胡 璇，王 凱，于福來(lái) ，王 丹，謝小麗，龐玉新 ，陳鴻發(fā)

（1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/海南省艾納香工程技術(shù)研究中心，海南 ?？?571101；2. 廣東藥科大學(xué)中藥資源學(xué)院，廣東 云浮 527500；3. 海南艾納香生物科技發(fā)展股份有限公司，海南 海口 570208）

0 引言

【研究意義】口腔的感染性疾病如齲齒、牙齦炎、牙周炎、牙齦膿腫、口臭等都與口腔厭氧菌致病密切相關(guān)，西藥雖然能迅速緩解口腔不適癥狀，但長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生耐藥性和不良作用。大量研究顯示，許多中草藥提取物具有較好的體外抑菌作用，又很少使病原菌產(chǎn)生抗藥性，因此在控制細(xì)菌感染性疾病方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[1-2]，尋找天然、安全、對(duì)口腔細(xì)菌具有良好抑菌作用的中草藥提取物是目前口腔疾病防治研究的重點(diǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】艾納香為菊科（Asteraceae）艾納香屬（Blumea）植物艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.的新鮮或干燥地上部分，氣味芳香，具有抗菌消炎、祛風(fēng)除濕、清熱解毒、清咽利喉的功效[3]。艾納香作為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥藥品原料，主要分布于海南、貴州、廣東、廣西等省（區(qū)）。艾納香油、艾粉和艾片均是艾納香主要提取物，艾粉是艾納香的葉和枝經(jīng)水蒸氣蒸餾提煉出來(lái)的粗加工品，作為原料前體物可進(jìn)一步加工得到艾片，在精制艾片的過(guò)程中粗提物經(jīng)壓榨分離而得到的油即為艾納香油[4]，其中艾片是中華人民共和國(guó)藥典收載品種，是常用藥物天然冰片的來(lái)源之一，其含有的左旋龍腦成分為藥典規(guī)定的唯一指標(biāo)性成分[5]。查閱近年來(lái)艾納香化學(xué)成分和抑菌相關(guān)文獻(xiàn)，主要集中于黃酮類、艾納香揮發(fā)油等提取部位的化學(xué)成分分析和大部分常見(jiàn)需氧菌的抑菌作用研究[6-7]。李安等[8]研究發(fā)現(xiàn)微波輔助提取的艾納香油對(duì)5種受試細(xì)菌和真菌具有較強(qiáng)的抗菌能力，對(duì)真菌的抑制效果明顯強(qiáng)于細(xì)菌，其中對(duì)黃曲霉的抑制效果最佳。Sakee等[9]采用圓盤(pán)擴(kuò)散法和瓊脂微稀釋法評(píng)估艾納香不同溶劑提取物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)艾納香油抑菌效果最佳，對(duì)蠟樣芽孢桿菌的MIC為150 μg·mL-1，對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC為1.2 mg·mL-1。聞慶等[10]證實(shí)提取艾納香油和艾片殘留的艾渣不同萃取部位同樣具有較好的體外抗菌活性，尤以三氯甲烷萃取部位對(duì)乙型溶血性鏈球菌和大腸埃希菌的抑制作用顯著?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，同時(shí)對(duì)艾納香3種提取物進(jìn)行綜合GC-MS分析以及綜合活性評(píng)價(jià)分析，并對(duì)其口腔常見(jiàn)厭氧菌的抑菌性的相關(guān)研究仍較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)艾納香葉的3種主要提取物艾納香油、艾粉和艾片采用GC-MS技術(shù)分析其成分，并分別對(duì)4株口腔臨床常見(jiàn)厭氧菌變形鏈球菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌進(jìn)行體外抑菌活性研究，旨在為天然藥用植物艾納香的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備

艾納香油、艾粉和艾片均源自貴州羅甸同批艾納香藥材提取物，經(jīng)中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所于福來(lái)副研究員鑒定均為菊科艾納香屬植物艾納香Blumea balsamifera（L.）DC.的不同提取物。變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株（Streptococcus mutans，ATCC25175）、具核梭桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（Fusobacterium nucleatum，ATCC10953）、牙齦卟啉單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株（Porphyromonas gingivalis，ATCC33277）、中間普氏菌標(biāo)準(zhǔn)株（Prevotella intermedia，ATCC25611）均由成都里來(lái)生物科技有限公司分子生物檢驗(yàn)室提供。兔血腦心浸出液肉湯（BHI）培養(yǎng)基（上海源葉生物科技有限公司），厭氧肉肝湯（北京索萊寶科技有限公司）。

