屈青云 許 偉 胡 源 李銀花 龔志華 肖文軍,2

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

腸道是機(jī)體消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的場(chǎng)所，也是重要的免疫器官，腸道免疫功能的提高對(duì)維持內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)衡、提高機(jī)體抗病能力具有重要作用[1-2]。通過膳食營(yíng)養(yǎng)干預(yù)來保護(hù)腸道完整性、減輕腸道炎癥、維護(hù)腸道菌群微生態(tài)平衡已成為一種提高腸道免疫功能的有效途徑[3-4]。隨著人們生活水平的提高，采用多元化的營(yíng)養(yǎng)素進(jìn)行腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)是現(xiàn)代膳食營(yíng)養(yǎng)的重要發(fā)展方向。研究[5]發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺聯(lián)合膳食纖維強(qiáng)化腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)能較好地維持腸道正常適度的免疫反應(yīng)，減輕過度的炎癥反應(yīng)，提高腸道黏膜免疫能力。其中，谷氨酰胺是腸道免疫重要關(guān)聯(lián)物質(zhì)，主要依靠其他器官合成或外源性攝入，可促進(jìn)腸道細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的產(chǎn)生，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫具有重要作用[6]；膳食纖維可在腸道微生物的作用下發(fā)酵形成短鏈脂肪酸(SCFAs)，其在腸道供能、改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)腸道免疫功能等方面發(fā)揮積極作用[7]。

常見的膳食纖維主要有纖維素、半纖維素、果膠、樹膠和木質(zhì)素等[8]。抗性淀粉(RS)是一種極具潛力的新型膳食纖維，不僅在持水力、色澤、口感等方面擁有更好的性能，而且具有調(diào)節(jié)腸道pH值、預(yù)防結(jié)腸癌、改善腸道菌群和提高腸道免疫力等作用[9-10]。但抗性淀粉的長(zhǎng)期攝入對(duì)腸道內(nèi)環(huán)境的積極作用會(huì)逐漸減弱，且由于RS在小腸中不易被酶消化，其在腸道中的存在也會(huì)影響腸道內(nèi)容物的物理特性，從而改變小腸消化和營(yíng)養(yǎng)吸收的程度[11]。L-茶氨酸(L-theanine)是茶葉中一種特征性氨基酸，與谷氨酰胺結(jié)構(gòu)類似，不僅可以作為一種外源營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物質(zhì)，同時(shí)可通過改善腸道結(jié)構(gòu)、促進(jìn)免疫球蛋白分泌、降低白介素含量、下調(diào)炎癥因子水平等途徑提高腸道免疫力[12]，此外，氨基酸發(fā)酵也可產(chǎn)生大量的SCFAs[13]。由此可見，抗性淀粉與L-茶氨酸均有利于腸道健康，但其組合營(yíng)養(yǎng)是否具有協(xié)同增效作用還有待進(jìn)一步探究。為此，試驗(yàn)擬通過不同劑量L-茶氨酸灌胃干預(yù)抗性淀粉飲食模式下的SD雄性大鼠28 d，研究分析抗性淀粉和L-茶氨酸的組合腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)大鼠腸道免疫功能的調(diào)節(jié)作用，以期為食品營(yíng)養(yǎng)干預(yù)多元化發(fā)展、改善腸道免疫功能以及L-茶氨酸的深層次利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-茶氨酸：純度≥98%，湖南三福生物科技有限公司；

抗性淀粉II(商標(biāo)號(hào)：Fibersol-2)：上海友山生物科技有限公司；

抗性淀粉飼料：參照文獻(xiàn)[14]了解抗性淀粉的功能及營(yíng)養(yǎng)配比后，委托湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，在基礎(chǔ)飼料配方上添加抗性淀粉II制成，其組成：2%抗性淀粉II，18%蛋白質(zhì)(供能比24.7%)，58%碳水化合物(供能比67.1%)，4.8%脂質(zhì)(供能比8.2%)和3%礦物質(zhì)；

