陳明娟，劉長(zhǎng)仲，保吉婷，唐 蓉，劉 韜，孫元星*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

異色瓢蟲Harmoniaaxyridis是一種重要的捕食性天敵，在農(nóng)林害蟲生物防治中具有廣泛應(yīng)用。該瓢蟲具有豐富的鞘翅色斑變化，我國(guó)目前已發(fā)現(xiàn)200余種鞘翅色斑型(Koch, 2003; 李佳琳等, 2011; 趙天璇和袁明龍, 2017)。研究表明，瓢蟲鞘翅色斑變化在環(huán)境適應(yīng)(如溫度)中發(fā)揮著重要作用，是研究色素沉積與環(huán)境適應(yīng)的重要模式昆蟲(Michieetal.,2011)。異色瓢蟲鞘翅上的色斑通常由黑色(黑底型，Melanic)或者淡黃色(又稱非黑底型，Non-melanic)作為底色，鑲嵌以黑色或者紅色圓點(diǎn)狀色塊(Dobzhansky, 1933)，其中黑色部分主要由黑色素沉積形成(Bezzeridesetal., 2007)。

在昆蟲整個(gè)黑色素合成代謝過(guò)程中，多巴胺(dopamine, DA)處于黑色素代謝通路的中心結(jié)點(diǎn)，其含量的累積會(huì)造成黑色素合成通路的增強(qiáng)，進(jìn)而加深黑化程度(Arakaneetal., 2009; Shamimetal., 2014)。具體代謝過(guò)程為：酪氨酸在酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)的作用下轉(zhuǎn)化為多巴(dopa)，然后在多巴脫羧酶(DDC)的作用下轉(zhuǎn)化為DA，一方面積累形成黑色素進(jìn)而產(chǎn)生黑化體色；另一方面在N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(arylalkylamine N-acetyl transferase, aaNAT)的作用下生成N-β丙酰多巴胺(N-β-alanyl dopamine, NBAD)等黃色化合物和N-乙酰多巴胺(N-acetyl dopamine, NADA)等無(wú)色化合物(朱福興和王沫, 2007)。此外，多巴胺還參與調(diào)控昆蟲的取食學(xué)習(xí)、交配發(fā)育、睡眠嗅覺(jué)等多種生理反應(yīng)和行為過(guò)程(吳順?lè)驳? 2013; Lagiszetal., 2016; Kadow, 2019)，其濃度在生物體內(nèi)是被嚴(yán)格調(diào)控的(徐剛和葉恭銀, 2020)。有研究表明地中海實(shí)蠅Ceratitiscapitata突變品系表皮中因缺少NBAD而呈現(xiàn)為無(wú)色或透明，并造成骨化不正常(Pabloetal., 1996)；張?jiān)ǖ?2009)發(fā)現(xiàn)甜菜夜蛾Spodopteraexigua黑化品系在生長(zhǎng)發(fā)育、存活率、產(chǎn)卵量等方面均優(yōu)于正常品系，種群增長(zhǎng)指數(shù)也明顯提高，并發(fā)現(xiàn)外源補(bǔ)充DA可以使甜菜夜蛾正常品系體色變黑。上述研究表明黑色素合成途徑某些關(guān)鍵基因突變?cè)斐傻奈镔|(zhì)含量變化對(duì)昆蟲體色及生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響。

目前有關(guān)異色瓢蟲黑色素代謝途徑已有較多研究(Chenetal., 2019; Zhangetal., 2020)，表明DA為主要的合成前體，但針對(duì)DA對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)一異色瓢蟲淺色突變體gr，體色較野生型淺，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其幼蟲表皮的多巴及DA含量與野生型相比具有顯著差異，表現(xiàn)為黑色素合成通路異常；遺傳學(xué)試驗(yàn)證明gr為單基因隱性突變體。此外，gr在生長(zhǎng)發(fā)育方面也與野生型具有明顯差異(羽化率、新羽化成蟲體重及生殖力均顯著低于野生型)。結(jié)果表明，該黑色素合成途徑關(guān)鍵基因與適合度緊密相關(guān)，具有明顯的多效性(Sunetal., 2018a)。本研究以添加不同濃度DA的人工飼料飼喂異色瓢蟲突變體gr，測(cè)定幼蟲各齡期的存活率、發(fā)育時(shí)間、新羽化成蟲體重及鞘翅顏色參數(shù)，以明確DA對(duì)該突變體幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育是否會(huì)造成影響，同時(shí)明確幼蟲期補(bǔ)充DA能否有助于恢復(fù)成蟲鞘翅黑色斑點(diǎn)的顏色。研究結(jié)果將為進(jìn)一步探究異色瓢蟲鞘翅黑化的形成機(jī)理及與生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

