羅艾，龔桂芝，彭祝春，楊程，常珍珍，洪棋斌

（西南大學(xué)柑桔研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712）

柑橘（CitrusL.）屬于蕓香科（Rutaceae）柑橘亞科（Aurantiodeae），在我國的栽種歷史久遠，栽培種類眾多，同時也是國內(nèi)栽培面積和產(chǎn)量最大的水果，具有重要的經(jīng)濟價值[1-2]。柑橘因富含維生素C、類胡蘿卜素和黃酮類化合物等功能成分而具有較高的健康屬性，且儲藏運輸方便、加工特性突出，是全世界重要的水果商品，其生產(chǎn)和消費量一直在不斷增加[3]。近年來，隨著社會經(jīng)濟的快速增長和消費水平的提高，人們對柑橘產(chǎn)品的要求也在不斷改變和提高，對柑橘育種提出了更高要求。但柑橘是木本植物，具有樹體大、童期長、遺傳高度雜合等生物學(xué)特性，再加上一些品種的無融合生殖特性、雌性敗育和/或雄性敗育的存在，影響了研究者對其性狀，尤其是數(shù)量性狀的遺傳研究，極大阻礙了柑橘育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展[4-5]。分子標(biāo)記輔助選擇（marker-assisted selection, MAS）以及轉(zhuǎn)基因育種（genetically modified breeding, GMB）技術(shù)在植物研究中的廣泛應(yīng)用，為加快柑橘等長周期的果樹育種帶來了希望[6]。針對柑橘的品質(zhì)和產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀開展研究，發(fā)掘其相關(guān)的調(diào)控基因或相關(guān)標(biāo)記，成為利用新技術(shù)提高柑橘育種效率的重要基礎(chǔ)。

果實大小是柑橘的重要農(nóng)藝性狀，不僅影響柑橘產(chǎn)量和外觀品質(zhì)，也影響生產(chǎn)成本和消費者的選擇，過小的果實采摘成本高，過大的果實消費者一次性食用不完，影響消費者的購買欲望，因此，日本柑橘育種者在寬皮柑橘育種中，提出了果實大小介于150～300 g 的育種目標(biāo)[7]。果實大小相關(guān)性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，受到內(nèi)外多種因素的影響，研究難度不小，目前關(guān)于其遺傳調(diào)控的機制尚不清楚，更缺乏可供育種利用的調(diào)控基因或分子標(biāo)記。因此，本研究基于培育多年的‘晚蜜2號’和‘梨橙2號’雜交的F1代分離群體，借助果實大小和質(zhì)量的數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus,QTL）定位，發(fā)掘相關(guān)的調(diào)控基因或相關(guān)標(biāo)記，進而為柑橘果實大小和質(zhì)量的遺傳改良提供分子輔助育種工具和理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分離群體是以‘晚蜜2號’[Citrus unshiu(Mark.)Marc.×C.sinensis(L.)Osb.]為母本、‘梨橙2 號’[C.sinensis(L.)Osb.]為父本雜交所得到的94株F1代材料?！砻? 號’為尾張溫州蜜柑和細葉薄皮甜橙雜交所得，較抗寒，雄性部分敗育，果實外觀呈扁圓形，果皮橙紅，種子數(shù)目較少，單胚?！娉?號’為甜橙品種，果實外觀呈梨形，果皮橙色，種子少，單胚。

分離群體材料和親本均采用飛龍枳作砧木，區(qū)組重復(fù)，2012年定植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所育種圃砧木比較試驗園，到2021年完成測試時已是11 年生樹，但仍有部分材料未正常結(jié)果，本研究選擇結(jié)果較多的材料，總計61 株（2 株親本和59 株雜交后代）進行果實性狀的觀測。