谷氨酰胺(Gln)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、免疫球蛋白A(IgA)ELISA試劑盒：上海茁彩生物科技有限公司；

谷氨酸(Glu)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)試劑盒：南京建成生物工程研究所；

SD雄性大鼠：SPF級(jí)4周齡，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀：Varioskan Flash型，賽默飛世爾上海儀器有限公司；

臺(tái)式冷凍離心機(jī)：MIKRO22R型，德國(guó)Hettich公司；

移液槍：Reerach Plus型，德國(guó)Eppendorf公司；

全自動(dòng)樣品快速研磨儀：JXFSTPRP-48型，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV-2550型，日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì) 所有涉及動(dòng)物的試驗(yàn)程序嚴(yán)格按照湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理委員會(huì)《動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行(注冊(cè)號(hào)：015063506)。試驗(yàn)動(dòng)物選擇SPF級(jí)4周齡SD雄性大鼠，飼養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃、濕度(50%～70%)，12 h的光/暗周期，保持動(dòng)物房空氣流通。大鼠分組前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，期間自由進(jìn)食飲水。

將50只大鼠按體重隨機(jī)分為基礎(chǔ)飼料對(duì)照組(CK A)、抗性淀粉飼料對(duì)照組(CK B)和L-茶氨酸低劑量組(LTA 100)、中劑量組(LTA 300)、高劑量組(LTA 500)共5組，每組10只，喂養(yǎng)周期為28 d，大鼠分組及喂養(yǎng)如表1所示。

1.3.2 樣品采集與檢測(cè) 末次灌胃后，經(jīng)禁食12 h，收集各組大鼠糞便，置于干燥的滅菌試管中，隨后注射戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，解剖收集每只大鼠的十二指腸、空腸、回腸組織，糞便與腸道組織均-80 ℃貯藏備用。試驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒操作。

1.3.3 腸道微生物DNA提取與測(cè)序 使用EZNA Soil DNA試劑盒對(duì)大鼠糞便進(jìn)行總DNA抽提，使用特異引物對(duì)糞便中細(xì)菌16S rDNA的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化，以及文庫(kù)模板的富集和測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建，隨后在Illumina Miseq PE300平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

表1 大鼠分組及喂養(yǎng)Table 1 The grouping and feeding of rats

測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)使用Trimmomatic軟件質(zhì)控、FLASH拼接、Verseach過濾得到優(yōu)質(zhì)序列，利用軟件Uparse對(duì)所有樣品的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，將具有97%一致性序列聚類成為操作單元(OTUs)，采用RDP Classifier對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行分類和注釋，與Silva(SSU123)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，置信水平設(shè)置為70%?；跇悠稯TUs結(jié)果，使用Mothur軟件對(duì)樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析，并在門與屬分類水平上，進(jìn)行腸道菌群結(jié)構(gòu)分析。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析方法 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，最小顯著差數(shù)法(LSD)和鄧肯(Duncan)檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。使用GraphPad Prism 8.0.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠體重與采食量的影響

表2顯示，各處理組日均采食量無顯著差異(P>0.05)。與CK A組相比，CK B組大鼠體重稍下降(P>0.05)，可能與抗性淀粉降低機(jī)體脂肪沉積量有關(guān)[15]。與CK B組相比，LTA 300、LTA 500組大鼠體重變化量顯著增加(P<0.05)，說明抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸能促進(jìn)大鼠生長(zhǎng)，與童海鷗等[16]的結(jié)論基本一致。

