王海鷗 段肖杰 吳雨龍 賁愛玲 張 偉 華 春

(1. 南京曉莊學院食品科學學院，江蘇 南京 211171；2. 江蘇省高校“特殊生物質(zhì)廢棄物資源化利用”重點建設(shè)實驗室，江蘇 南京 211171；3. 沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧 沈陽 110161)

檸檬(Citruslimon)是世界上繼柑、橙之后的第三大柑橘類水果，已成為當前最受歡迎的水果之一[1-2]。其果實含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如揮發(fā)性風味成分、維生素、氨基酸和酚類物質(zhì)等[3-5]。新鮮檸檬不易貯藏，通常將其干燥加工制成檸檬片、檸檬粉，其中凍干檸檬制品深受消費者喜愛。新鮮檸檬中的揮發(fā)性風味成分主要為單萜、倍半萜、醛、單萜醇和單萜酯等化合物[6-7]，具有濃郁而獨特的天然清香風味，同時可以改善人體循環(huán)系統(tǒng)，增強免疫力，預(yù)防抑郁癥、焦慮癥、神經(jīng)障礙等疾病[8-9]。但這些揮發(fā)性風味成分在檸檬加工過程中容易發(fā)生損失和轉(zhuǎn)化，最終影響加工制品的風味品質(zhì)[10]。

真空凍結(jié)是一種新型快速冷凍技術(shù)。Pisano等[11]研究了一種動力學模型用來預(yù)測真空凍結(jié)凍干甘露醇和蔗糖的產(chǎn)品形態(tài)。王海鷗等[12]將該技術(shù)應(yīng)用于果蔬凍干的凍結(jié)前處理，證實其能夠簡化凍干工藝過程，減少凍干時間。與傳統(tǒng)速凍方式相比，真空凍結(jié)技術(shù)凍結(jié)速度快，凍結(jié)時間短，降溫效果均勻，清潔干凈無污染[13]。但真空凍結(jié)凍干一體化干燥過程中檸檬片的揮發(fā)性風味成分在真空狀態(tài)下會從細胞組織中逸出，造成芳香成分的損失[14]。目前有關(guān)檸檬果實中揮發(fā)性風味成分研究主要集中于果皮組織，但果肉是檸檬果實的最主要可食組織和加工利用部位，占檸檬質(zhì)量的60%以上，其揮發(fā)性風味成分在真空凍結(jié)過程中的變化規(guī)律還有待深入研究。試驗擬以檸檬果肉為研究對象，采用電子鼻(E-nose)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)分析真空凍結(jié)過程中檸檬果肉揮發(fā)性風味物質(zhì)的遷移及變化規(guī)律，旨在為真空凍結(jié)技術(shù)在果蔬加工業(yè)中的實際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

新鮮尤力克檸檬：產(chǎn)地四川安岳，市售；

環(huán)己酮標準品：純度>99.5%，美國Sigma 公司；

便攜式電子鼻傳感器：PEN3型，德國Airsense公司；

真空冷凍干燥機：SCIENTZ-50F型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

GC-MS聯(lián)用儀：GCMS-QP 2010型，日本島津公司；

毛細管色譜柱：HP-5ms型，美國Agilent公司；

磁力加熱攪拌器：PC-620D，美國Corning公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 檸檬果肉制備 將新鮮檸檬清洗干凈，沿軸向切成厚度為3 mm的圓片，去除檸檬片中的皮、籽及囊衣，獲得完整的檸檬果肉備用。

1.2.2 真空凍結(jié) 提前開啟真空冷凍干燥機的制冷裝置使冷阱溫度降到-40 ℃以下，將檸檬果肉樣品鋪放于凍干倉料盤上，設(shè)置真空凍結(jié)時間分別為10，20，30 min。前期[14]研究表明，檸檬果肉真空凍結(jié)30 min后其冷凍溫度接近-30 ℃，達到速凍制品溫度要求。

1.3 指標測定

1.3.1 失水率 隨機選取質(zhì)量約為2 g的檸檬果肉5塊，分別記錄物料真空凍結(jié)前后的質(zhì)量，按式(1)計算真空凍結(jié)失水率。

(1)

