李小麗，王 輝，張慶軍

應(yīng)急總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 100028

肺炎在全球發(fā)病率非常高，患者康復(fù)時間長且病死率高[1]。肺炎鏈球菌是一種機會性病原體，定植在人類上呼吸道的黏膜表面，通過局部擴散、吸入或播種等方式到達血液中，引起肺炎等疾病[2-4]。因此，了解肺炎鏈球菌感染過程涉及的分子途徑對于預(yù)防和治療肺炎至關(guān)重要。越來越多的研究顯示，長鏈非編碼RNA(LncRNA)是多種人類疾病診斷的潛在生物標志物[5-6]。LncRNA?；撬嵘险{(diào)基因1(TUG1)通過抑制微小RNA(miRNA)-127，保護脂多糖(LPS)誘發(fā)的MRC-5細胞損傷，在肺炎中顯示出較好的治療效果[6]。TUG1通過海綿miR-590-5p/FGF1促進哮喘患者氣道平滑肌細胞的增殖和遷移，并減少了細胞凋亡[7]。miR-222-3p在肺炎支原體肺炎患兒中高表達，可能是診斷肺炎支原體肺炎和判斷患者預(yù)后的生物標志物[8]。但TUG1對肺炎鏈球菌感染的人肺泡上皮細胞(HPAEpiC細胞)凋亡的影響，以及miR-222-3p是否介導(dǎo)其作用過程，目前尚未明確。因此，本研究以肺炎鏈球菌感染HPAEpiC細胞構(gòu)建肺損傷模型，并評估TUG1在該模型中的影響，除此之外，還探討了TUG1和miR-222-3p之間的調(diào)控關(guān)系，同時評估m(xù)iR-222-3p在TUG1影響細胞損傷中的作用，揭示TUG1的潛在作用機制，為治療肺炎提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 72株HPAEpiC細胞(美國ScienCell)，肺炎鏈球菌-3型(美國菌種保藏中心)，Lipofectamine 2000、TUG1小干擾RNA(Si-TUG1)、陰性對照siRNA(Si-NC，美國Invitrogen)，miR-222-3p、miR-NC、anti-miR-222-3p、anti-miR-NC(上海吉瑪)，PrimeScript RT試劑盒、SYBR Green Premix Ex Taq(大連Takara)，miRcute miRNA qPCR檢測試劑盒(北京Tiangen)，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC/PI試劑盒(上海Beyotime)，牛血清蛋白、總蛋白提取試劑盒(上海Solarbio)，硝酸纖維素膜(美國Millipore)，PGL3報告基因載體、雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(美國Promega)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與肺炎鏈球菌感染 HPAEpiC細胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)/F12中于37 ℃、5% CO2的濕潤環(huán)境下培養(yǎng)。肺炎鏈球菌在含脫纖維羊血(5%)的血平板中培養(yǎng)。感染時，采用1×108CFU/mL肺炎鏈球菌(提前12 h在含0.5%酵母的托休二氏溶液中培養(yǎng))感染HPAEpiC細胞48 h[9]。

1.2.2細胞分組與處理 HPAEpiC細胞分為對照(NC)組、肺炎鏈球菌組、肺炎鏈球菌+Si-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1組、肺炎鏈球菌+miR-NC組、肺炎鏈球菌+miR-222-3p組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組。NC組HPAEpiC細胞未做任何處理；肺炎鏈球菌組HPAEpiC細胞以1×108CFU/mL肺炎鏈球菌感染；肺炎鏈球菌+Si-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1組、肺炎鏈球菌+miR-NC組、肺炎鏈球菌+miR-222-3p組的HPAEpiC細胞分別轉(zhuǎn)染Si-NC、Si-TUG1、miR-NC、miR-222-3p，肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組、肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組共轉(zhuǎn)染Si-TUG1+anti-miR-NC、Si-TUG1+anti-miR-222-3p，轉(zhuǎn)染后24 h,以1×108CFU/mL肺炎鏈球菌感染。HPAEpiC細胞轉(zhuǎn)染時，按照制造商的操作規(guī)程，將HPAEpiC細胞在六孔板上預(yù)孵育至40%～60%匯合，然后與寡核苷酸或siRNA及Lipofectamine 2000一起孵育進行轉(zhuǎn)染。

