程扣輝 姜允奇 王文景 李文奇 李子健 馬鑫 馮磊

214122 江南大學(xué)藥學(xué)院和無錫醫(yī)學(xué)院(程扣輝、李文奇)；100191 北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科、血管醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，心血管受體研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(姜允奇、王文景、李子健)；214122 江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院(馬鑫、馮磊)

在能量不足或能量消耗增加時(shí)，哺乳動(dòng)物脂肪組織激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致白色脂肪組織中的三酰甘油在一系列脂肪酶如三酰甘油脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)、激素敏感脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)和單?；视椭久傅鹊淖饔孟?，分解為游離脂肪酸和甘油，從而滿足生理需要[1-2]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞的脂解涉及蛋白質(zhì)復(fù)合物在脂滴表面的組裝和拆解。β腎上腺素能受體(β-adrenergic receptor，β-AR)是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，介導(dǎo)多種腎上腺素和去甲腎上腺素的生理反應(yīng)[3]，腎上腺素與β-AR結(jié)合，激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)通路，導(dǎo)致ATGL磷酸化，并觸發(fā)脂肪分解[4-6]。除PKA經(jīng)典通路外，研究還發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺可通過激活β-AR/Gi/Src通路，促進(jìn)脂肪分解[7-9]。肉瘤病毒蛋白(sarcoma，Src)是一種非受體酪氨酸激酶，盡管有研究表明在細(xì)胞水平抑制Src激酶活性可減輕異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)誘導(dǎo)的脂肪分解，但在整體動(dòng)物層面上關(guān)于Src在AR激活誘導(dǎo)的脂肪分解中的作用還未得到證實(shí)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在整體動(dòng)物水平探討Src在ISO誘導(dǎo)脂肪分解中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)(Gibco公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；Bicinchoninic acid(BCA)蛋白定量試劑盒(Thermo scientific公司)；DMSO(Sigma公司)；ISO(Sigma公司)；Src抑制劑吡唑并嘧啶類化合物(4-amino-5-(4-methylphenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3，4-d]-pyrimidine，PP1)(Sigma公司)；p-Src抗體(1∶1 000，Cell signaling公司)；t-Src抗體(1∶1 000，Cell signaling公司)；β-actin抗體(1∶10 000，Cell signaling公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(中杉金橋公司)；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(中杉金橋公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；qPCR Super mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；RT-PCR引物合成(北京生工生物技術(shù)公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性10周齡的C57BL/6野生型小鼠購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心及北京維通利華公司，飼養(yǎng)環(huán)境由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(室溫23℃、相對濕度65%、12 h明暗交替)。所有動(dòng)物均經(jīng)過北京大學(xué)健康科學(xué)中心機(jī)構(gòu)護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將小鼠分為對照組、ISO組和ISO+PP1組。ISO組每天背部皮下注射10 mg/kg體重的ISO，連續(xù)2周；ISO+PP1組，在此2周內(nèi)，腹腔注射1.5 mg/kg體重的PP1，每周3次。

1.3 細(xì)胞處理

小鼠前體脂肪細(xì)胞系3T3-L1使用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS、100 Unit/ml Penicillin和100 μg/ml Streptomycin)在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。ISO組：1 μM ISO處理；ISO+PP1組：PP1預(yù)孵育1 h后用ISO處理；對照組：加入相同體積DMSO。

1.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

將處理好的3T3-L1細(xì)胞加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上裂解細(xì)胞15 min后，用細(xì)胞刮收集勻漿液，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，加入1/4體積的5×loading buffer，100℃煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性。使用10% SDS-PAGE凝膠分離細(xì)胞裂解物。將蛋白從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜中，之后用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。將NC膜條帶置于特制的抗體孵育盒，加入一抗，置于4℃冷室中240 r/min的搖床上過夜孵育。次日回收一抗，TBST洗膜(10 min，3次)，然后用加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗室溫孵育1 h，棄去二抗，TBST洗膜(10 min，3次)后即可顯影。

1.5 RNA分離和實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)

使用Trizol試劑(Ambion，Life Technologies，MA，USA)從小鼠附睪脂肪組織和3T3-L1細(xì)胞中提取總RNA。紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再用SYBR qPCR Master Mix試劑盒在20 μl反應(yīng)體系下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測相關(guān)基因mRNA表達(dá)。引物序列見表1。以GAPDH作為內(nèi)參，每個(gè)樣三個(gè)復(fù)孔，采用Δ循環(huán)閾值(Ct)法處理結(jié)果，所有基因表達(dá)結(jié)果表示為倍數(shù)的變化，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。PCR擴(kuò)增程序如下：其中預(yù)變性為95℃，30 s；循環(huán)反應(yīng)為95℃，10 s；60℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)；融解曲線反應(yīng)為95℃，15 s；60℃，60 s；95℃，15 s。每個(gè)循環(huán)結(jié)束后監(jiān)測SYBR GreenⅠ熒光發(fā)射。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ISO誘導(dǎo)小鼠附睪脂肪分解