式中：

ML——真空凍結(jié)失水率，%；

m0——檸檬果肉塊真空凍結(jié)前質(zhì)量，g；

m1——檸檬果肉塊真空凍結(jié)后質(zhì)量，g。

1.3.2 含水率 參照GB 5009.3—2016的直接干燥法。

1.3.3 E-nose檢測揮發(fā)性風味成分 準確稱取測試樣品2 g，打碎，蒸餾水稀釋10倍，取5 mL樣液于15 mL頂空瓶中，加入轉(zhuǎn)子，用聚四氟乙烯隔墊密封，400 r/min下、50 ℃水浴30 min。將電子鼻采樣抽氣管插入樣品頂空瓶頂部，測定揮發(fā)性成分，每個處理樣品重復(fù)3次。E-nose測試程序參數(shù)設(shè)置：樣品準備時間5 s，測定時間400 s，傳感器清洗時間200 s，載氣流速300 mL/min，進樣流量300 mL/min。PEN3型電子鼻主要是模擬人體嗅覺系統(tǒng)，包含10個金屬氧化物傳感器，各傳感器具體名稱及性能描述如表1所示。

1.3.4 GC-MS測定揮發(fā)性風味成分 準確稱取測試樣品2 g，打碎，蒸餾水稀釋10倍，取5 mL樣液于15 mL頂空瓶中，準確移入2 μL環(huán)己酮作為內(nèi)標物，加入轉(zhuǎn)子，用隔墊密封，將CAR/PDMS/DVB固相微萃取針插入樣品瓶頂空部位，樣品瓶于50 ℃水浴30 min，拔出萃取針插入GC-MS進樣器中，250 ℃解吸5 min，同時啟動儀器采集數(shù)據(jù)。每個處理樣品重復(fù)3次。

表1 電子鼻傳感器名稱及性能Table 1 Names of electronic nose sensors and their performance descriptions

(1)色譜條件：色譜柱為HP-5 ms (30 m×ID 0.25 mm×0.25 μm)分析柱；初始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升溫至230 ℃，保持3 min；載氣為高純He，流速1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；手動進樣。

(2)質(zhì)譜條件：電離化方式EI；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；MS四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍(m/z)30～450；掃描速率5.27次/s。

(3)定性方法：利用GC-MS自帶的NIST圖譜庫對檢測到的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析，取相似性>70的鑒定結(jié)果。相同程序下，用C5～C20正構(gòu)烷烴作為標準，計算樣品中揮發(fā)性風味物質(zhì)的保留指數(shù)(RI)[15]，并結(jié)合文獻[16-18]進行定性，確定相應(yīng)的揮發(fā)性風味物質(zhì)的化學成分。按式(2)計算保留指數(shù)。

RI=100×100n(tx-tn)/(tn+1-tn)，

(2)

式中：

RI——保留指數(shù)；

tx、tn、tn+1——被分析成分和碳原子數(shù)處于n和n+1之間的正構(gòu)烷烴混標標準品(tn

(4)定量方法：以被測樣品中加入內(nèi)標物環(huán)己酮的質(zhì)量和離子流圖上的峰面積作為參照，對各揮發(fā)性風味成分進行半定量分析，按式(3)計算各成分含量。

Ci=(Si×M0)/(S0×Md)，

(3)

式中：

Ci——某種成分含量，mg/g；

Si——某種成分峰面積；

S0——內(nèi)標物峰面積；

M0——加入的內(nèi)標物質(zhì)量，mg；

Md——加入的測試樣品質(zhì)量(由于凍結(jié)過程中物料因水分蒸發(fā)導致其質(zhì)量發(fā)生變化，而干基質(zhì)量不變，為了便于比較揮發(fā)性成分含量，因此Md為物料干基質(zhì)量)，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用電子鼻系統(tǒng)自帶的Winmuster軟件對電子鼻數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)和線性判別分析(LDA)。GC-MS數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件和Origin 8.6軟件進行統(tǒng)計分析和作圖，采用Duncan’s法進行多重比較，顯著性水平P<0.05；運用Permut Matrix 1.9.3進行分層聚類和熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真空凍結(jié)過程中檸檬果肉失水率和含水率變化

由圖1可知，真空凍結(jié)過程中，檸檬果肉樣品失水率逐漸增加，4個階段樣品失水率差異顯著(P<0.05)，凍結(jié)30 min后失水率達(25.62±0.51)%。新鮮檸檬果肉的初始含水率為(89.12±0.43)%，真空凍結(jié)過程中含水率逐漸減少，4個階段樣品含水率差異顯著(P<0.05)，凍結(jié)30 min后檸檬果肉含水率為(85.37±0.42)%。

