索旻，王越，劉夢(mèng)如，劉倍倍，陳蕾蕾，王悅，王志強(qiáng)，張慧娜，吳小凡

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征（OSA）被列為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的新危險(xiǎn)因素[1-2]，慢性間歇低氧（CIH）已被證實(shí)是OSA 的主要病理生理過程，并且可通過上調(diào)氧化應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[3]。CIH 下交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性顯著升高，有研究表明持續(xù)興奮的交感神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)使β3 腎上腺素能受體（β3 AR）出現(xiàn)脫敏現(xiàn)象，導(dǎo)致其活性下降[4]；常氧下活化β3 AR 可抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）活性，進(jìn)而減少活性氧產(chǎn)生[5]，然而CIH 下β3 AR 活化對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響及具體機(jī)制尚不明確。p22phox作為NOX 的重要亞基[6]，已被證明能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[7]，因此，CIH/β3 AR/氧化應(yīng)激通路很可能是CIH 促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的重要機(jī)制之一。本研究首先在載脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠中觀察活化β3 AR 對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的影響，進(jìn)一步聚焦氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生的主要場(chǎng)所——巨噬細(xì)胞，觀察CIH 下活化β3 AR 抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

主要試劑及材料：β3 AR 特異性激動(dòng)劑米拉貝隆購自美國MedChemExpress 公司；蘇木素-伊紅（HE）染液、青霉素-鏈霉素混合溶液和胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司；CD68、p22phox 和β3 AR 抗體均購自美國Abcam 公司；超氧化物陰離子熒光探針購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （GAPDH）抗體購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗和二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均購于北京中杉金橋公司；羊抗兔熒光二抗和羊抗小鼠熒光二抗均購自美國Li-Cor 公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；胎牛血清和RPMI 1640 培養(yǎng)基均購自美國Gibco 公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞：6～7 周齡，體質(zhì)量（25±3）g，無特定病原體級(jí)，雄性ApoE-/-小鼠15 只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，小鼠質(zhì)量合格編號(hào)11401500043662，在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)。以下動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7 源自Abelson 鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤，購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)（北京總部）。

實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)：ApoE-/-小鼠飼養(yǎng)：按照隨機(jī)數(shù)表法將小鼠平均分為3 組：（1）常氧組給予高脂飼料（含21%脂肪、0.15%膽固醇）喂養(yǎng)12 周。（2）低氧組給予高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，于實(shí)驗(yàn)第4 周進(jìn)入低氧動(dòng)物箱，箱內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)夂蛪嚎s空氣，主控板控制氮?dú)夂蛪嚎s空氣的轉(zhuǎn)換，使艙內(nèi)氧濃度在5%～21%之間循環(huán)，每個(gè)循環(huán)180 s[8]。（3）低氧+米拉貝隆組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)的同時(shí)，于實(shí)驗(yàn)第4 周進(jìn)入低氧動(dòng)物箱，同時(shí)每日以10 mg/kg 的米拉貝隆灌胃。常氧組和低氧組小鼠于實(shí)驗(yàn)第4 周每日接受相同體積的米拉貝隆溶劑（即含10%二甲基亞砜的生理鹽水）灌胃，低氧組和低氧+米拉貝隆組小鼠每天在低氧動(dòng)物箱內(nèi)8 h，箱內(nèi)溫度、濕度與室內(nèi)相同。

RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)：RAW264.7 細(xì)胞置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37℃、5%二氧化碳條件下，以含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為常氧組、低氧組和低氧+米拉貝隆組，將細(xì)胞接種于6 孔板中，每組6 孔，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/孔。低氧+米拉貝隆組細(xì)胞給予0.5 μmol/L 米拉貝隆處理。低氧組和低氧+米拉貝隆組細(xì)胞置于37℃低氧培養(yǎng)箱內(nèi)，二氧化碳濃度5%，氧濃度在5%～21%之間循環(huán)，每個(gè)循環(huán)1 h[9]。48 h 后收取細(xì)胞。

小鼠標(biāo)本采集與處理：小鼠夜間禁食水12 h 后以5%的戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉，自心尖抽取血液標(biāo)本，置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。留取小鼠心臟基底部，4%多聚甲醛固定，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆肹10]；留取頸動(dòng)脈，用包埋劑包埋后于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

