方鐵輝，董 慧,2，肖世峰,2，王 劭,2，程曉霞,2，林鋒強(qiáng),2，朱小麗,2，陳秀琴,2，鄭 敏,2，陳仕龍,2 ，陳少鶯,2

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2. 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】干擾素（Interferon，IFN）是宿主細(xì)胞分泌的一類廣譜的抗病毒細(xì)胞因子，在抗病毒感染的天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。IFN根據(jù)其結(jié)合的受體不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3種基本類型，其中Ⅰ、Ⅲ型干擾素與天然免疫密切相關(guān)，Ⅰ型干擾素來源廣泛，幾乎所有的細(xì)胞均能產(chǎn)生，主要包括IFN-α和IFN-β[1]。宿主為了抵御病毒的入侵，上調(diào)表達(dá)IFN-β等Ⅰ型、Ⅲ型干擾素，迅速啟動(dòng)抗病毒天然免疫應(yīng)答；而病毒為了能夠持續(xù)感染和致病，往往進(jìn)化出拮抗或逃逸宿主天然免疫的功能[2]。檢測宿主細(xì)胞干擾素的表達(dá)水平能反應(yīng)宿主的天然免疫狀態(tài)，為評價(jià)宿主的抗病毒水平及研究病毒拮抗宿主天然免疫的功能提供依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】國內(nèi)外對鴨IFN-α的克隆、表達(dá)、檢測及功能研究有較多報(bào)道[3-5]，而鴨IFN-β的克隆、表達(dá)及抗病毒活性研究較少。高全新等[6]建立了基于熒光素酶雙報(bào)告基因系統(tǒng)測定鴨IFN-β的表達(dá)水平的檢測方法，一些學(xué)者用qPCR檢測了禽坦布蘇病毒等水禽病毒感染宿主后IFN-β及天然免疫相關(guān)基因mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平[7-8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR常用于基因的mRNA表達(dá)水平的檢測，不僅能夠準(zhǔn)確對表達(dá)量進(jìn)行定量，而且操作簡便、快速[9-10]。準(zhǔn)確定量測定鴨IFN-β mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR方法目前仍少有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在建立一種用于檢測鴨IFN-β mRNA表達(dá)水平的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法，為檢測鴨體內(nèi)和細(xì)胞中IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平提供一種有效的檢測手段，也為研究病毒感染與宿主天然免疫應(yīng)答的互作研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

無菌采集7日齡健康櫻桃谷鴨脾臟、肝臟及胰腺，無菌Hank’s液研磨成勻漿，-70 ℃保存?zhèn)溆?；原核表達(dá)載體pET-30a由本實(shí)驗(yàn)室保存；DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司（全式金）；鴨胚成纖維細(xì)胞傳代細(xì)胞系（DEFs）購自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

CFX 96熒 光 定 量PCR儀（Bio-Rad）、梯度PCR儀（Bio-Rad），RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Ⅰ qPCR MIX、RNA提取試劑盒及RNA純化試劑盒（全式金），DNAase（TIANGEN）、BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶（Takara），Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、膠回收試劑盒（諾維贊），T4 DNA連接酶（NEB），質(zhì)粒小提試劑盒（QIAGEN）。2×DreamTaqGreen PCR Master Mix（Thermo Scientific）。

1.3 引物合成

據(jù)GenBank公 布 的 鴨IFN-β（KT428159）的cDNA序列，采用Oligo 7軟件合成鴨IFN-β全長引物，并在其上、下游分別引入BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位點(diǎn)，在其保守序列區(qū)設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物，將擴(kuò)增的IFN-β全長片段用于構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并作為熒光定量PCR陽性標(biāo)準(zhǔn)品；設(shè)計(jì)一條能特異擴(kuò)增鴨IFN-β的qPCR引物，以上引物均由白鯨生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物核苷酸序列及擴(kuò)增片段大小Table 1 Primer sequences and amplified fragment sizes

1.4 組織RNA提取及cDNA合成

用總RNA提取試劑盒按操作說明書分別提取鴨脾臟、肝臟、胰腺及DEFs細(xì)胞的總RNA，提取的RNA經(jīng)DNAase消化后，用RNA純化試劑盒純化，溶于35 μL DEPC水，用于合成cDNA。按20 μL反應(yīng)體系：總RNA 1 μg，5×Super Mix 4 μL，gDNA Remove 1 μL，加水補(bǔ)至20 μL，按說明書反應(yīng)程序50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s合成cDNA。合成的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?，用于常?guī)PCR擴(kuò)增IFN-β全長及熒光定量PCR檢測。