小寫字母不同表示失水率差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示含水率差異顯著(P<0.05)圖1 真空凍結(jié)過程中檸檬果肉失水率和含水率變化Figure 1 Changes in water loss and moisture content of lemon pulp during vacuum freezing

2.2 E-nose分析

2.2.1 檸檬果肉揮發(fā)性風味雷達圖 由圖2可知，隨著真空凍結(jié)進程的推進，檸檬果肉組織的揮發(fā)性風味成分整體存在顯著差異，說明真空凍結(jié)促使了檸檬果肉揮發(fā)性成分的變化及遷移。新鮮檸檬中W2W、W1C、W5S、W1S和W2S傳感器的響應(yīng)值較大，表明新鮮檸檬中主要含有芳香族化合物、氮氧化物、醇類和醛酮類等揮發(fā)性成分。真空凍結(jié)10 min時，檸檬果肉的W2W、W1C、W5S和W2S傳感器響應(yīng)值基本無變化，真空凍結(jié)20，30 min時，檸檬果肉的W2W、W1C、W1S和W5S傳感器響應(yīng)值顯著下降，真空凍結(jié)30 min時分別下降了68.73%，39.70%，35.37%，33.55%，說明真空凍結(jié)對檸檬果肉中芳香族化合物、甲基類化合物及氮氧化合物的影響較大，真空凍結(jié)后這幾類揮發(fā)性成分下降明顯。

2.2.2 檸檬果肉揮發(fā)性風味成分的PCA和LDA分析

由圖3(a)可知，PC1貢獻率為91.68%，PC2貢獻率為7.01%，累積貢獻率為98.69%，表明能較好地反映真空凍結(jié)過程中樣品揮發(fā)性成分的變化。PC1中，新鮮果肉樣品與凍結(jié)樣品相距較遠，表明凍結(jié)過程中樣品揮發(fā)性成分相對于新鮮樣品發(fā)生了較大變化。凍結(jié)10，20，30 min樣品在PC1中距離較小，表明其揮發(fā)性成分比較接近。由圖3(b)可知，LDA1貢獻率為61.04%，LDA2貢獻率為28.55%，總貢獻率為89.59%，各凍結(jié)時間段樣品的分布存在明顯差異。LDA1中，新鮮果肉樣品與其他凍結(jié)時間樣品距離較遠，說明其揮發(fā)性成分與其他樣品的差別較大。凍結(jié)10，20，30 min樣品在LDA1上的距離較接近，說明其揮發(fā)性成分較接近，但在LDA2上可完全分開。

圖2 真空凍結(jié)過程檸檬果肉揮發(fā)性風味成分響應(yīng)值雷達圖Figure 2 Radar chart of the response value of volatile flavor compounds of lemon pulp during vacuum freezing

圖3 真空凍結(jié)過程中檸檬果肉揮發(fā)性風味成分的PCA和LDA分析Figure 3 PCA and LDA of volatile flavor compounds of lemon pulp during vacuum freezing

綜上，新鮮檸檬、凍結(jié)10，20，30 min 4個階段果肉樣品中的揮發(fā)性風味整體性特征呈明顯差異，結(jié)合圖1可以判斷檸檬果肉中的整體揮發(fā)性成分在凍結(jié)過程中呈下降趨勢。

2.3 GC-MS分析

2.3.1 檸檬果肉揮發(fā)性風味成分種類及含量變化 由表2 可知，新鮮檸檬果肉和不同凍結(jié)階段檸檬果肉樣品中共檢出32種揮發(fā)性風味物質(zhì)，主要由烯烴類(12種)、醇類(7種)、醛類(7種)、酯類(2種)、酮類(2種)、其他(2種)組成，新鮮檸檬果肉、凍結(jié)10，20，30 min樣品中分別檢出30，28，25，22種風味化合物。新鮮檸檬果肉的揮發(fā)性風味成分總含量最高為26.86 mg/g，隨著真空凍結(jié)進程的推進，揮發(fā)性風味成分總含量逐漸降低，真空凍結(jié)30 min時，揮發(fā)性風味成分含量降至10.45 mg/g。