在小鼠背部注射ISO 2周后，檢測小鼠附睪脂肪重量，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，ISO組小鼠的附睪脂肪顯著減少(P<0.001)，但兩組小鼠體重?zé)o明顯差異(圖1A～D)；蘇木精和伊紅(HE)染色顯示，與對照組相比，ISO組的脂肪細(xì)胞大小顯著降低(P<0.001)(圖1E)。qPCR分析表明，與對照組相比，ISO組的附睪脂肪中脂解相關(guān)基因ATGL的mRNA水平顯著升高(P<0.05)(圖1F)；脂肪合成基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorsγ，PPARγ)和脂蛋白脂肪酶(lipoprtein lipase，LPL)的mRNA水平均顯著降低(均為P<0.01)(圖1G)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ISO在小鼠體內(nèi)可促進(jìn)脂肪分解。

CON：對照組；ISO：異丙腎上腺組；A：小鼠附睪脂肪大體圖(比例尺刻度單位：mm)及附睪脂肪重量；B：小鼠體重；C：附睪脂肪重量與體重的比值；D：附睪脂肪重量與脛骨長度的比值；E：小鼠附睪脂肪組織HE染色(標(biāo)尺：50 μm)及細(xì)胞大小統(tǒng)計(jì)；F：脂肪分解基因ATGL mRNA的表達(dá)水平；G：脂肪合成基因PPARγ和LPL mRNA的表達(dá)水平。與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001(n=4)

2.2 ISO刺激促進(jìn)Src活性

給予脂肪細(xì)胞ISO刺激后，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示Src磷酸化顯著增加(P<0.05)，見圖2，提示ISO刺激誘導(dǎo)Src活性增加。

CON：對照組；ISO：異丙腎上腺組；A：蛋白免疫印跡；B：Src磷酸化數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。與對照組相比，aP<0.05(n=5)

2.3 PP1抑制ISO誘導(dǎo)的Src激活

PP1是Src酪氨酸激酶的高效抑制劑[10]。在給予脂肪細(xì)胞PP1預(yù)處理后，蛋白免疫印跡分析表明，ISO刺激誘導(dǎo)的Src磷酸化被顯著抑制(P<0.01)，見圖3。

CON：對照組；ISO：異丙腎上腺組；ISO+PPI：異丙腎上腺+吡唑并嘧啶類化合物組；A：蛋白免疫印跡；B：Src磷酸化數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。與對照組相比，aP<0.05；與ISO組相比，bP<0.01(n=5)

2.4 ISO誘導(dǎo)小鼠附睪脂肪分解依賴于Src

在小鼠注射ISO的同時(shí)注射Src激酶抑制劑PP1后，檢測脂肪分解相關(guān)指標(biāo)顯示，與ISO組相比，ISO+PP1組小鼠附睪脂肪重量增加(P<0.05)，但三組小鼠體重?zé)o明顯差異(圖4A～B)；此外，與ISO組相比，ISO+PP1組小鼠的附睪脂肪重量與體重比值(P<0.01)以及與脛骨長度比值(P<0.05)均顯著增加(圖4C～D)。HE染色顯示，與ISO組相比，ISO+PP1組脂肪細(xì)胞變大(P<0.001)(圖4E)。qPCR數(shù)據(jù)分析表明，與ISO組相比，ISO+PP1組小鼠附睪脂肪脂解基因ATGLmRNA水平顯著降低(P<0.01)(圖4F)；脂肪合成基因PPARγ(P<0.01)和LPL的mRNA水平升高(圖4G)。提示ISO在小鼠體內(nèi)促進(jìn)脂肪分解的作用在一定程度上依賴Src激酶活性。

CON：對照組；ISO：異丙腎上腺組；ISO+PPI：異丙腎上腺+吡唑并嘧啶類化合物組；A：小鼠附睪脂肪大體圖(比例尺刻度單位：mm)及附睪脂肪重量；B：小鼠體重；C：附睪脂肪重量與體重的比值；D：附睪脂肪重量與脛骨長度的比值；E：小鼠附睪脂肪組織HE染色(標(biāo)尺：50 μm)及細(xì)胞大小統(tǒng)計(jì)；F：脂肪分解基因ATGL mRNA的表達(dá)水平；G：脂肪合成基因PPARγ和LPL mRNA的表達(dá)水平。與對照組相比，aP<0.01，bP<0.001；與ISO組相比，AP<0.05，BP<0.01，CP<0.001(n=4)