主動(dòng)脈根部HE 染色：在主動(dòng)脈3 個(gè)瓣葉水平以5 μm 厚度對(duì)組織蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，對(duì)主動(dòng)脈根部組織進(jìn)行HE 染色，顯微鏡拍照后利用NISELEMENT 軟件測(cè)定粥樣硬化斑塊表面積與動(dòng)脈壁表面積，計(jì)算斑塊面積占動(dòng)脈壁表面積的百分比[7]。

免疫組織化學(xué)染色：小鼠主動(dòng)脈根部石蠟切片脫蠟后于檸檬酸鈉修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)，以3%H2O2水溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，用5%牛血清白蛋白封閉后分別滴加CD68、p22phox 抗體，4℃孵育過夜，次日滴加二抗室溫孵育1 h 后，滴加DAB 顯色液進(jìn)行顯色。顯微鏡拍照，計(jì)算棕褐色陽性面積占組織面積的百分比[10]。

超氧化物陰離子熒光探針檢測(cè)活性氧：對(duì)頸動(dòng)脈組織進(jìn)行冰凍切片，厚度約7 μm，將熒光探針（10 mmol/L）滴于組織上，37℃孵育30 min，50%甘油封片后立即在顯微鏡下觀察、拍照，活性氧在激發(fā)光下呈紅色熒光。計(jì)算紅色熒光面積占血管組織總面積的百分比。

ABTS 法檢測(cè)總抗氧化能力：根據(jù)試劑盒說明，倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液用于標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定；于96 孔板中依次加入檢測(cè)工作液、樣品或標(biāo)準(zhǔn)品后，混勻，室溫孵育5 min 后利用酶標(biāo)儀測(cè)定734 nm 波長處吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品總抗氧化能力，細(xì)胞樣品根據(jù)蛋白濃度計(jì)算每毫克蛋白中總抗氧化能力。

RNA 提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：取ApoE-/-小鼠整條主動(dòng)脈，分離周圍脂肪組織及筋膜，利用TRIzol 法提取總RNA，以BGISEQ500 平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）。每個(gè)基因的表達(dá)水平通過RSEM 標(biāo)準(zhǔn)化為FPKM。利用差異分析軟件DEseq2 篩選三組間氧化應(yīng)激相關(guān)的差異表達(dá)基因[11]。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG)富集分析，以P＜0.05 為篩選條件。

蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)：收取細(xì)胞進(jìn)行蛋白定量后，進(jìn)行蛋白變性[12]，將蛋白樣本等量上樣至十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳后，以200 mA電流冰上轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，10%脫脂奶粉封閉1 h 后，于4℃分別孵育β3 AR、p22phox 和GAPDH 一抗過夜，次日以熒光標(biāo)記二抗室溫避光孵育1 h，用Odyssey 雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描PVDF 膜檢測(cè)灰度值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用LSD 法進(jìn)行多重比較。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊情況及β3 AR、p22phox 表達(dá)

低氧組較常氧組和低氧+米拉貝隆組小鼠：主動(dòng)脈根部HE 染色動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積占動(dòng)脈壁表面積的百分比更高[（27.88±5.83）%vs. （19.84±5.13）%； （27.88±5.83）% vs.（16.33±3.60）%，P均＜0.05，n=5]（圖1A）；斑塊內(nèi)CD68 陽性面積百分比更高[（10.63±3.18）% vs.（5.31±2.77）%；（10.63±3.18）% vs. （5.20±1.40）%，P均＜0.05，n=5）（圖1B）；斑塊內(nèi)β3 AR 陽性面積百分比更高[（5.06±0.44）% vs. （2.99±1.56）%；（5.06±0.44）% vs. （2.61±0.95）%，P均＜0.05，n=5]（圖1C）；p22phox 陽性面積百分比更高[（4.82±0.85）%vs. （1.29±0.27）%；（4.82±0.85）% vs. （0.94±0.63）%，P均＜0.05，n=5]（圖1D）。各組小鼠斑塊內(nèi)p22phox陽性面積百分比與β3 AR 的陽性面積百分比具有正性相關(guān)（r=0.90，P＜0.05，圖1E）。

2.2 各組小鼠氧化應(yīng)激水平及血清總抗氧化能力

低氧組較常氧組和低氧+ 米拉貝隆組小鼠，頸動(dòng)脈組織活性氧陽性面積百分比更高[（29.25±4.87）% vs. （12.58±1.73）%，（29.25±4.87）% vs. （6.00±2.08）%；P均＜0.05]，見圖2A。低氧組較常氧組和低氧+米拉貝隆組小鼠，血清總抗氧化力水平降低[（2.09±0.11） mmol/L vs. （2.74±0.33） mmol/L； （2.09±0.11） mmol/L vs.（2.73±0.15） mmol/L，P均＜0.05]，見圖2B。