1.2 試驗方法

1.2.1 分子標(biāo)記分析和遺傳圖譜的構(gòu)建

提取分離群體和親本的DNA 以開展分子標(biāo)記檢測。DNA提取、保守同源序列（conserved ortholog sequence, COS）和微衛(wèi)星標(biāo)記即簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat, SSR）分析參考王炯[8]的方法。采用JoinMap?4.0 軟件[9]進行分離群體的遺傳連鎖分析。

1.2.2 柑橘果實大小和質(zhì)量測定及遺傳分析

于2020 年柑橘果實成熟期，每株選取6 個果實，分別使用電子天平和游標(biāo)卡尺對單果質(zhì)量、縱橫徑進行測量。每個果實重復(fù)測定3 次，最后取平均值作為后續(xù)試驗分析。親本單果質(zhì)量和縱橫徑的遺傳傳遞力（Ta）計算公式[10]為：Ta=雜交后代性狀均值/雙親性狀均值×100%。

1.2.3 數(shù)量性狀位點（QTL）分析

利用SPSS 22.0 軟件對果實縱橫徑和質(zhì)量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，繪制頻率分布直方圖。基于構(gòu)建的連鎖圖譜，采用MapQTL?6.0[11]軟件對果實的單果質(zhì)量和縱橫徑進行QTL定位分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建結(jié)果

本試驗中，雜交親本均為遺傳學(xué)上高度雜合的材料，符合JoinMap?4.0軟件的“Cross Pollinator,CP”模式，CP模式雜交后代會表現(xiàn)出5種分離類型：ab×cd、ef×eg、hk×hk、lm×ll、nn×np。對本試驗中雜交分離群體的電泳結(jié)果進行解讀分析，可以比較準(zhǔn)確地辨識出后4種分離類型，但未發(fā)現(xiàn)“ab×cd”類型。不同分離類型的代表性樣品電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同分離類型的代表性擴增檢測結(jié)果Fig.1 Representative amplification testing results of different segregation types

研究發(fā)現(xiàn)，在所有標(biāo)記中共有108個（約54%）標(biāo)記表現(xiàn)出明顯的偏分離現(xiàn)象，而且大多偏向母本（P＞0.05，表1）。標(biāo)記偏分離比率大于CURTOLO等[12]和王炯[8]構(gòu)建的柑橘遺傳連鎖圖譜的偏分離比率（43%和45%，P=0.05），小于DE OLIVEIRA等[13]構(gòu)建的柑橘連鎖圖譜中的偏分離比率（61%，P=0.05）。

表1 標(biāo)記的分離類型Table 1 Segregation types of all markers

采用比較嚴格的作圖標(biāo)準(zhǔn)似然函數(shù)比值的對數(shù)[logarithm (base) of odds, LOD]構(gòu)建遺傳連鎖圖譜（LOD=6），并將少數(shù)未入群的標(biāo)記按“最強關(guān)聯(lián)組（strong cross linkage group,SCL-Group）”進行歸群后，得到本研究的柑橘遺傳連鎖圖譜。該圖譜包含201 個COS 和SSR 標(biāo)記、10 個連鎖群，總長度為1 194.5 cM，標(biāo)記間平均距離約為5.9 cM。分析發(fā)現(xiàn)，連鎖群的主位標(biāo)記與測序C.clementina（克里邁?。┑腟caffold順序號具有一致性。以親本‘晚蜜2號’和‘梨橙2 號’的拼音首字母縮寫及測序C.clementina的Scaffold 順序號將連鎖群命名為WL1～WL9；而COSC9 系列標(biāo)記在標(biāo)準(zhǔn)作圖連鎖過程中不能自然整合到同一連鎖群，而是分成2個連鎖群，本文將其分別命名為WL9-1和WL9-2（圖2）。