異色瓢蟲突變體gr在實(shí)驗(yàn)室(溫度25℃±1℃，光周期L ∶D=16 ∶8)條件下長(zhǎng)期使用桃蚜Myzuspersicae進(jìn)行飼養(yǎng)。桃蚜為相同條件下長(zhǎng)期飼養(yǎng)于辣椒苗上的種群。

1.2 人工飼料配制

供試人工飼料主要成分為豬肝及蜂蜜，參照Sun等(2018b)的配方配制并進(jìn)行改進(jìn)，具體成分及配比見(jiàn)表1。配制飼料時(shí)，首先將豬肝粉、酵母粉與食用油于250 mL燒杯中充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓髮⑵渌煞秩芙庥?0 mL蒸餾水中并與前者混合，充分?jǐn)嚢栊纬苫A(chǔ)人工飼料。用萬(wàn)分之一天平準(zhǔn)確稱取DA標(biāo)準(zhǔn)品溶解于蒸餾水中，并依次稀釋添加入基礎(chǔ)人工飼料中(5 mL)，形成3個(gè)不同DA濃度的飼料(10 mg/g，1 mg/g與0.1 mg/g，依次簡(jiǎn)稱D-H，D-M與D-L)，以未添加DA的飼料作為對(duì)照(CK)。將配制好的人工飼料分裝于1.5 mL的離心管內(nèi)，做好標(biāo)記后保存于-20℃冰箱內(nèi)備用。

表1 異色瓢蟲人工飼料各組分含量

1.3 異色瓢蟲幼蟲飼養(yǎng)

分別將兩對(duì)異色瓢蟲突變體成蟲飼喂在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每天提供充足的桃蚜并收集所產(chǎn)卵，將卵孵育在直徑為3 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)(提供一浸透水的棉球保濕)。每天觀察卵的孵化情況，所得1齡幼蟲用于后續(xù)試驗(yàn)。試驗(yàn)在人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行(溫度25℃±1℃，光周期L ∶D=16 ∶8，相對(duì)濕度60%±10%)。

將孵化后12～24 h的1齡幼蟲單頭飼養(yǎng)在直徑為3.5 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每天提供充足的人工飼料和水分，觀察并統(tǒng)計(jì)幼蟲的齡期及存活情況，每2 d更換一次飼料。前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，直接將幼蟲飼養(yǎng)在人工飼料上，低齡(1～2齡)幼蟲的死亡率極高(大于90%)。因此，本試驗(yàn)首先將1齡幼蟲用桃蚜分別飼喂至2齡或4齡后，再使用人工飼料進(jìn)行飼喂(以獲得大量成蟲)，并統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。待幼蟲化蛹后，每天觀察成蟲的羽化情況。統(tǒng)計(jì)各齡幼蟲的存活率及發(fā)育歷期、羽化率及新羽化成蟲體重(羽化后24～36 h，精確到0.1 mg)，并將新羽化成蟲保存在-80℃冰箱內(nèi)，用于測(cè)定鞘翅的顏色參數(shù)。

1.4 成蟲鞘翅的顏色分析

從冰箱取出冷藏的異色瓢蟲突變體成蟲樣品，用尖頭鑷子取下左鞘翅，在體視顯微鏡下使用相同光照條件進(jìn)行拍照。將照片導(dǎo)入Adobe Photoshop CS6軟件中，統(tǒng)計(jì)鞘翅黑色斑點(diǎn)的HSB平均值[Hue(色調(diào))，Saturation(飽和度)，Brightness(明亮度)]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。其中，存活率采用4×2聯(lián)表進(jìn)行分析(Sighinolfietal., 2013)，其他參數(shù)采用單因素方差分析進(jìn)行比較，采用Tukey HSD法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。使用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源補(bǔ)充多巴胺對(duì)幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.1.1桃蚜飼喂至2齡后取食人工飼料