7890A/5975C GC/MS聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司），XFS-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新風(fēng)醫(yī)療器械有限公司），SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇州廣源凈化科技有限公司），DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海申苗醫(yī)療器械制造有限公司），厭氧培養(yǎng)罐（日本三菱公司），Sartarius CPA225D電子分析天平［賽多利斯（北京）科學(xué)儀器有限公司］，DU-800紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（美國(guó)貝克曼公司），SpectraMax Plus384酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司），氨芐青霉素（福州飛凈生物科技有限公司，批號(hào)：181120），二甲基亞砜、95%乙醇均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為滅菌蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 艾納香提取物化學(xué)成分分析 采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對(duì)艾納香3種提取物艾納香油、艾粉和艾片進(jìn)行化學(xué)成分分析[11]。精密量取艾納香油100 μL，精密稱取艾粉和艾片50 mg，均用二氯甲烷溶解并定容至10 mL，過(guò)0.45 μm濾膜即得上機(jī)樣品。GC條件：色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；載氣為高純氦氣（99.99%），載氣流量1.0 mL·min-1，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度260 ℃，初始溫度50 ℃保持1 min；以3 ℃·min-1升至200 ℃，保持5 min；以2 ℃·min-1，升至260 ℃，保持10 min。MS條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度260 ℃，MS四級(jí)桿溫度150 ℃，溶劑延遲5 min，掃描范圍20～450 amu，進(jìn)樣量1.0 μL。樣品經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜分析，各分離組分采用NIST17譜庫(kù)進(jìn)行檢索，并結(jié)合人工解析和參考文獻(xiàn)分析確定各化學(xué)成分，相對(duì)含量采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算。

1.2.2 供試菌懸浮液的制備 將低溫保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株變形鏈球菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌和中間普氏菌各取50 μL接種至兔血BHI培養(yǎng)基中，劃線使其能形成單個(gè)菌落，將接種平板放至厭氧箱中（80% N2，10% H2，10% CO2）培養(yǎng)3 d活化。然后挑取平板菌落接種至厭氧肉肝湯中培養(yǎng)72 h，紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度OD600nm為0.5～1.0，檢驗(yàn)純度后用相應(yīng)的培養(yǎng)液將菌液稀釋成1×107CFU·mL-1的菌懸液備用。