進(jìn)一步通過RNA-seq 對(duì)3 組小鼠的基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與常氧組相比，低氧組小鼠存在796 種差異表達(dá)基因，其中437 種基因表達(dá)上調(diào)，359 種基因表達(dá)下調(diào)；與低氧組相比，低氧+米拉貝隆組小鼠存在474 種差異表達(dá)基因，其中130 種基因表達(dá)上調(diào)，344 種基因表達(dá)下調(diào)。上述兩兩比較后的差異表達(dá)基因有183 種重復(fù)，對(duì)這183 種差異表達(dá)基因進(jìn)行分子功能（圖2C）和生物過程（圖2D）的GO 富集分析，篩選富集基因數(shù)前10 名的GO 號(hào)，發(fā)現(xiàn)3 組小鼠差異表達(dá)基因在氧化還原過程中具有明顯富集。

圖2 小鼠動(dòng)脈組織氧化應(yīng)激水平及血清總抗氧化能力（n=5）

故進(jìn)一步在183 個(gè)差異基因中篩選與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因，共發(fā)現(xiàn)36 個(gè)基因，其在各組小鼠中的表達(dá)水平如圖3A 所示，在這些基因中，Hephl1、Marc1、Moxd1、Alox15、Hpdl、Th、Dbh、Sqle、Adh7、Nsdhl、Fasn、Gpd1、Sc5d、Sdr39u1、Hsd11b1、Dio2、Gmpr、Pdha1、Pdhb、Uqcrfs1、Etfdh、Sdhb、Idh3a、Hsd17b12、Gpd2、Dlat、Me1等基因主要起促進(jìn)氧化的作用，與常氧組相比，其在低氧組的表達(dá)水平上調(diào)，給予米拉貝隆后，其表達(dá)水平降低，其中Fasn曾被報(bào)道可隨p22phox 水平降低而降低[11]。Cyp2b10主要起抑制氧化應(yīng)激的作用，與常氧組相比，其在低氧組的表達(dá)水平降低，給予米拉貝隆后，其表達(dá)水平上調(diào)。對(duì)這36 個(gè)差異基因進(jìn)行KEGG 信號(hào)通路富集分析，共發(fā)現(xiàn)17 種有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)通路（圖3B）。

圖3 各組小鼠主動(dòng)脈組織36 個(gè)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)差異（3A）與KEGG 信號(hào)通路富集分析（3B）

2.3 RAW264.7 巨噬細(xì)胞β3 AR 及氧化應(yīng)激水平

Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，常氧組、低氧組和低氧+米拉貝隆組β3 AR 灰度值分別為0.40±0.03、0.51±0.04 和0.90±0.01，低氧組β3 AR 表達(dá)水平高于常氧組，但低于低氧+米拉貝隆，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見圖4A、4B。常氧組、低氧組和低氧+米拉貝隆組p22phox 灰度值分別為0.70±0.05、0.86±0.07 和0.72±0.07，低氧組p22phox 表達(dá)水平高于常氧組和低氧+米拉貝隆組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見圖4A、4C。ABTS 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低氧組總抗氧化力水平低于常氧組和低氧+米拉貝隆組細(xì) 胞[（116.39±88.33） μmol/mg vs.（287.11±65.43）μmol/mg；（116.39±88.33） μmol/mg vs.（470.86±197.05）μmol/mg，P均＜0.05]，見圖4D。

圖4 RAW264.7 巨噬細(xì)胞β3 AR 及氧化應(yīng)激水平（n=3）

3 討論

既往有研究發(fā)現(xiàn)β3 AR 活化可減緩常氧環(huán)境下動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[4-6]，本研究在CIH 環(huán)境下驗(yàn)證了β3 AR 活化對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用，特異性激動(dòng)β3 AR 可減緩CIH 誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生，其發(fā)生機(jī)制與抑制巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗氧化能力密切相關(guān)。

