董 妍，馬曉昌，于盼盼，李 春，施保柱

參附注射液作為傳統(tǒng)方劑參附湯的現(xiàn)代用藥形式，最早見于宋代嚴(yán)用和的《濟(jì)生方》，參附注射液是由紅參、附片提取制成的中藥注射劑，主要治療陽氣暴脫的厥脫癥(感染性休克、心源性休克、低容量性休克等)，也可用于陽虛(氣虛)所致的驚悸、怔忡、喘咳、胃疼、泄瀉、痹癥等[1]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液可提高組織氧攝取和氧利用，改善血流動(dòng)力學(xué)，但作用機(jī)制未明確[2-3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多學(xué)科技術(shù)和內(nèi)容，從多靶點(diǎn)研究角度出發(fā)，實(shí)現(xiàn)藥物作用綜合網(wǎng)絡(luò)分析，其整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與中藥及方劑的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理一致[4]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討參附注射液治療休克的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 參附注射液相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)[5](TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)尋找2味中藥化學(xué)組成成分，根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18的2個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)(ADME)屬性值進(jìn)行活性成分的初步篩選以獲得活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性化合物的已知靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后，作為標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息，統(tǒng)一在UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.2 休克相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以“shock”“circulation shock”“休克”為關(guān)鍵詞，挖掘基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https://www.genecards.org)、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM，http://www.omim.org)、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(TTD，http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)中治療休克的潛在靶點(diǎn)，合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫疾病靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)數(shù)值得到休克相關(guān)的靶點(diǎn)。

1.3 參附注射液-休克成分靶點(diǎn)蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為明確參附注射液相關(guān)靶點(diǎn)與休克靶點(diǎn)間的相互作用，采用Cytoscape 3.7.1軟件功能構(gòu)建PPI，并整合提取其交集網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析。以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值“連接度(degree)”為指標(biāo)，選擇大于其中位數(shù)2倍以上的節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵候選靶點(diǎn)；提取分析這些候選節(jié)點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的“連接度”“介度(betweenness)”“緊密度(closeness)”“最近公共祖先(LAC)”“鄰域連接度(nighborhood connectivity)”，共5個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值并進(jìn)行二次篩選，最終選擇上述5個(gè)特征值均大于其相應(yīng)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。進(jìn)而將交集靶點(diǎn)提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型[6]。居前10位靶點(diǎn)基因通過Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行可視處理。

1.4 靶點(diǎn)通路的注釋和分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)[7]對(duì)上述預(yù)測(cè)得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息進(jìn)行基因本體(GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路注釋分析。將參附注射液有效成分對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)直接映射到通路上，通過藥物靶點(diǎn)富集得到的通路是藥物發(fā)揮主要調(diào)節(jié)作用的重要途徑，由此得到參附注射液治療休克的相關(guān)生物學(xué)過程及代謝通路信息。應(yīng)用在線繪圖軟件微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)進(jìn)行繪圖。

1.5 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建參附注射液成分-休克靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape 3.7.1內(nèi)置工具分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度、介度及緊密度等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.6 成分靶點(diǎn)分子對(duì)接 分子對(duì)接是通過匹配原則，計(jì)算并預(yù)測(cè)配體與受體的相互作用模式，選取參附注射液主要活性成分，從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載化合物的3D結(jié)構(gòu)并轉(zhuǎn)換格式，從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載靶點(diǎn)蛋白的分子結(jié)構(gòu)PDB格式文件。通過PyMol軟件去水分子及自身配體，并運(yùn)用AutoDock軟件去水、加氫后進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié) 果

2.1 參附注射液成分靶點(diǎn)獲取

2.1.1 活性化合物的篩選 通過TCMSP網(wǎng)站檢索到紅參、附子中化合物共139個(gè)，其中74個(gè)來自紅參、65個(gè)來自附子。以O(shè)B≥30%且DL≥0.18，篩選出活性化合物共25個(gè)，其中4個(gè)來自紅參，21個(gè)來自附子。參附注射液中主要活性化合物基本信息見表1。