1.2.3 藥敏試驗(yàn) 將艾納香油（油狀藥物）與95%乙醇進(jìn)行溶解稀釋，體積比為666.7 μL·mL-1，艾粉、艾片用95%乙醇分別配制成2 g·mL-1的基礎(chǔ)藥物溶液，試驗(yàn)前所有藥液均用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，采用管碟法進(jìn)行測(cè)定[12-13]。按無(wú)菌操作法，吸取備好的4種厭氧菌菌液200 μL至BHI培養(yǎng)基表面，用無(wú)菌棉簽涂布均勻，室溫放置2～3 min，待平板表面菌液吸收后，將直徑約為6 mm無(wú)菌牛津杯固定于培養(yǎng)基上，并標(biāo)記好各藥物的名稱，每個(gè)培養(yǎng)基可放置3個(gè)牛津杯。再用移液槍在每個(gè)牛津杯中分別加各提取物藥液50 μL，每個(gè)菌種重復(fù)3次，置37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)3～5 d后，觀察并記錄抑菌圈的有無(wú)以及直徑大小作為判斷敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)，并用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量每個(gè)抑菌圈直徑大小，取其平均值作為測(cè)定結(jié)果。結(jié)果判定按《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)[14]：抑菌圈直徑＜10 mm為抗藥，10 mm為輕度敏感，11～15 mm為中度敏感，16～20 mm為高度敏感。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 將“1.2.3”中艾納香油基礎(chǔ)藥物溶液5倍稀釋至133.34 μL·mL-1，艾粉和艾片5倍稀釋至400 mg·mL-1。采用微量肉湯稀釋法[15]，取96孔微量板，在無(wú)菌操作下用移液槍向每排11孔各加入100 μL厭氧肉干湯培養(yǎng)基，再吸取100 μL稀釋后的3種提取物藥液至第一孔，以第一孔艾納香油體積比為66.7 μL·mL-1、艾粉和艾片質(zhì)量濃度為200 mg·mL-1作為起始濃度采用對(duì)倍稀釋法稀釋成相應(yīng)濃度，第10孔中吸取100 μL棄去，此為試驗(yàn)組。吸取100 μL配置好的菌懸液依次加入第1～11孔中，充分混勻。第11孔不加試藥，以便觀察培養(yǎng)基是否適合菌株生長(zhǎng)，為生長(zhǎng)對(duì)照組，吸取200 μL厭氧肉干湯肉湯培養(yǎng)基加入到第12孔以便觀察培養(yǎng)基否被污染。共4種口腔常見(jiàn)厭氧菌細(xì)菌（變形鏈球菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌），每種細(xì)菌3個(gè)重復(fù)。隨后將96微孔板放置于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。取出后采用酶標(biāo)儀測(cè)定OD600nm，與陰性對(duì)照組比較，抑菌率達(dá)到80%的樣品濃度就為該受試菌的MIC。氨芐青霉素（AMP）和95%乙醇作相同處理分別作為陽(yáng)性藥物對(duì)照和陰性溶劑對(duì)照。

1.2.5 最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定 采用瓊脂培養(yǎng)基平板法[14]，將MIC濃度及上下各一個(gè)濃度組的上述混合液各取出20 μL均勻涂布在的血平板相應(yīng)區(qū)域內(nèi)，厭氧培養(yǎng)48 h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以無(wú)菌生長(zhǎng)對(duì)應(yīng)相應(yīng)孔中的最低濃度即為3種提取物對(duì)4種厭氧菌的MBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾納香提取物化學(xué)成分GC-MS分析

在“1.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，得到艾納香油、艾粉和艾片的總離子流圖（圖1）。所得3種提取物各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)，采用峰面積歸一化法測(cè)定了各組分的百分含量，將其進(jìn)行分析比較，結(jié)果見(jiàn)表1～3。結(jié)果顯示艾納香油、艾粉和艾片經(jīng)GC-MS分析分別鑒別出56、19和8種化合物（相對(duì)含量低于0.10%沒(méi)有列出），已鑒定的成分分別占總峰面積的73.20%、92.25%和96.93%。3種提取物僅含有左旋龍腦1個(gè)共有成分，艾納香油、艾粉和艾片中左旋龍腦相對(duì)含量分別為13.36%、81.40%和76.07%；艾納香油和艾粉還同時(shí)含有成分silphiperfol-5-ene。艾納香油的化學(xué)組分相對(duì)較為復(fù)雜，主要為萜類化合物，大部分為單萜和倍半萜類，少量二萜和三萜類，相對(duì)含量較高的有長(zhǎng)葉烯-（V4）（13.45%）、左旋龍腦（13.36%）、合成樟腦（7.18%）以及纈草稀醛-4,7（11）二烯（7.66%）。艾粉和艾片中化學(xué)組分相對(duì)簡(jiǎn)單，大部分也以萜類化合物為主，左旋龍腦相對(duì)含量較高，分別為81.40%和76.07%，兩種提取物中含量?jī)H次于左旋龍腦的成分分別為左旋樟腦（8.27%）和右旋樟腦（20.53%）。

表1 艾納香油中化學(xué)組成成分Table 1 Chemical composition of blumea oil

圖1 艾納香油（A）、艾粉（B）和艾片（C）的總離子流色譜圖Fig. 1 GC-MS total ionic current chromatograms of blumea oil(A), blumea powder (B), and blumea camphor (C)

2.2 藥敏試驗(yàn)