3 討論

在正常情況下，哺乳動(dòng)物脂肪組織能夠微調(diào)一系列神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)，精確地適應(yīng)三酰甘油合成(脂肪生成)和分解(脂肪分解)之間的平衡，以滿足生理需要[11-12]。脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分解過程中三酰甘油貯存和動(dòng)員的控制因子是脂質(zhì)積累的重要調(diào)控者，一旦某些調(diào)控因子功能失效，脂解作用發(fā)生紊亂，則能夠?qū)е聶C(jī)體脂肪酸利用失常，誘發(fā)肥胖、胰島素抵抗和糖尿病等疾病[13-14]。脂肪細(xì)胞分解產(chǎn)生的游離脂肪酸是外周組織能量需求時(shí)重要燃料；此外，釋放的游離脂肪酸也可調(diào)節(jié)葡萄糖和胰島素的活性和產(chǎn)生，參與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展[15-16]。因此，脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分解不僅調(diào)節(jié)能量平衡和脂肪分布，其對于代謝穩(wěn)態(tài)也是至關(guān)重要的。

脂肪分解過程ATGL水解三酰甘油成二?；视停_始脂解過程；HSL催化二?；视蜕蓡熙８视?；單?；视椭久缸罱K會(huì)水解單酰甘油轉(zhuǎn)化成脂肪酸和甘油。2004年，ATGL首次被描述為三酰甘油水解酶，其特異性水解三酰甘油，對其他脂質(zhì)底物的活性非常有限。研究表明，ATGL在脂肪組織中高度表達(dá)；同時(shí)，它也在心臟、骨骼肌、肝臟和其他組織中表達(dá)[17-18]。ATGL活性受磷酸化修飾的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)AMP活化蛋白激酶使ATGL Ser406位點(diǎn)磷酸化，增加了ATGL的活性，從而增加脂肪分解[19]。其次，HSL是最早發(fā)現(xiàn)的脂解酶，其活性對兒茶酚胺、促腎上腺皮質(zhì)激素和胰高血糖素等激素敏感[20]。與ATGL類似，HSL在脂肪組織中高表達(dá)，在肌肉、睪丸、類固醇組織和胰島等其他組織中均可檢測到其表達(dá)[21]。兒茶酚胺是脂解的主要正向調(diào)節(jié)因子，通過與β-AR結(jié)合，引起AR激活，AR屬于G蛋白偶聯(lián)蛋白受體家族。AR激活引起偶聯(lián)的G蛋白亞基被釋放，根據(jù)G蛋白的亞型激活(Gs亞基)或抑制(Gi亞基)腺苷酸環(huán)化酶活性[7]。激活的腺苷酸環(huán)化酶可增加細(xì)胞質(zhì)中環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平，隨后導(dǎo)致蛋白激酶A(protein kinase A，PKA，也稱為cAMP依賴蛋白激酶)的激活，從而使HSL磷酸化并強(qiáng)烈激活脂解[3-6]。β-AR存在3種亞型，β1-AR、β2-AR、β3-AR，它們在脂肪細(xì)胞中共同表達(dá)，其中β3-AR在脂肪細(xì)胞中表達(dá)最豐富，其與異源三聚體G蛋白Gs結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP的升高和PKA的激活[22]。然而，也有證據(jù)表明，這些受體也可與Gi結(jié)合導(dǎo)致Src招募，進(jìn)而促進(jìn)Src/Erk依賴性的脂肪分解，促進(jìn)脂肪的進(jìn)一步分解[23]。

在本研究中，我們通過在小鼠體內(nèi)皮下連續(xù)注射ISO兩周后發(fā)現(xiàn)，小鼠附睪脂肪重量顯著降低，脂肪細(xì)胞較對照組顯著變小，脂肪分解和合成基因的mRNA水平與脂肪重量變化一致。此外文獻(xiàn)研究表明，Src在3T3-L1細(xì)胞脂肪分解中起一定作用[7，24]，我們在細(xì)胞水平上的結(jié)果與文獻(xiàn)結(jié)果一致，證實(shí)ISO能增加Src的磷酸化，PP1預(yù)處理后Src活性顯著降低。同樣，在小鼠體內(nèi)腹腔注射Src激酶抑制劑PP1后發(fā)現(xiàn)，小鼠附睪脂肪重量較ISO組顯著升高，脂肪細(xì)胞顯著變大，脂肪分解和合成基因的mRNA水平與脂肪重量變化一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Src激酶活性在AR激活誘導(dǎo)的脂肪分解中起一定作用。因此，我們研究證實(shí)了在動(dòng)物體內(nèi)β-AR激動(dòng)劑ISO誘導(dǎo)脂肪分解依賴Src激酶活性。

本研究存在不足之處：Src在體內(nèi)通過影響脂解基因如ATGL和HSL去促進(jìn)脂肪分解的進(jìn)一步機(jī)制還亟待研究?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)Src在ISO誘導(dǎo)的脂肪分解中存在一定作用，未來可通過干預(yù)Src激酶活性從而改善肥胖等相關(guān)代謝性疾病。

利益沖突：無