表1 參附注射液中主要活性化合物基本信息

2.1.2 參附注射液成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 對(duì)獲得的有效成分結(jié)合UniProt數(shù)據(jù)庫確認(rèn)并轉(zhuǎn)換，其中紅參共55個(gè)靶點(diǎn)、附子共30個(gè)靶點(diǎn)，合并后刪除重復(fù)靶點(diǎn)，最終獲得57個(gè)。將參附注射液的候選化合物與對(duì)應(yīng)的靶蛋白導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，詳見圖1。圖中八邊形為靶點(diǎn)基因，三角形為化學(xué)成分，共57個(gè)靶點(diǎn)、94條邊，代表了成分與靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系。體現(xiàn)了參附注射液多成分、多靶點(diǎn)的整體協(xié)同作用。

圖1 參附注射液成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(節(jié)點(diǎn)的大小、顏色與節(jié)點(diǎn)的度值成正比)

2.2 休克相關(guān)靶點(diǎn)獲取 從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得休克相關(guān)靶點(diǎn)8 858個(gè)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為休克的潛在靶點(diǎn)，通過GeneCards所得休克靶點(diǎn)Score最大值為66.57，最小值為0.14，中位數(shù)為0.80，故設(shè)定Score≥0.80的靶點(diǎn)為休克的潛在靶點(diǎn)，根據(jù)目標(biāo)靶點(diǎn)數(shù)量再次進(jìn)行中位數(shù)篩選，直至取得目標(biāo)靶點(diǎn)。結(jié)合OMIM數(shù)據(jù)庫(200個(gè))、TTD數(shù)據(jù)庫(1個(gè))篩選、補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，合并后刪除重復(fù)值，最終得到休克相關(guān)靶點(diǎn)1 375個(gè)。將篩選的參附注射活性成分靶點(diǎn)與休克相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到參附注射液成分-休克共同靶點(diǎn)30個(gè)，應(yīng)用在線繪圖軟件微生信繪制Venn圖，詳見圖2。

圖2 藥物-疾病靶點(diǎn)Venn圖

2.3 參附注射液成分-休克相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將靶點(diǎn)提交至Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建成分、疾病靶點(diǎn)的PPI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共2 990個(gè)藥物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)及12 674個(gè)休克治療靶點(diǎn)具有PPI作用，其中包括2949個(gè)重疊靶點(diǎn)。取2個(gè)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的交集靶點(diǎn)并計(jì)算每個(gè)點(diǎn)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值，得到整個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)“連接度”的中位數(shù)為26，因此選擇≥2倍的中位數(shù)“連接度≥52”的節(jié)點(diǎn)作為候選靶點(diǎn)，共篩選到822個(gè)候選靶點(diǎn)；對(duì)候選靶點(diǎn)的相互作用信息進(jìn)行提取分析，并以“連接度”“介度”“緊密度”“最近公共祖先”“鄰域連接度”大于其相應(yīng)中位數(shù)為篩選條件進(jìn)一步選擇合適的節(jié)點(diǎn)，即連接度≥89，介度≥324.438，緊密度≥0.516，最近公共祖先≥17.661，鄰域連接度≥126.366，共得到參附注射液治療休克的關(guān)鍵靶點(diǎn)146個(gè)，詳見圖3。將全部節(jié)點(diǎn)關(guān)系信息導(dǎo)出并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，對(duì)連接度居前10位的基因進(jìn)行篩選，并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因圖，詳見圖4。

圖3 參附注射液治療休克的關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選流程圖

圖4 網(wǎng)絡(luò)核心基因網(wǎng)絡(luò)圖(連接度居前10位)(節(jié)點(diǎn)大小、顏色與節(jié)點(diǎn)的度值成正比)

2.4 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫中GO功能富集分析得到GO條目273個(gè)(P<0.05)，其中生物過程(BP)條目207個(gè)，細(xì)胞組成(CC)條目21個(gè)，分子功能(MF)條目45個(gè)，對(duì)連接度居前10位的信號(hào)通路采集相關(guān)信息，運(yùn)用在線繪圖軟件微生信進(jìn)行富集分析繪圖，詳見圖5。KEGG通路富集篩選得到86條信號(hào)通路(P<0.05)，涉及pathways in cancer、hepatitis B、influenza A、chagas disease、TNF signaling pathway等信號(hào)通路，對(duì)連接度居前10位信號(hào)通路進(jìn)行信息匯總，詳見表2。通過在線繪圖軟件微生信進(jìn)行繪圖，詳見圖6。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