通過與其他已發(fā)表的柑橘遺傳連鎖圖譜[3,7-8,12]進行對比，發(fā)現(xiàn)分離群體、標(biāo)記類型及數(shù)量對構(gòu)建的圖譜影響很大。RUIZ 等[14]利用隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）、限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）和其他一些分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了柑橘遺傳圖譜，但其所構(gòu)建的連鎖群數(shù)與柑橘染色體數(shù)目不一致，同時還存在圖距大、基因組覆蓋率低等問題。近年來，研究者希望采用單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）標(biāo)記構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖，也同樣出現(xiàn)了連鎖群數(shù)與染色體數(shù)不一致的情況，而且還存在分型單一、后續(xù)分析驗證較難等問題。王炯[8]在2017年構(gòu)建了含240個COS和SSR標(biāo)記、9個連鎖群，總長為1 186.4 cM的遺傳連鎖圖譜，但其連鎖群1的密度很低。本研究采用其反交材料構(gòu)建圖譜，構(gòu)建了一張包含201個標(biāo)記、10個連鎖群，總長為1 194.5 cM的柑橘遺傳連鎖圖譜，增加了連鎖群1的密度，其中多數(shù)相同的標(biāo)記仍然定位到同一連鎖群上，少數(shù)標(biāo)記在連鎖群上的排列順序有差異或者定位到了不同的連鎖群上（圖2）。

圖2 基于COS和SSR標(biāo)記構(gòu)建的連鎖圖譜Fig.2 Linkage maps constructed by COS and SSR markers

2.2 柑橘果實大小和質(zhì)量的相關(guān)性及遺傳分析

對分離后代的果實質(zhì)量、橫縱徑的均值進行比較，發(fā)現(xiàn)其均低于親中值和親本值，表現(xiàn)為趨小變異。親本果實大小和質(zhì)量的遺傳傳遞力由大到小排列為橫徑＞縱徑＞果實質(zhì)量，其中果實質(zhì)量的遺傳傳遞力為74%，橫徑的遺傳傳遞力為93%（表2）。這3 個性狀的變異大，均出現(xiàn)明顯高于或低于親本個體的情況，表明控制柑橘果實大小和質(zhì)量的增減效基因在雙親中分散分布，因此，可以通過基因重組等方式培育超親后代。

對測試的各性狀進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，果實質(zhì)量與橫縱徑均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.824 和0.835，說明果實質(zhì)量受縱徑影響更大。橫徑和縱徑也呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.756（表3）。該結(jié)果與前人研究報道[12]一致。

2.3 柑橘果實大小和質(zhì)量的數(shù)量性狀位點（QTL）定位分析

對分離群體的果實質(zhì)量、橫徑、縱徑數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)三者均為連續(xù)正態(tài)分布（圖3），果實質(zhì)量、橫徑和縱徑的偏離度系數(shù)分別為1.04、0.27 和1.04，峰度系數(shù)分別為0.46、1.68 和0.65（表2），絕對值均低于2，因此，可以對其進行QTL定位。

圖3 果實質(zhì)量和橫縱徑在分離群體中的頻率分布Fig.3 Frequency distributions of fruit mass,transverse and longitudinal diameters in the segregation populations

表2 親本及分離群體的果實質(zhì)量和橫縱徑分析Table 2 Analysis of the fruit mass,transverse and longitudinal diameters of parents and the segregation populations

基于構(gòu)建的連鎖圖譜，采用MapQTL?6.0 軟件的區(qū)間作圖法對柑橘果實的質(zhì)量、橫徑、縱徑進行QTL 定位，檢測到與單果質(zhì)量相關(guān)的4 個QTL（LOD≥4.39），與果實橫徑相關(guān)的3 個QTL（LOD≥3.08），與縱徑相關(guān)的4 個QTL（LOD≥3.70）（表4）。由圖4 可見：這些QTLs 均位于WL3 和WL8 連鎖群上，表現(xiàn)出集聚性；從標(biāo)記界定的QTL區(qū)間來看，果實質(zhì)量與縱徑在連鎖群WL8 上有重疊的基因組區(qū)間（CSSRC9-18～COSC8-6），也表現(xiàn)出一致性。這可能與果實質(zhì)量、橫徑、縱徑三者之間具有極顯著正相關(guān)關(guān)系（表3）有關(guān)。