1.2.3實時定量PCR檢測TUG1、miR-222-3p表達 根據(jù)制造商的規(guī)程，通過TRIzol試劑從HPAEpiC細胞中提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒進行cDNA合成。使用SYBR Green Premix Ex Taq和miRcute miRNA qPCR檢測試劑盒在ABI 7500系統(tǒng)上進行實時定量PCR檢測。GAPDH和U6充當內(nèi)源性對照。引物序列為TUG1正向5′-GGACACAATTCGCCACGACTT-3′，反向5′-GCGCAGTCCCAGATTCCA-3′；GAPDH正向5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反向5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。miR-222-3p正向5′-AGCTACATCTGGCTACTGG-3′，反向5′-GTATCCAGTGCAGGGTCC-3′；U6正向5′-CTC GCTTCGGCAGCACA-3′，反向5′-TGGTGTCGT GGAGTCG-3′。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 借助Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測HPAEpiC細胞凋亡(1×105個細胞/孔)。將500 μL結(jié)合緩沖液與HPAEpiC細胞懸液混合。然后，添加5 μL Annexin V-FITC并保持5 min，隨后添加5 μL PI并在黑暗中于室溫下反應(yīng)10 min。使用Beckman Coulter流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.2.5Western blotting檢測蛋白表達 使用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并使用二辛可寧酸方法對HPAEpiC細胞蛋白進行定量。制備分離凝膠(10%)和濃縮凝膠(5%)，每個孔中加入20 μL蛋白樣品，進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束，在3 mA下2 h完成硝酸纖維素膜的轉(zhuǎn)移。室溫下用5%牛血清清蛋白封閉膜2 h。將一抗Bcl2相關(guān)X蛋白(Bax蛋白，1∶3 000稀釋)和B細胞淋巴瘤/白血病2(Bcl2蛋白，1∶3 000稀釋)與膜在4 ℃條件下孵育過夜，然后，將其與HRP標記二抗(1∶5 000稀釋)在室溫下混合2 h，采用增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光保持30 min后，再采用Image-Pro Plus軟件進行蛋白水平分析。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗 含有miR-222-3p結(jié)合位點的野生型(WT)-TUG1/突變型(MUT)-TUG1序列被擴增并克隆到PGL3報告基因載體中。將HPAEpiC細胞接種到六孔板中后培養(yǎng)過夜，并與WT-TUG1/MUT-TUG1報告基因質(zhì)粒和miR-222-3p/miR-NC共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，螢火蟲和海腎熒光素酶活性使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測量。針對海腎熒光素酶基因的活性對數(shù)據(jù)進行標準化。

2 結(jié) 果

2.1肺炎鏈球菌感染對HPAEpiC細胞中miR-222-3p和TUG1表達的影響 肺炎鏈球菌感染前后，肺炎鏈球菌組HPAEpiC細胞中TUG1表達量為(0.43±0.03)，約為NC組(1.03±0.02)的0.42倍，肺炎鏈球菌組miR-222-3p表達量為(2.30±0.09)，約為NC組(1.01±0.03)的2.28倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.790，P<0.001；t=13.860，P<0.001)。

2.2轉(zhuǎn)染TUG1對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞凋亡的影響 肺炎鏈球菌組和肺炎鏈球菌+Si-NC組HPAEpiC細胞的TUG1表達量均低于NC組，凋亡率、Bax蛋白表達量均高于NC組，Bcl2蛋白表達量低于NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肺炎鏈球菌+Si-TUG1組HPAEpiC細胞的TUG1表達量低于肺炎鏈球菌+Si-NC組，凋亡率、Bax蛋白表達量均高于肺炎鏈球菌+Si-NC組，Bcl2蛋白表達量低于肺炎鏈球菌+Si-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

表1 轉(zhuǎn)染TUG1對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞凋亡的影響

注：A為蛋白質(zhì)電泳圖；B、C、D、E均為流式凋亡圖。

2.3TUG1靶向調(diào)控miR-222-3p的表達 miR-222-3p與TUG1含有靶向結(jié)合的核苷酸序列，生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果見圖2。miR-222-3p與WT-TUG1共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性(0.46±0.03)是miR-NC與WT-TUG1共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性(1.00±0.01)的0.46倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.960，P<0.001)；而miR-222-3p、MUT-TUG1共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性(1.00±0.02)與miR-NC、MUT-TUG1共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性(1.02±0.03)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.429，P=0.674)。

圖2 miR-222-3p含有與TUG1靶向結(jié)合的位點

2.4過表達miR-222-3p對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞凋亡的影響 肺炎鏈球菌+miR-222-3p組HPAEpiC細胞的miR-222-3p表達量、凋亡率、Bax蛋白表達量比肺炎鏈球菌+miR-NC組高，且Bcl2蛋白表達量比肺炎鏈球菌+miR-NC組低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表2。