2.2 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠回腸組織酶活性及MDA含量的影響

如圖1所示，與CK A組相比，CK B組大鼠回腸組織中SOD、GSH-Px活性升高，iNOS活性和MDA含量降低，其中iNOS達(dá)到顯著水平(P<0.05)。與CK B組相比，LTA 300、LTA 500組均能增加大鼠回腸組織中SOD、GSH-Px活性(P<0.05)，降低MDA含量(P<0.05)。由于腸道系統(tǒng)不僅是代謝部位，也是宿主和微生物之間的作用位點(diǎn)，腸道細(xì)胞新陳代謝、日糧成分氧化、腸道微生物改變等均會(huì)影響腸道氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡[17]。由此說明抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸能提高SOD、GSH-Px活性，抑制iNOS活性及減少M(fèi)DA形成來平衡腸道自由基，維護(hù)腸道健康。

表2 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠體重變化量與日均采食量的影響?Table 2 Effects of L-theanine on the weight change and average daily feed intake of rats under resistant starch feeding g

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠回腸組織中SOD、GSH-Px、iNOS活性和MDA含量的影響Figure 1 Effects of L-theanine on SOD,GSH-Px,iNOS activities and MDA content in ileum of rats under resistant starch feeding

2.3 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠回腸細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響

由圖2可知，與CK A組相比，CK B組大鼠回腸IL-4、IL-10表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，說明抗性淀粉可通過改善炎癥因子水平來平衡腸道穩(wěn)態(tài)，與曹承嘉[18]的研究結(jié)果相符。與CK B組相比，各L-茶氨酸劑量組IL-4、IL-10表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，說明在抗性淀粉飲食模式下，L-茶氨酸干預(yù)可進(jìn)一步調(diào)節(jié)促炎/抗炎因子平衡，且具有劑量依賴效應(yīng)。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠回腸中細(xì)胞因子表達(dá)量的影響Figure 2 Effects of L-theanine on the levels of cytokines in ileum of rats under resistant starch feeding

2.4 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠回腸IgA的影響

由圖3可知，與CK A組相比，CK B組大鼠回腸IgA含量顯著增加(P<0.05)。與CK B相比，各L-茶氨酸劑量組IgA含量顯著升高(P<0.05)，其中，以LTA 300組效果最佳，由此提示抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸能通過促進(jìn)IgA分泌增強(qiáng)腸道免疫應(yīng)答[19]。

2.5 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠腸道Glu、Gln的影響

由表3可知，與CK A組相比，CK B組腸道Glu、Gln的含量降低，且空腸和十二指腸達(dá)到顯著水平(P<0.05)，可能與抗性淀粉降低腸道氮的吸收和促進(jìn)大腸微生物發(fā)酵而增加微生物蛋白質(zhì)合成有關(guān)[20]，同時(shí)回腸Glu、Gln含量有所降低，但并不顯著(P>0.05)，可能是抗性淀粉在小腸后段消化率較高的緣故[21]。與CK B組相比，不同劑量的L-茶氨酸干預(yù)均增加了腸道Glu、Gln的含量，其中LTA 100組十二指腸、空腸Gln，LTA 300組十二指腸、空腸Glu以及十二指腸、空腸、回腸Gln，LTA 500組十二指腸、空腸、回腸中Glu和Gln含量達(dá)到顯著水平(P<0.05)，說明抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸干預(yù)能提高腸道Glu和Gln的含量，一方面可能是由于L-茶氨酸能改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)并促進(jìn)腸道營(yíng)養(yǎng)吸收[22]，另一方面，L-茶氨酸降解可增加Gln合成底物Glu的濃度，并通過提高骨骼肌中谷氨酰胺合成酶活性和促進(jìn)腸道谷氨酰胺酶蛋白的翻譯和修飾影響腸道Gln代謝[12]。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠回腸中IgA含量的影響Figure 3 Effect of L-theanine on the content of IgA in ileum of rats under resistant starch feeding

表3 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠腸道Glu、Gln的影響?Table 3 Effects of L-theanine on the contents of Glu and Gln in intestinal of rats under resistant starch feeding μmol/g