艾納香油、艾粉和艾片對(duì)4種指示菌的抑菌圈直徑見(jiàn)表4。由表4結(jié)果可知3種艾納香提取物對(duì)變形鏈球菌、具核梭桿菌、中間普氏菌均有一定的抑菌活性，全部藥敏牛津杯周?chē)汲霈F(xiàn)了大小不等的邊界清晰的抑菌圈，除牙齦卟啉單胞菌外，對(duì)其他菌株抑菌圈均大于10 mm，表現(xiàn)出一定的藥敏性；3種提取物對(duì)牙齦卟啉單胞菌無(wú)明顯的抑制作用，艾納香油無(wú)抑菌圈出現(xiàn)，艾粉和艾片僅有一個(gè)重復(fù)出現(xiàn)了抑菌圈。由于艾納香油是按照體積濃度進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)課題組前期試驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)可知[4]，艾納香油與水的相對(duì)密度基本上接近1，按照密度進(jìn)行換算可知其藥敏試驗(yàn)質(zhì)量濃度為666.7 mg·mL-1，相對(duì)于艾粉和艾片質(zhì)量濃度（2 g·mL-1），其濃度相對(duì)較低，但表現(xiàn)出的藥敏作用無(wú)明顯差異，均屬于中度敏感。由此可知，艾納香油對(duì)中間普氏菌、變形鏈球菌、具核梭桿菌的抑菌敏感度強(qiáng)于艾粉和艾片。

表4 3種艾納香提取物對(duì)4株厭氧菌的平均抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果Table 4 Average antibacterial circle diameters of blumea products on 4 oral anaerobes

2.3 MIC值和MBC值測(cè)定

MIC和MBC結(jié)果中艾納香油均按照水的密度進(jìn)行換算，由表5結(jié)果可知艾納香油、艾粉和艾片對(duì)4株口腔厭氧菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，MIC在8.34～100 mg·mL-1，艾納香油的抑菌和殺菌效果最強(qiáng)（MIC、MBC分 別 在8.34～16.68、33.35～133.4 mg·mL-1），艾粉和艾片的抑菌和殺菌效果并無(wú)明顯差異。3種提取物對(duì)具核梭桿菌抑菌效果最佳，艾納香油、艾粉和艾片的MIC值分別為16.68 mg·mL-1，50 mg·mL-1，50 mg·mL-1，MBC值 分 別 為33.35 mg·mL-1，50 mg·mL-1，50 mg·mL-1。艾粉和艾片對(duì)牙齦卟啉單胞菌、艾粉對(duì)變形鏈球菌、艾片對(duì)中間普氏菌的MBC值均大于200 mg·mL-1，殺菌效果均不理想。其中陽(yáng)性對(duì)照藥物氨芐青霉素（AMP）對(duì)4株厭氧菌表現(xiàn)出了強(qiáng)抑菌效果，陰性對(duì)照95%乙醇無(wú)抑菌作用。

表5 3種艾納香提取物對(duì)4株厭氧菌的MIC和MBC測(cè)定結(jié)果Table 5 MICs and MBCs of blumea products against 4 oral anaerobes （單位：mg·mL-1）

3 討論與結(jié)論

由于口腔細(xì)菌耐藥性問(wèn)題使得中草藥代替西藥在口腔領(lǐng)域的研究越發(fā)迫切，近年來(lái)，在中草藥抑制主要致齲菌、牙周致病菌等方面開(kāi)展了大量的研究工作。研究表明，茶多酚[16]、黃芩[17]、五倍子[18]、厚樸[19]等中草藥及其制劑具有良好抑制口腔細(xì)菌的活性，充分說(shuō)明中草藥來(lái)源的活性成分應(yīng)用于口腔疾病的預(yù)防和治療具有良好的開(kāi)發(fā)利用潛力。艾納香油、艾粉和艾片為中草藥艾納香中3種主要提取物，通常采用工業(yè)水蒸氣蒸餾法可在同一工藝下獲得。艾納香油價(jià)格相對(duì)艾片較為便宜，鑒于其良好的生物活性，目前已被收錄于國(guó)際化妝品目錄中，艾納油作為主要抑菌劑和抗氧劑廣泛應(yīng)用于日化用品中[20]，而艾粉作為最初的粗提物，其應(yīng)用相對(duì)較少。雖然艾納香富含揮發(fā)油成分，但主要用途依然是精制天然冰片（艾片），在提取的過(guò)程中可得到艾納香油和艾粉。目前艾片作為天然冰片的一種，價(jià)格極其昂貴，常用作“引藥及佐藥”，在心腦血管中成藥中有較多與其配伍應(yīng)用[21]。