圖4 柑橘果實大小和質(zhì)量QTLs在連鎖圖譜上的定位Fig.4 QTLs locations of citrus fruit size and mass in the linkage map

表3 分離群體果實大小和質(zhì)量的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of fruit size and mass in the segregation populations

表4 柑橘果實大小和質(zhì)量的QTLs分析Table 4 QTLs analysis of citrus fruit size and mass

2.4 柑橘果實大小和質(zhì)量QTL 區(qū)域的功能基因挖掘

以QTL所在的分子標(biāo)記或區(qū)間兩側(cè)的分子標(biāo)記序列選擇C.clementina為參考基因組，在Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/pz/portal.html）網(wǎng)站進行Blast分析，對標(biāo)記所界定的基因組區(qū)間內(nèi)的編碼基因進行功能注釋查詢，初步挖掘到一批可能與柑橘果實發(fā)育有關(guān)的功能基因，部分結(jié)果如表5 所示。進一步選擇LOD 值和貢獻率較高，或在果實質(zhì)量和縱橫徑QTL 定位中均出現(xiàn)的候選區(qū)域開展進一步的基因挖掘分析。qtl8.1（FM）的LOD 值為4.39，qtl8.1（LD）的LOD 值為3.88，均定位于CSSRC9-18～COSC8-6 界定的區(qū)域，對該區(qū)域的序列進行分析發(fā)現(xiàn)：在參考基因組中臨近COSC8-6引物序列的上游，有注釋功能為GATA 轉(zhuǎn)錄因子的功能基因；在臨近COSC8-6 引物序列的下游，有注釋功能為生長素響應(yīng)因子（auxin response factor,ARF）的功能基因。GATA為一類植物轉(zhuǎn)錄因子，能與靶基因啟動子上的WGATAR 區(qū)域結(jié)合，激活或抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控植物的發(fā)育[15]。ARF 是由ULMASOV 等[16]新發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)控生長素響應(yīng)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子家族，能夠特異地與生長素響應(yīng)基因啟動子區(qū)域的生長素響應(yīng)元件結(jié)合。梅麗華[17]研究發(fā)現(xiàn)，番茄ARF 家族成員之一的SlARF10通過控制淀粉合成相關(guān)酶的表達來促進糖類物質(zhì)的積累，在番茄果實發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。說明ARF 可能具有一因多效的性質(zhì)，對果實質(zhì)量、橫縱徑有共同調(diào)控作用。本試驗中，LcSSR130（FM）的LOD 值為5.88，LcSSR130 是基于表達序列標(biāo)簽（expressed sequence tag,EST）開發(fā)的引物，該EST 所在的基因功能注釋為GDSL 酯酶（GDSL esterase）。有研究報道，來自水稻脆葉鞘1突變體BS1的GDSL 酯酶成員是一種次級壁乙酰-木聚糖酯酶，能調(diào)控木聚糖的脫乙酰化，進而導(dǎo)致次生壁發(fā)育受損和異常的多變性表型[18]。柑橘果實中的GDSL酯酶成員也很可能通過動態(tài)微調(diào)多糖的乙?；Y(jié)構(gòu)來發(fā)揮結(jié)構(gòu)調(diào)控作用，從而調(diào)節(jié)細胞壁結(jié)構(gòu)，進而對果實的大小和質(zhì)量產(chǎn)生影響。

表5 與柑橘果實發(fā)育可能相關(guān)的基因Table 5 Genes putatively associated with citrus fruit development