2.6 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠腸道菌群的影響

如表4所示，5組樣本的測(cè)序深度指數(shù)在99.70%～99.80%，說明測(cè)序深度足以反映樣本中所包含的絕大多數(shù)序列，能進(jìn)行下一步分析。LTA 500組ACE、Chao、Shannon指數(shù)最大，其中ACE指數(shù)與CK B組相比達(dá)到顯著水平(P<0.05)，各L-茶氨酸劑量組Simpson指數(shù)顯著降低(P<0.05)。由此提示，抗性淀粉聯(lián)合L-茶氨酸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù)能提高大鼠腸道微生物豐富度和多樣性，進(jìn)而影響腸道菌群組成。

原始測(cè)序結(jié)果經(jīng)過質(zhì)控優(yōu)化后在分類學(xué)上共得到805個(gè)OTUs，可劃分為13個(gè)門，19個(gè)綱，31個(gè)目，57個(gè)科，161個(gè)屬，287個(gè)種。圖4顯示，各組樣本在門水平上群落結(jié)構(gòu)差異不大，主要由擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋體門(Spirochaetes)、ε-變形菌門(Epsilonbacteraeota)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)6個(gè)門構(gòu)成，其中擬桿菌門和厚壁菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，約占總序列數(shù)的90%，與Ericsson等[23]的研究結(jié)果一致。由圖4及表5可知，與CK A組相比，CK B組厚壁菌門相對(duì)豐度下降，擬桿菌門相對(duì)豐度增加，二者比值有所上升(P>0.05)。擬桿菌門在碳水化合物發(fā)酵、含氮物質(zhì)的利用、抵抗病原體定植和促進(jìn)腸道菌群平衡等活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[24]，同時(shí)，擬桿菌門與厚壁菌門的比值與動(dòng)物機(jī)體的能量代謝相關(guān)[25]。Kyu-Ho等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高膳食纖維補(bǔ)充日糧能顯著降低正常飲食大鼠腸道厚壁菌門與擬桿菌門的比值，與試驗(yàn)結(jié)果相符。與CK B組相比，L-茶氨酸各劑量組均能降低厚壁菌門，提高擬桿菌門的相對(duì)豐度，并降低其比值(P>0.05)，提示抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸可能具有調(diào)節(jié)宿主能量代謝的作用。