1.5 鴨IFN-β重組表達(dá)質(zhì)粒的制備

用表1的Full-IFN-β-F、Full-IFN-β-R為上下游引物，脾臟組織獲得cDNA作為模板，用高保真酶做常規(guī)PCR擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系50 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物各2 μL，2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP MIX 1 μL，DNA Polymerase 1 μL，加DEPC水補(bǔ)至50 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變 性40 s，61.5 ℃退 火40 s，72 ℃延 伸40 s，72 ℃終延伸5 min，共進(jìn)行33個(gè)循環(huán)。用凝膠回收試劑盒回收目的條帶。對回收的PCR產(chǎn)物及表達(dá)載體pET-30a分別用BamH Ⅰ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，回收純化的雙酶切產(chǎn)物，并用T4 DNA連接酶將目的基因同表達(dá)載體pET-30a進(jìn)行重組連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，卡那抗性的LB培養(yǎng)基上涂板，挑單菌落搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒用于PCR和測序驗(yàn)證，將測序驗(yàn)證陽性的重組克隆質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，用核酸濃度測定儀測定DNA濃度后，按公式copies=6.02×1023×（質(zhì)量/分子質(zhì)量），計(jì)算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)，并以10倍比稀釋至下限為10-1copies·μL-1。

1.6 常規(guī)PCR及熒光定量PCR

以表1所設(shè)計(jì)的qIFNβ-F、qIFNβ-R作為引物，常規(guī)PCR反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 μL，上、下游各1 μL，模板cDNA 1 μL，DEPC水7 μL，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸5 min，共進(jìn)行33個(gè)循環(huán)。qPCR反應(yīng)體系20 μL：上、下游各0.5 μL，2×qPCR Super Mix 10 μL，模板cDNA 1 μL，DNA/RNA free水8 μL，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s進(jìn)行退火和延伸，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，而后進(jìn)行熒光信號采集。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以倍比稀釋的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒1×101～1×108copies·μL-1作 為 模 板，以qIFN-β-F、qIFN-β-R作為qPCR上下游引物，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增及分析，并計(jì)算Ct值用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 特異性及敏感性試驗(yàn)

分別用常規(guī)PCR和熒光定量PCR驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的IFN-β qPCR引物的特異性，分析產(chǎn)物的熔解曲線及對產(chǎn)物進(jìn)行核酸凝膠電泳分析，將10-1～103copies·μL-1的陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，用于檢測qPCR反應(yīng)的檢出下限。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

分別用所建立的qPCR檢測方法檢測鴨脾臟、肝臟、胰腺3種不同的組織樣品mRNA表達(dá)水平，組間組內(nèi)各進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn)，并計(jì)算變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨IFN-β重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用Full-IFN-β-F、Full-IFN-β-R引物從鴨脾臟組織樣品中擴(kuò)增出732 bp鴨IFN-β的完整基因片段（圖1-A）。構(gòu)建的pET-30a-IFN-β重組表達(dá)質(zhì)粒也能擴(kuò)增出732 bp的目的條帶（圖1-B），重組質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ和HindⅢ雙酶切后出現(xiàn)732 bp的目的片段和5.4 kb左右的載體條帶（圖1-C）；將陽性克隆質(zhì)粒送生工測序，測序結(jié)果與GenBank中的鴨IFN-β（KM035791）和（KT428159）核苷酸同源性分別為100%和99.77%，表明鴨IFN-β成功導(dǎo)入pET-30a。

圖1 鴨IFN-β全基因的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 1 PCR amplification of duck IFN-β and construction of recombinant plasmid

2.2 熒光定量PCR檢測

以qIFN-β-F、qIFN-β-R為引物，不同組織來源的cDNA作為模板（肝、脾、胰和DEFs），分別進(jìn)行qPCR和常規(guī)PCR檢測。結(jié)果顯示，qPCR和常規(guī)PCR均能擴(kuò)增出特異的165 bp預(yù)期目的片段（圖2），且qPCR產(chǎn)物熔解曲線單峰，熔解溫度為87.94±0.16 ℃（圖3），PCR產(chǎn)物序列與鴨IFN-β序列一致，證明所設(shè)計(jì)的qPCR引物特異性強(qiáng)，無引物二聚體及非特異擴(kuò)增。

圖2 不同組織IFN-β的常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCRFig. 2 Conventional RT-PCR and qRT-PCR amplification of IFN-β in different tissues

圖3 鴨4種組織（肝、脾、胰和DEFs）IFN-β 熒光定量RTPCR熔解曲線Fig. 3 qRT-PCR melting curve of duck IFN-β