3 討論與結(jié)論

3.1 偏分離標(biāo)記的作圖應(yīng)用

孟德爾分離定律是經(jīng)典遺傳學(xué)的基本原則，能幫助遺傳學(xué)家預(yù)測簡單遺傳性狀的表達情況。人們從20 世紀初就開始研究偏離孟德爾分離預(yù)期的現(xiàn)象，即偏分離現(xiàn)象，主要是配子或合子選擇、種間或種內(nèi)雜交引起染色體重排而導(dǎo)致的。在物種的大多數(shù)遺傳作圖研究中都觀察到了偏分離標(biāo)記[8,10]，其可能會使標(biāo)記之間遺傳距離的估計出現(xiàn)偏差，并可能影響標(biāo)記之間的順序，從而影響表型性狀QTL定位的準(zhǔn)確性。因此，在遺傳作圖中常有將偏分離標(biāo)記舍棄后再進行圖譜構(gòu)建的報道[3,7]。DE OLIVEIRA等[25]通過對僅包含正常分離標(biāo)記圖譜和包含偏分離標(biāo)記的圖譜進行比較發(fā)現(xiàn)，偏分離標(biāo)記一般位于染色體的末端部位，并未顯著改變標(biāo)記的距離。同時，隨著對偏分離的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)偏分離標(biāo)記對QTL定位中的加性效應(yīng)影響較小，并且偏分離標(biāo)記可能與含生物關(guān)鍵遺傳特性的染色體區(qū)域相關(guān)[26]，如果將其排除在遺傳圖譜之外，則無法檢測到一些與生長和成熟相關(guān)的生物學(xué)功能。偏分離標(biāo)記大部分是聚集的，并且每個聚集內(nèi)的標(biāo)記具有相同的偏斜方向，比如多數(shù)位點偏向于同一親本或雜合體，這表明偏分離標(biāo)記是由生物因素引起的[27]。本研究的偏分離標(biāo)記大多偏向于母本，說明來自母本基因型的配子在形成合子時占主導(dǎo)地位。同時，本研究所定位到的QTL 相關(guān)的分子標(biāo)記，比如LcSSR130（FM）、LcSSR120（TD）和COSC8-8（TD）等大多是偏分離標(biāo)記，因此將其用于圖譜的構(gòu)建必不可少。目前，已有關(guān)于偏分離分析模型與軟件的報道，說明大部分的偏分離標(biāo)記確實可以用于遺傳圖譜構(gòu)建，只是需根據(jù)實際情況進行評估和調(diào)整[27]。

3.2 柑橘果實大小和質(zhì)量的QTL 比較

本研究采用的COS 標(biāo)記是根據(jù)測序克里邁丁從頭（de novo）組裝結(jié)果（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）開發(fā)的。因此，得到的連鎖群與克里邁丁參考基因組的染色體順序具有一致性，可以比較全面地與其他研究者基于一致的連鎖群定義而開展的柑橘果實大小和質(zhì)量的QTL 定位進行比較分析。以克里邁丁為參考基因組，GARCíA等[28]檢測到與平均果實大小相關(guān)的3個QTLs，分別分布在V2、V7、V8 連鎖群上；檢測到與平均單果質(zhì)量相關(guān)的2個QTLs，分布在V2和V7連鎖群上。但其報道中并未表明這些位點的LOD 值和貢獻率。YU 等[3]結(jié)合‘Fortune’בMurcott’（Citrus reticulataBlanco）的F1代檢測到3 個與柑橘橫徑相關(guān)的QTLs，3 個與單果質(zhì)量相關(guān)的QTLs，這些位點分布在MUR4.2、MUR8、FOR5.1和FOR9.3連鎖群上，其中只有位于連鎖群FOR5.1 上的FM5.1 和位于MUR8 上的FM8 在2012 年和2013 年均有被檢測到。IMAI 等[7]定位到4 個與柑橘單果質(zhì)量相關(guān)的QTLs，分布在LG3、LG4和LG7連鎖群上，其中只有位于LG4 上的位點FMq3 在連續(xù)2 年里被檢測到。本研究定位到的與果實大小相關(guān)的QTLs 分布在WL3和WL8連鎖群上。綜上所述，在柑橘第3、4和8染色體上可能存在控制果實大小的QTLs，而在第8 染色體上可能存在控制柑橘果實大小的相關(guān)基因，在第3 染色體上可能主要存在與果實質(zhì)量相關(guān)的功能基因。