表2 肺炎鏈球菌+miR-NC組和肺炎鏈球菌+miR-222-3p組的miR-222-3p、凋亡率、凋亡蛋白比較

2.5干擾miR-222-3p表達部分逆轉(zhuǎn)TUG1對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞凋亡的影響 與肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組比較，肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組HPAEpiC細胞中miR-222-3p表達量、凋亡率和Bax蛋白表達量降低，Bcl2蛋白表達量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表3。

注：A為蛋白質(zhì)電泳圖；B、C均為流式凋亡圖。

注：A為蛋白質(zhì)電泳圖；B、C均為流式凋亡圖。

表3 肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-NC組與肺炎鏈球菌+Si-TUG1+anti-miR-222-3p組的miR-222-3p、凋亡率、凋亡蛋白比較

3 討 論

本研究探討了TUG1對肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌觸發(fā)了HPAEpiC細胞凋亡。此外，干擾TUG1加速了肺炎鏈球菌誘發(fā)的HPAEpiC細胞凋亡。另外，干擾miR-222-3p表達部分逆轉(zhuǎn)干擾TUG1對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞凋亡的影響。

TUG1已被廣泛應(yīng)用于各種癌癥研究中，包括腎細胞癌[10]、前列腺癌[11]、胃癌[12]、結(jié)腸癌[13]。越來越多的證據(jù)證實TUG1在多種癌癥病理、生理過程中均發(fā)揮了特定的生物學(xué)功能。例如，一項研究表明，過表達的TUG1通過減弱細胞凋亡和炎性反應(yīng)來保護小鼠免受寒冷誘導(dǎo)的肝損傷[14]。此外，研究表明，在LPS引起的MRC-5細胞損傷中，TUG1減輕了細胞凋亡，下調(diào)Bax蛋白表達而上調(diào)Bcl2蛋白表達，機制與調(diào)控miR-127有關(guān)[6]。在哮喘大鼠模型中，沉默TUG1可增加哮喘中氣道平滑肌細胞的凋亡，而TUG1過表達抑制細胞凋亡[7]。然而，目前研究尚未揭示TUG1是否能保護HPAEpiC細胞免受肺炎鏈球菌觸發(fā)的細胞損傷。本研究觀察到，TUG1在肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞中低表達，干擾TUG1能明顯促進肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞凋亡。同時，干擾TUG1可誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax蛋白的表達并抑制抗凋亡蛋白Bcl2蛋白的表達。這些數(shù)據(jù)均提示，TUG1對HPAEpiC細胞中肺炎鏈球菌觸發(fā)的細胞凋亡具有抑制作用。

miRNA通過控制參與組織發(fā)育和再生的多個信號和轉(zhuǎn)錄因子的表達，已成為病理過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[15]。根據(jù)報道，在胃癌[16]、腎細胞癌[17]、非小細胞肺癌[18]和宮頸癌[19]患者中，miR-222-3p表達增加。然而，在卵巢癌[20]及嚴重心肌纖維化患者中觀察到較低的miR-222-3p水平[21]?？梢娫诓煌膊』颊咧?，miR-222-3p表達不同。研究顯示，與正常椎間盤組織比較，椎間盤退變組織中的miR-222-3p明顯增加；miR-222-3p過表達明顯增加了髓核細胞的凋亡并減少其增殖，miR-222-3p的下調(diào)可抑制髓核細胞凋亡并誘導(dǎo)增殖；miR-222-3p會加速椎間盤退變的發(fā)展[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌感染使HPAEpiC細胞miR-222-3p表達上調(diào)，與以往研究報道一致[8]。更重要的是，miR-222-3p過表達可以增加肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞凋亡，同時上調(diào)促凋亡蛋白Bax蛋白，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl2蛋白。上述數(shù)據(jù)與以往的研究部分相似[22]，提示miR-222-3p可能加重肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞損傷。

本研究的生物信息學(xué)預(yù)測表明，TUG1序列中存在假定的miR-222-3p結(jié)合位點。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果揭示了miR-222-3p為TUG1的靶標，TUG1可以靶向調(diào)控miR-222-3p的表達。但miR-222-3p是否影響TUG1對肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞損傷的保護活性仍然未知。本研究進一步觀察到，干擾miR-222-3p表達后，干擾TUG1促進肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的HPAEpiC細胞凋亡的作用被部分逆轉(zhuǎn)。表明TUG1通過靶向調(diào)控肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞中miR-222-3p的表達，減輕細胞凋亡。

綜上所述，TUG1通過靶向miR-222-3p對肺炎鏈球菌感染的HPAEpiC細胞起保護活性。這些發(fā)現(xiàn)可能為肺炎鏈球菌感染的肺炎提供一種新的治療方法。