檸檬果肉中揮發(fā)性成分主要以烯烴類物質(zhì)為主，隨著真空凍結(jié)的進行烯烴類化合物種類和含量逐漸減少，凍結(jié)30 min時烯烴化合物含量減少了65.48%。其中α-水芹烯、α-蒎烯、α-松油烯、鄰傘花烴在真空凍結(jié)過程的前期變化不顯著(P>0.05)，凍結(jié)30 min時呈顯著變化(P<0.05)；真空凍結(jié)對檸檬果肉中的D-檸檬烯、γ-松油烯、異松油烯、β-石竹烯、香橙烯影響非常大，凍結(jié)10 min時其分別降低35.62%，28.49%，31.58%，60.00%，28.57%，凍結(jié)30 min時β-石竹烯和香橙烯未檢測到，D-檸檬烯、γ-松油烯、異松油烯分別降低了63.52%，66.48%，73.68%。醇類是檸檬果味香氣的重要成分之一，果實中的酯酶對其形成有重要影響，而且醇類物質(zhì)在其他揮發(fā)性風味成分合成時起著溶劑或載體的作用[19]。醇類化合物在真空凍結(jié)過程中變化非常明顯，含量減少了56.72%；凍結(jié)30 min時(S)-順式-馬鞭草烯醇未檢測到，芳樟醇和香茅醇損失最大，含量分別降低了75.41%，80.43%，香葉醇損失最小，僅降低了37.27%。醛類化合物在檸檬果肉揮發(fā)性成分中含量雖較低，但其是檸檬果肉風味的重要貢獻物質(zhì)，決定著檸檬果肉香氣的質(zhì)量[20]，其種類和含量在真空凍結(jié)過程中也呈逐漸減少趨勢，凍結(jié)30 min時減少了62.99%，凍結(jié)10 min時癸醛和拂地醛已完全損失，凍結(jié)20，30 min時辛醛和紫蘇醛未檢測到，損失完全，但在凍結(jié)30 min時有2,4-二甲基苯甲醛新物質(zhì)生成。酮類化合物含量在真空凍結(jié)前20 min變化不顯著，凍結(jié)30 min時有明顯增加(P<0.05)，主要是由2-甲基環(huán)戊酮引起的，隨著凍結(jié)時間的延長，2-甲基環(huán)戊酮含量逐漸增加，凍結(jié)30 min時增加了65.79%。真空凍結(jié)過程中醛類化合物和酮類化合物有新物質(zhì)的生成，可能是由于果肉組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，脂肪氧合酶與所含有亞油酸、亞麻酸等脂肪酸物質(zhì)發(fā)生催化反應(yīng)而生成新的物質(zhì)[21]。酯類物質(zhì)是水果芬芳香味的主要來源物質(zhì)，檸檬果肉中的酯類化合物由乙酸橙花酯和乙酸香葉酯組成，二者使得檸檬果肉具有果香味和玫瑰香味。

由圖4可知，根據(jù)垂直樹狀圖，檸檬果肉真空凍結(jié)過程中所檢測的32種揮發(fā)性成分可劃分為4類，其中2,4-二甲基苯甲醛、2,4-二叔丁基苯酚為新生成物質(zhì)，2-甲基環(huán)戊酮為含量增加的物質(zhì)，此3種揮發(fā)性風味成分為一類。根據(jù)水平樹狀圖，將新鮮檸檬果肉劃分為獨立的主類，將凍結(jié)10，20 min檸檬果肉劃分為一類，凍結(jié)30 min檸檬果肉劃分為一類。從檸檬果肉4個時段樣本在熱圖中色澤變化來看，絕大多數(shù)的揮發(fā)性風味成分在真空凍結(jié)過程中呈明顯下降趨勢。

表2 真空凍結(jié)過程中檸檬果肉揮發(fā)性風味成分的半定量結(jié)果?Table 2 Semi-quantitative analysis of volatile flavor compounds of lemon pulp during vacuum freezing

圖4 檸檬果肉真空凍結(jié)過程中主要揮發(fā)性風味成分熱圖和分層聚類分析Figure 4 Heat map and hierarchical clustering analysis of the main volatile compounds in lemon pulp during vacuum freezing

2.3.2 檸檬果肉主要揮發(fā)性風味成分損失規(guī)律分析 由圖5可知，檸檬果肉中含量較高的揮發(fā)性風味成分主要為D-檸檬烯、γ-松油烯、α-松油醇、橙花醇、檸檬醛、壬醛，均呈逐漸降低趨勢。真空凍結(jié)過程中真空度的快速下降促使檸檬果肉中的水分急速變成水蒸氣，檸檬果肉表面呈沸騰狀態(tài)，揮發(fā)性風味成分隨著水蒸氣的散逸，隨之從果肉表面逸去，造成揮發(fā)性風味成分的大量損失，與謝煥雄等[22]的結(jié)果一致。