YU等[3]和IMAI等[7]的研究中，與果實質(zhì)量和橫徑相關(guān)的QTLs 的LOD 值在2.69～3.68 之間，貢獻率在14.9%～33.74%之間；本研究中與果實大小和質(zhì)量相關(guān)的QTLs 的LOD 值在3.08～5.94 之間，貢獻率在19.6%～34.4%之間，研究結(jié)果與前人相近。CURTOLO 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，與柑橘果實橫縱徑相關(guān)的QTLs 的LOD 值雖然都大于5.94，但是其表型變異率最高只有9.7%；GARCíA 等[28]卻沒有報道其定位到的QTLs 的LOD 值和解釋表型變異的決定系數(shù)，因此，其定位到的QTLs還有待考證。BUDAHN等[29]研究表明，超過45%的表型變異是由主要的QTLs 效應(yīng)造成的，而這在本文和以上研究中均沒有觀察到。但也有報道指出貢獻率大于30%即可認為是主效QTLs[30]。因此，對于主效QTLs 的判斷標(biāo)準(zhǔn)還有待進一步探討，但這也說明果實大小和質(zhì)量是由多基因共同控制的。

基因型×環(huán)境互作效應(yīng)對柑橘果實品質(zhì)性狀起著重要作用，基因型×取樣日期對所有柑橘果實品質(zhì)性狀也有顯著影響，特別是柑橘的外部特征比內(nèi)部特征波動更大。YU等[3]使用2年的表型數(shù)據(jù)檢測到與果實直徑和果實質(zhì)量相關(guān)的QTLs有6個，在該研究中，2年里取樣時間和表型材料并不完全相同，所以只有關(guān)于果實質(zhì)量的2 個QTLs 在2 年里被檢測到，而與果實直徑相關(guān)的QTLs 在2 年里均不相同。IMAI等[7]采用3年的表型數(shù)據(jù)定位到與果實質(zhì)量相關(guān)的QTLs 位點有4 個，且只有1 個位點在2 年里被連續(xù)檢測到。CURTOLO 等[12]結(jié)合1 年的表型數(shù)據(jù)，只檢測到3個與果實縱橫徑相關(guān)的QTLs。與以上研究比較，我們對分離群體的果實發(fā)育全程進行了分析測試，發(fā)現(xiàn)到發(fā)育后期，即開花后246—274 d，果實的生長量變化很小，果實大小總體已進入比較穩(wěn)定的狀態(tài)；此外，本研究僅選用果實發(fā)育停滯時段的測試數(shù)據(jù)進行分析，減少了數(shù)據(jù)波動對QTL 定位的影響。本研究定位到了與果實大小相關(guān)的10個QTLs，數(shù)量較多，這可能與我們所研究的分離群體果實大小和質(zhì)量分離比較大有關(guān)，如在本研究中單果質(zhì)量的變化范圍為82.90～266.02 g，變異范圍較大。分離群體中尚有部分未結(jié)果，連鎖圖譜存在標(biāo)記數(shù)目不足，連鎖群間和群內(nèi)分布不均勻等，都對本研究的QTL數(shù)量確定和精準(zhǔn)鑒定等帶來了較大影響。后續(xù)可通過開發(fā)和應(yīng)用更多分子標(biāo)記優(yōu)化遺傳圖譜，對更多結(jié)果個體進行分析以得到更好的QTL 鑒定結(jié)果。在對LOD 值和貢獻率較高，或在果實質(zhì)量和縱橫徑QTL定位中均出現(xiàn)的候選區(qū)域進行基因挖掘時，發(fā)現(xiàn)本研究所定位到的QTL 所在的基因組區(qū)間確實存在對果實發(fā)育和大小產(chǎn)生影響的基因，這些基因?qū)Ω涕俟麑嵈笮『唾|(zhì)量的遺傳和育種的深入研究和應(yīng)用探索具有一定的參考價值。