表2 KEGG富集分析連接度居前10位的通路

2.5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將參附注射液治療休克的57個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白及對(duì)應(yīng)的8個(gè)潛在成分與KEGG信號(hào)通路富集分析居前10位信號(hào)通路制作“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系表，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建參附注射液治療休克的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，三角形為成分，八邊形為通路名稱，棱形為靶點(diǎn)名稱，詳見圖7。參附注射液的主要有效成分通過pathways in cancer、hepatitis B、influenza A、TNF signaling pathway等通路，作用于磷酸肌醇3-激酶CG(PIK3CG)、核轉(zhuǎn)錄因子κB1A(NF-κB1A)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(CASP3)等靶點(diǎn)，發(fā)揮治療休克的功能，體現(xiàn)了參附注射液多成分-多靶點(diǎn)-多通路治療作用特點(diǎn)。

圖7 參附注射治療休克成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖(節(jié)點(diǎn)大小、顏色與節(jié)點(diǎn)度值成正比)

2.6 參附注射液主要成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接 為了闡述參附注射液治療休克的潛在靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分之間的結(jié)合活性，將參附注射液活性成分分別與PIK3CG、CASP3和NF-κB1A進(jìn)行分子對(duì)接，一般認(rèn)為分子對(duì)接結(jié)合能<0表示配體與受體可自發(fā)結(jié)合，但對(duì)于高結(jié)合性分子的界定尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol，小分子配體與受體結(jié)合較好[8]。詳見圖8～圖13、表3。

圖8 Karanjin-CASP3分子對(duì)接結(jié)果

圖9 Deltoin-CASP3分子對(duì)接結(jié)果

圖10 Deltoin-NF-κB1A分子對(duì)接結(jié)果

圖11 Karanjin-NF-κB1A分子對(duì)接結(jié)果

圖12 Deltoin-PIK3CG分子對(duì)接結(jié)果

圖13 Karanjin-PIK3CG分子對(duì)接結(jié)果

表3 參附注射液主要活性成分分子對(duì)接結(jié)果 單位：kJ/mol

3 討 論

休克是指在各種強(qiáng)烈致病因子作用下，機(jī)體出現(xiàn)有效循環(huán)血量急劇減少，組織灌注嚴(yán)重不足，甚至出現(xiàn)器官功能障礙[9]。有研究顯示，能量代謝障礙、過度炎癥反應(yīng)、氧自由基損傷、血管低反應(yīng)性、凝血功能紊亂是休克的主要機(jī)制，其中炎癥反應(yīng)是休克進(jìn)一步發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[10]。休克發(fā)生后，微循環(huán)灌注減少，發(fā)生廣泛的組織缺氧，刺激機(jī)體炎癥細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量炎性因子，涉及內(nèi)毒素的直接攻擊、細(xì)胞黏附分子過表達(dá)、絲裂原活化蛋白激酶通路活化等多種機(jī)制[11]。

參附注射液作用廣泛，通過調(diào)節(jié)血壓和心率、保護(hù)心肌細(xì)胞、改善微循環(huán)及血液流變學(xué)、降低炎性因子表達(dá)等達(dá)到抗休克的目的?！秴⒏阶⑸湟杭敝匕Y臨床應(yīng)用專家共識(shí)》推薦針對(duì)膿毒性休克病人，在血管活性藥物基礎(chǔ)上加用參附注射液以穩(wěn)定血壓，減少血管活性藥物用量[12]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，參附注射液主要含有烏頭類生物堿和人參皂苷類，還含有少量的有機(jī)酸、核苷、氨基酸、多糖及金屬元素等[13]，可降低超敏C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6及腫瘤壞死因子-α水平，提高白細(xì)胞介素-10含量，達(dá)到促炎/抗炎因子趨于平衡，有效控制休克時(shí)炎癥反應(yīng)[14]，還可抑制大鼠心肌組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB活化及腫瘤壞死因子-α蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[15]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步篩選出參附注射液治療休克的活性成分為β-谷甾醇、人參皂苷Rh2、去氧穿心蓮內(nèi)酯、豆甾醇等。β-谷甾醇可明顯降低組胺誘發(fā)的小鼠毛細(xì)血管通透性增加，可能抑制前列環(huán)素E2、緩激肽、組胺、5-羥色胺等炎癥介質(zhì)活性，發(fā)揮抗炎作用[16]。人參皂苷Rh2是紅參中的特有皂苷，具有抗氧化和抗炎的作用。Rh2通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB活化減輕機(jī)體炎癥狀態(tài)[17]。豆甾醇可降低結(jié)腸組織炎性因子白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1和環(huán)氧合酶2的mRNA表達(dá)[18]。穿心蓮內(nèi)酯能抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB、環(huán)氧合酶2，降低細(xì)胞黏附中E-選擇素產(chǎn)生、抑制細(xì)胞間黏附分子1，最終起到抗炎效果[19]。