D-檸檬烯在檸檬果肉揮發(fā)性風味成分中含量最高，新鮮檸檬中為12.83 mg/g，具有愉快的甜香、柑橘香和檸檬香，閾值為34 μg/kg[23-24]，研究[25-27]指出D-檸檬烯為柑橘類的主要特征香氣。真空凍結(jié)過程中D-檸檬烯的損失非常大，凍結(jié)10 min時的損失速率最大，為0.46 mg/(g·min)，凍結(jié)20，30 min時損失速率分別為0.28，0.08 mg/(g·min)。γ-松油烯在揮發(fā)性風味中含量位居第二，具有芳香的松木氣味[28]，真空凍結(jié)期間也呈逐漸損失趨勢，損失速率分別為0.05，0.04，0.02 mg/(g·min)。這種現(xiàn)象可能是由于真空凍結(jié)初期檸檬果肉的水處于游離狀態(tài)，很容易隨著水蒸氣的逃逸而損失，隨著真空凍結(jié)進程的進行檸檬果肉中的水分逐漸被凍結(jié)，逃逸難度增加，揮發(fā)性風味成分損失速率也隨之減小。檸檬果肉醇類化合物中α-松油醇和橙花醇含量較高，在真空凍結(jié)過程中損失呈先快后慢的趨勢。α-松油醇為檸檬烯的降解產(chǎn)物，呈腐敗味，是檸檬果實的主要醇類風味物質(zhì)，與涂勛良等[29]、何朝飛等[30]的結(jié)果一致。橙花醇在檸檬果肉醇類化合物含量中排第二，與香葉醛均是檸檬醛的同分異構(gòu)體，三者共同作用形成了典型的檸檬香氣[30]。檸檬醛在檸檬果肉醛類物質(zhì)中含量最高，具有愉悅的香氣，是一種不飽和醛，也是檸檬油特征香氣的主要成分[26]。壬醛在醛類中含量第二，主要來自不飽和脂肪酸的氧化，具有強烈的玫瑰花香和甜橙氣息[31]，其閾值較低，為1 μg/kg[32]。檸檬醛和壬醛含量在30 min的真空凍結(jié)過程中平均損失速率分別為0.040，0.005 mg/(g·min)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 檸檬果肉中主要烯烴類、醇類和醛類在真空凍結(jié)過程中的變化Figure 5 Changes in the content of main olefins,alcohols and aldehydesin lemon pulp during vacuum freezing

3 結(jié)論

試驗表明，電子鼻聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)真空凍結(jié)過程中檸檬果肉揮發(fā)性風味成分均呈逐漸損失的趨勢。PCA和LDA分析表明新鮮果肉以及不同真空凍結(jié)時間的樣品整體揮發(fā)性風味成分具有明顯差異，說明揮發(fā)性風味成分在真空凍結(jié)過程中不斷發(fā)生變化。氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)新鮮檸檬果肉和不同凍結(jié)時間樣品的揮發(fā)性風味成分共32種，主要為烯烴類、醇類、醛類、酯類、酮類等化合物，聚類分析可將真空凍結(jié)過程中所出現(xiàn)的揮發(fā)性風味成分劃分為四大類。真空凍結(jié)使得檸檬果肉的風味物質(zhì)種類和含量均下降，真空凍結(jié)20 min后，果肉揮發(fā)性風味成分含量的損失主要以烯烴類、醇類和醛類為主，酮類化合物含量變化不明顯。真空凍結(jié)30 min后，有新的揮發(fā)性化合物生成，包括2,4-二甲基苯甲醛和2,4-二叔丁基苯酚；整個真空凍結(jié)過程中只有2-甲基環(huán)戊酮含量逐漸增加。

檸檬果肉揮發(fā)性風味成分在真空凍結(jié)過程發(fā)生變化的原因非常復(fù)雜，有可能是原有揮發(fā)性風味成分在真空條件下的物理揮發(fā)損失所致，也有可能是果肉組織中相關(guān)前體物質(zhì)參與各種化學轉(zhuǎn)化所致，其變化作用機理還有待深入研究。