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將所構(gòu)建的 pET-30a-IFN-β重組質(zhì)粒按10倍比梯度稀釋，取8個(gè)梯度的（2.84×101～2.84×108copies·μL-1）的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行qPCR檢測，計(jì)算Ct值并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4可見，Ct值與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9951，鴨IFN-β標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.5444x+38.195，擴(kuò)增效率E=92%（圖5），圖4為IFN-β的擴(kuò)增曲線。

圖4 IFN-β 熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線Fig. 4 Amplification curve of qRT-PCR for IFN-β

圖5 IFN-β 熒光定量RT-PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Standard curve of qRT-PCR for IFN-β

2.4 靈敏度檢驗(yàn)

取含量為2.84×10-1～2.84×103copies·μL-1陽性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒作為模板，每個(gè)樣品組內(nèi)重復(fù)3次，進(jìn)行qPCR檢測，各不同濃度樣品的Ct值（X±SD）見表2。所建立鴨IFN-β SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法可檢出下限為2.84 copies·μL-1，且在28.4 copies·μL-1以上的模板含量有良好的重復(fù)性。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR敏感性檢測Table 2 Sensitivity of qRT-PCR assay

2.5 重復(fù)性檢驗(yàn)

將所采集自雛鴨的肝、脾、胰3種不同組織樣品，以所建立的IFN-β 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法分別進(jìn)行3次重復(fù)，進(jìn)行組間及組內(nèi)重復(fù)性檢測。結(jié)果顯示，3種不同組織樣品檢測的組內(nèi)Ct值變異系數(shù)為0.11%～0.13%，組間Ct值變異系數(shù)均不超過1%（表3）。表明所建立的檢測方法重復(fù)性良好。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的批內(nèi)與批間重復(fù)性評價(jià)結(jié)果Table 3 Reproducibility of intra- and inter-qRT-PCR assays

3 討論與結(jié)論

宿主體內(nèi)的多種細(xì)胞能夠分泌IFN-β，如淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。當(dāng)病毒感染后，宿主細(xì)胞分泌的IFN-β等干擾素并不直接殺傷或抑制病毒，而是與細(xì)胞表明的干擾素受體結(jié)合，通過JAKSTAT途徑激活下游多種干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)，這些ISGs分泌的抗病毒蛋白發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤和抗炎等免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[11-12]。Li Ning等[13]發(fā)現(xiàn)鴨MAVS蛋白能夠激活鴨IFN-β表達(dá)，進(jìn)而抑制感染早期時(shí)病毒的復(fù)制；Zhang Huihui等[14]、Li Ning等[15]發(fā)現(xiàn)宿主過表達(dá)鴨DDX1和DDX3X基因能夠激活鴨IFN-β等天然免疫信號通路，抑制病毒的復(fù)制；He Tianqiong等[16]發(fā)現(xiàn)鴨病毒性腸炎病毒的pUL47蛋白能夠抑制體內(nèi)IFN-β及下游抗病毒蛋白的表達(dá)；DTMUV NS2A蛋白通過與duSTING結(jié)合，抑制鴨IFN-β轉(zhuǎn)錄，破壞STING介導(dǎo)的抗病毒天然免疫[17]。因此，IFN-β等Ⅰ型干擾素的轉(zhuǎn)錄水平是機(jī)體天然免疫的重要評價(jià)指標(biāo)。

SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)無需設(shè)計(jì)探針、靈敏度高、操作方便，自動(dòng)化程度高，減少了常規(guī)PCR的上樣電泳步驟，有效縮短了檢測時(shí)間，但對引物的設(shè)計(jì)要求較高。本研究設(shè)計(jì)的IFN-β引物，常規(guī)PCR擴(kuò)增出現(xiàn)165 bp目的片段，熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為單峰，均具有良好的特異性，適合用于建立鴨IFN-β SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。

本研究構(gòu)建了pET-30a-IFN-β重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，通過繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=-3.5444x+38.195，相關(guān)系數(shù)R2＞99.5%，表明線性擬合程度好，該方法靈敏度高，檢測下限為2.84 copies·μL-1，重復(fù)性良好，不同組織樣品的組內(nèi)變異系數(shù)為0.11%～0.13%，組間變異系數(shù)不超過1%，可以直接用于樣品IFN-β mRNA表達(dá)量的準(zhǔn)確定量檢測。本研究建立的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法還可以利用GAPDH或β-Actin等管家基因作為內(nèi)參，熒光定量PCR儀上同時(shí)進(jìn)行IFN-β和管家基因的檢測，得到IFN-β mRNA表達(dá)水平的相對定量，明確IFN-β mRNA在不同組織和細(xì)胞中的表達(dá)差異，為從mRNA水平上研究鴨應(yīng)答病原微生物感染的免疫調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。