圖5表明，在屬的分類學(xué)水平上，5組樣本中的主要優(yōu)勢(shì)菌屬有普雷沃菌屬9(Prevotella_9)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、副桿菌屬(Parabacteroides)和鼠桿菌科未命名屬(Muribaculaceae_norank)，4個(gè)屬相對(duì)豐度占比50%以上，選取相對(duì)豐度前30位的屬進(jìn)行顯著性差異分析，得到表6。由表6可知，與CK A組相比，CK B組副桿菌屬、毛螺菌科未命名屬(Lachnospiraceae_norank)、瘤胃梭菌屬5(Ruminiclostridium_5)、木質(zhì)真菌屬([Eubacterium]_xylanophilum_group)、擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和布勞特氏菌屬(Blautia)豐度顯著增加(P<0.05)，擬普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)、幽門螺桿菌屬(Helicobacter)、副薩特氏菌屬(Parasutterella)豐度顯著降低(P<0.05)。而L-茶氨酸可進(jìn)一步改善抗性淀粉飲食模式下的腸道菌群結(jié)構(gòu)。與CK B組相比，LTA 300組顯著上調(diào)副桿菌屬，顯著下調(diào)鼠桿菌科未命名屬的相對(duì)豐度(P<0.05)；LTA 500組顯著上調(diào)毛螺菌科NK4A136群屬(Lachnospiraceae_NK4A136_group)和雙歧桿菌屬的相對(duì)豐度(P<0.05)；LTA 300、LTA 500組均能顯著上調(diào)普雷沃菌屬9和布勞特氏菌屬，下調(diào)普雷沃菌科NK3B31群屬(Prevotellaceae_NK3B31_group)、幽門螺桿菌屬和副薩特氏菌屬的相對(duì)豐度(P<0.05)。雙歧桿菌屬是一種常見益生菌，不僅能抑制有害細(xì)菌和炎癥細(xì)胞因子分泌，還可改變樹突狀細(xì)胞的功能，以調(diào)節(jié)腸道對(duì)無害抗原和細(xì)菌的免疫穩(wěn)態(tài)[26]；副桿菌屬、普雷沃菌屬9、布勞特氏菌屬由于與免疫關(guān)聯(lián)物質(zhì)SCFAs的產(chǎn)生有關(guān)，被認(rèn)為是益生菌或潛在益生菌。SCFAs是抗性淀粉在大腸內(nèi)被腸道菌群發(fā)酵利用產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物，包括乙酸、丙酸和丁酸等[27]。副桿菌屬主要代謝終產(chǎn)物為有益的乙酸、丙酸，幫助調(diào)節(jié)腸道菌群[28]；普雷沃菌屬9、布勞特氏菌屬參與丁酸鹽的產(chǎn)生，為腸道上皮細(xì)胞提供能源[29]。與CK A組相比，CK B組雙歧桿菌屬、副桿菌屬、布勞特氏菌屬等菌屬豐度增加(P<0.05)，說明抗性淀粉能通過影響SCFAs產(chǎn)生而促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)。與CK B組相比，LTA 300、LTA 500組普雷沃菌屬9、副桿菌屬、布勞特氏菌屬豐度顯著增加(P<0.05)，可能是L-茶氨酸能很好地被腸道微生物發(fā)酵利用，進(jìn)而生成SCFAs[30]45-50，影響腸道內(nèi)環(huán)境、促進(jìn)腸道有益菌生長(zhǎng)的原因。幽門螺桿菌屬、副薩特氏菌屬與腸道健康呈負(fù)相關(guān)，幽門螺桿菌屬是一種慢性致病菌，定植在機(jī)體內(nèi)易引起炎癥[31]；副薩特氏菌屬豐度增加會(huì)導(dǎo)致菌群紊亂，易引起腸易激綜合征、科恩氏病[32]。表6中，與CK A組相比，CK B組幽門螺桿菌、副薩特氏菌等菌屬豐度降低(P<0.05)，可能與抗性淀粉降低腸道pH值，抑制部分有害菌群生長(zhǎng)有關(guān)[33]。與CK B組相比，LTA 300、LTA 500組幽門螺桿菌、副薩特氏菌豐度顯著降低(P<0.05)，可能是由于L-茶氨酸能促進(jìn)乳酸等SCFAs的生成[30]51，進(jìn)一步降低腸道pH值。由此可知，抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸可通過提高腸道益生菌和潛在益生菌豐度、降低致病菌豐度來改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。

表4 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠腸道菌群豐富度及多樣性的影響?Table 4 Effects of L-theanine on the richness and diversity of intestinal bacteria in rats under resistant starch feeding

圖4 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)門水平上的大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響Figure 4 Effect of L-theanine on the structure of intestinal bacteria in rats at gate level under resistant starch feeding

表5 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠腸道菌群厚壁菌門與擬桿菌門相對(duì)豐度及其比值的影響Table 5 Effects of L-theanine on the relative abundance and ratio of Firmicutes and Bacteroidetes of intestinal bacteria in rats under resistant starch feeding

圖5 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)屬水平上的大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響Figure 5 Effect of L-theanine on the structure of intestinal bacteria in rats at genus level under resistant starch feeding

表6 抗性淀粉飲食模式下L-茶氨酸對(duì)大鼠腸道菌群優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度的影響?Table 6 Effects of L-theanine on the relative abundance of intestinal bacteria in rats at main genus under resistant starch feeding

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，在抗性淀粉飲食模式下使用L-茶氨酸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù)，一方面能夠提高腸道抗氧化能力、平衡促炎/抗炎因子、提高腸道Glu與Gln含量，增強(qiáng)腸道免疫應(yīng)答能力。另一方面，能夠通過提高腸道菌群多樣性、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)腸道免疫功能，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。