通過PPI與通路的富集分析發(fā)現(xiàn)，pathways in cancer (hsa05200)、hepatitis B(hsa04066)、influenza A(hsa05164)等是參附注射發(fā)揮抗休克治療作用的主要信號(hào)通路。pathway in cancer信號(hào)通路中包括核轉(zhuǎn)錄因子-κB、CAPS3、HSP90AB1、JUN等基因，hepatitis B信號(hào)通路包含PIK3CG、IL-1β、CASP3、TNF、CASP9等基因。CASP3是執(zhí)行相關(guān)胱天蛋白酶中參與細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行因子，是常見的被激活的凋亡相關(guān)蛋白酶[20]。腫瘤壞死因子-α刺激白細(xì)胞介素和趨化因子，誘導(dǎo)白細(xì)胞在炎癥部位大量聚集，還可與靶細(xì)胞上受體結(jié)合啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。腫瘤壞死因子-α可促進(jìn)蛋白水解酶和氧自由基釋放，加速炎癥進(jìn)展[21]。白細(xì)胞介素-1β具有激活白細(xì)胞介素-1信號(hào)通路和髓樣分化因子依賴的核轉(zhuǎn)錄因子-κB通路，正反饋?zhàn)饔么龠M(jìn)白細(xì)胞介素-1等促炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)[22]。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB是炎癥過程中腫瘤壞死因子-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，腫瘤壞死因子觸發(fā)多種途徑的激活，包括核轉(zhuǎn)錄因子-κB和絲裂原活化蛋白激酶途徑[23]。磷酸肌醇3-激酶(PI3K)參與免疫、炎癥和過敏反應(yīng)。調(diào)節(jié)白細(xì)胞向炎癥部位的趨化性和對(duì)化學(xué)引誘劑的反應(yīng)[24]。基因靶點(diǎn)主要富集在PIKCG、核轉(zhuǎn)錄因子-κB、CAPS3，故與參附注射液主要成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。對(duì)接結(jié)果顯示：Karanjin(水黃皮次素)、Deltoin(德爾妥因)與PIKCG、核轉(zhuǎn)錄因子-κB、CAPS3結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol，小分子配體與受體結(jié)合較好，可能是參附注射液發(fā)揮抗休克作用主要活性成分。德爾妥因可抑制炎癥反應(yīng)[25]，水黃皮次素能降低腫瘤壞死因子α產(chǎn)生，顯著抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB表達(dá)，并明顯抑制腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮和活性氧，并對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌細(xì)胞生長有一定的抑制作用[26-27]。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，認(rèn)為參附注射液中的活性成分β-谷甾醇、去氧穿心蓮內(nèi)脂、水黃皮次素、豆甾醇、人參皂苷rh2，主要通過pathways in cancer(hsa05200)、hepatitis B(hsa04066)、influenza A(hsa05164)等通路作用于PIK3CG、NF-κB1A、CAPS3等靶點(diǎn)，發(fā)揮抗炎、抗休克等作用。分子對(duì)接結(jié)果表明：水黃皮次素、德爾妥因與PIKCG、NF-κB1A、CAPS3結(jié)合力較強(qiáng)，可能是抑制休克炎癥反應(yīng)的主要活性成分。本研究存在一些不足：有效成分相關(guān)靶點(diǎn)尋找和確認(rèn)方法需優(yōu)化，進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。