以及對(duì)黔北黑豬的保護(hù)、開發(fā)和利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。