CIH 促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的過程可能涉及炎癥反應(yīng)、血管新生、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多條通路。既往研究在C57BL/6J 小鼠[13]和ApoE-/-小鼠[14]中均發(fā)現(xiàn)CIH 可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，本研究選用ApoE-/-小鼠，通過8 周CIH 處理，快速誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化模型，同樣觀察到CIH 對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的促進(jìn)作用。同時(shí)，通過檢測(cè)粥樣硬化斑塊內(nèi)細(xì)胞成分，發(fā)現(xiàn)CIH 可顯著增加斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量。巨噬細(xì)胞在斑塊進(jìn)展和斑塊破裂中均發(fā)揮重要作用[15]，已有研究報(bào)道，CIH 可降低巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)/膽固醇的功能，增加炎癥因子的分泌[16]。在斑塊進(jìn)展過程中，氧化修飾的低密度脂蛋白（oxLDL）同樣可降低巨噬細(xì)胞的吞噬功能，進(jìn)而促進(jìn)斑塊內(nèi)壞死細(xì)胞形成壞死核心[17]。oxLDL 影響巨噬細(xì)胞吞噬功能的機(jī)制之一是增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)、產(chǎn)生過量的活性氧[18]，NOX 是合成活性氧的關(guān)鍵酶，p22phox 是其重要的亞基[19]，本研究發(fā)現(xiàn)，在CIH 促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的過程中，小鼠頸動(dòng)脈組織活性氧升高，主動(dòng)脈根部p22phox 表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)小鼠血清總抗氧化力下降，提示在CIH 促進(jìn)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的過程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇在其中發(fā)揮重要作用，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有望減緩CIH 對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的促進(jìn)作用。

β3 AR 已被證實(shí)廣泛分布于棕色脂肪組織和血管等組織中[4]，在既往研究中，β3 AR 通過調(diào)節(jié)棕色脂肪組織而發(fā)揮的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用受到廣泛關(guān)注，其在其他部位的作用機(jī)制尚不明確；另外，既往研究均是在常氧環(huán)境下形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，CIH 環(huán)境下，β3 AR 在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中發(fā)揮何種作用尚未可知。CIH 環(huán)境下交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性顯著升高，有研究表明長期興奮的交感神經(jīng)系統(tǒng)會(huì)使β3 AR出現(xiàn)脫敏現(xiàn)象，即β3 AR活性下降[4]；本研究在在體實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)，低氧組β3 AR 表達(dá)水平較常氧組明顯上調(diào)，這可能是對(duì)脫敏現(xiàn)象的代償性調(diào)節(jié)。與Nagai 等[20]報(bào)道的在CIH環(huán)境下大鼠肺組織中巨噬細(xì)胞β3 AR 表達(dá)水平上升的結(jié)果一致。給予米拉貝隆刺激后，小鼠粥樣硬化斑塊內(nèi)β3 AR 表達(dá)水平顯著下降，而RAW264.7巨噬細(xì)胞中β3 AR 表達(dá)水平呈增高，這種不一致的現(xiàn)象可能與在體實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)中米拉貝隆的藥物濃度和刺激時(shí)間不同有關(guān)。在體實(shí)驗(yàn)中活化β3 AR后顯著減緩CIH 誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化，同時(shí)減少斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量。進(jìn)一步在巨噬細(xì)胞水平探討β3 AR 活化改善CIH 誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)米拉貝隆激活巨噬細(xì)胞的β3 AR 后，可顯著降低巨噬細(xì)胞p22phox 表達(dá)水平，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞的總抗氧化力。Hadi 等[5]在子宮肌層的巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)β3 AR 活化可抑制氧化酶2（NOX2）活性進(jìn)而減少活性氧的產(chǎn)生。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，進(jìn)一步明確：與常氧環(huán)境相比，CIH 可上調(diào)促進(jìn)氧化應(yīng)激的相關(guān)基因表達(dá)，活化β3 AR 后可使上述基因表達(dá)下調(diào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)β3 AR 活性與NOX 的亞基p22phox 的表達(dá)之間具有重要聯(lián)系，提示β3 AR 活化后抑制巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)總抗氧化力可能是其延緩CIH 誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的機(jī)制，但β3 AR 與上述氧化應(yīng)激相關(guān)基因之間的具體調(diào)節(jié)機(jī)制還有待于進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究在ApoE-/-小鼠中發(fā)現(xiàn)β3 AR活化可減緩CIH 誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化，其具體機(jī)制可能是降低巨噬細(xì)胞p22phox 表達(dá)、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。β3 AR 有望成為OSA 患者防治動(dòng)脈粥樣硬化疾病的有效靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突