表2 艾粉中各化學(xué)成分Table 2 Chemical composition of blumea powder （±s, n=3）

表2 艾粉中各化學(xué)成分Table 2 Chemical composition of blumea powder （±s, n=3）

序號(hào)No.化合物 Compounds 保留時(shí)間Retention time/min化學(xué)式Chemical formula分子質(zhì)量Molecular mass相對(duì)含量Relative amount/%1 2-蒈烯 2-carene 8.05 C10H16 136.125 0.382 月桂烯 Beta.-myrcene 9.09 C10H16 136.125 0.323 左旋樟腦 l--camphor 16.47 C10H16O 152.12 8.274 左旋龍腦 l-borneol 18.49 C10H18O 154.136 81.405 Silphiperfol-5-ene 24.18 C15H24 204.188 0.226 1,1′-（4,6-二羥基苯）二乙酮 4,6-diacetyl-1,3-benzenediol 28.81 C10H10O4 194.058 0.137 silphiperfol-6-en-5-one 36.62 C15H22O 218.167 0.268 4′,6-二甲基-2-羥基苯乙酮 xanthoxylin 39.70 C10H12O4 196.074 0.189 （3S,3aS,6R,7R,9aS）-1,1,7-trimethyldecahydro-3a,7-methanocyclopenta[8]annulene-3,6-diol 47.39 C15H26O2 238.193 0.4110 2,2′-亞甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）phenol,2,2′-methylenebis[6-（1,1-dimethylethyl）-4-methyl- 67.49 C23H32O2 340.24 0.14

表3 艾片中各化學(xué)成分Table 3 Chemical composition of blumea camphor

艾納香3種提取物應(yīng)用不同，這與其提取工藝造成的化學(xué)成分差異具有密切的關(guān)系。艾納香油雖然左旋龍腦含量最低，但是其化學(xué)組分相對(duì)較為豐富，其含有的β-蒎烯、樟腦、芳樟醇等活性成分，具有鎮(zhèn)痛、消炎和抗菌等藥理活性[4]。目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)粗提物艾粉進(jìn)行相關(guān)活性研究。本研究發(fā)現(xiàn)艾粉對(duì)口腔致病菌具有一定的抑制作用，后續(xù)加強(qiáng)對(duì)艾粉中多種成分的定性定量分析將有助于其生物活性的深入探討。艾片中雖然化學(xué)成分相對(duì)較少，但是左旋龍腦含量最高，且純度高。Yu等[22]研究發(fā)現(xiàn)左旋龍腦能增加皮膚透皮性吸收，提高血腦屏障及黏膜的通透性，故艾片對(duì)調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和保護(hù)腦組織具有良好的效果。本研究中3種提取物對(duì)4株口腔厭氧菌均有不同程度的抑菌作用，艾納香3種提取物中均含有大量的萜類化合物，萜類化合物往往具有較強(qiáng)的抑菌效果，據(jù)報(bào)道可知其中含量較高的左旋龍腦對(duì)多種致病菌都有抑制作用表現(xiàn)出良好的抑菌作用[23]。3種提取物中艾納香油的抑菌效果最佳，充分說(shuō)明各有效成分通過(guò)相同或不同的作用機(jī)制，或協(xié)同或拮抗最終產(chǎn)生的藥效比單一成分產(chǎn)生的藥效更為顯著[24]。

本研究首次同時(shí)研究艾納香中3種重要提取物對(duì)口腔厭氧菌的抑菌活性，3種提取物對(duì)具核梭桿菌抑菌效果最強(qiáng)，具核梭桿菌是牙周炎的主要致病厭氧菌之一，其產(chǎn)生的內(nèi)毒素還能促發(fā)炎癥微環(huán)境作用，同時(shí)與胃腸道腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系[25]。研究結(jié)果為后續(xù)艾納香提取物在口腔領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)，但其對(duì)口腔致病厭氧菌的抑菌機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。