對(duì)照組幼蟲無(wú)法成功發(fā)育至3齡(部分個(gè)體發(fā)育至蛻皮但未成功)，取食添加DA的人工飼料后，各處理的存活率隨齡期增加均呈下降趨勢(shì)。其中，在2～3齡及3～4齡的發(fā)育過(guò)程中，3個(gè)飼料處理間無(wú)顯著差異(χ2=0.46～2.83，P=0.09～0.50)，僅有30%的4齡幼蟲可發(fā)育至蛹期(圖1)。

圖1 異色瓢蟲突變體gr取食不同飼料后的存活率Fig.1 Survival rate of Harmonia axyridis mutant gr feeding on different diets注：D-H、D-M與D-L分別表示多巴胺添加濃度為10 mg/g、1 mg/g與0.1 mg/g的人工飼料，下同。Note: D-H, D-M, and D-L respectively represented artificial diet with a dopamine concentration of 10 mg/g, 1 mg/g and 0.1 mg/g, the same below.

在2～3齡發(fā)育過(guò)程中，D-L處理幼蟲的發(fā)育歷期顯著短于D-H與CK處理(F3, 86=4.971，P=0.003)；在3～4齡發(fā)育過(guò)程中，D-L處理幼蟲的發(fā)育歷期顯著短于D-H與D-M處理(F2，64=8.310，P=0.001)；在4齡～蛹的發(fā)育過(guò)程中，各飼料處理的發(fā)育歷期均無(wú)顯著差異(F2,27=2.396，P=0.110)，但D-L處理短于D-H和D-M處理(圖2)。

圖2 異色瓢蟲突變體gr取食不同飼料后的發(fā)育歷期Fig.2 Development time of Harmonia axyridis mutant gr feeding on different diets注：不同小寫字母表示某一齡期幼蟲的發(fā)育歷期在不同飼料處理之間具有顯著差異(P<0.05)。Note: Different lowercase letters represented a significant difference of the larval developmental time of a given instar among different treatments (P<0.05).

2.1.2桃蚜飼喂至4齡后取食人工飼料

在4齡發(fā)育過(guò)程中，取食D-M的幼蟲全部發(fā)育至蛹期，顯著高于D-H處理(72%)(χ2=6.02，P=0.014)，但均與D-L及CK處理差異不顯著(χ2=1.51～3.47，P=0.06～0.22)。在蛹期發(fā)育過(guò)程中，取食D-M與D-L的成蟲羽化率分別為83.3%和82.6%，稍高于D-H與CK處理(66.7%與71.4%)，但均差異不顯著(χ2=0.004～1.40，P=0.24～0.95)(圖3)。

圖3 異色瓢蟲突變體gr取食不同飼料后的存活率Fig.3 Survival rate of Harmonia axyridis mutant gr feeding on different diets注：不同小寫字母表示某一齡期幼蟲的存活率在不同飼料處理之間具有顯著差異(P<0.05)。Note: Different lowercase letters represented a significant difference of the larval survival rate of a given instar among different treatments (P<0.05).

4齡及蛹期的發(fā)育時(shí)間在各處理間無(wú)顯著差異(4齡：F3, 64=1.781，P=0.160；蛹：F3, 59=1.297，P=0.284)，其中，飼喂D-M的4齡幼蟲的平均發(fā)育時(shí)間為7.2 d，稍長(zhǎng)于其它3種飼料處理(D-H：6.1 d；D-L：5.8 d；CK：6.4 d)(圖4)。

圖4 異色瓢蟲突變體gr取食不同飼料后的發(fā)育歷期Fig.4 Development time of Harmonia axyridis mutant gr feeding on different diets注：相同小寫字母表示某一齡期幼蟲的發(fā)育歷期在不同飼料處理之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。Note: Same lowercase letters represented larval developmental time of a given instar among different treatments had no significant differences (P>0.05).

取食不同飼料后，新羽化雌雄成蟲體重在各處理間均無(wú)顯著差異(雌：F3, 20=0.405，P=0.751；雄：F3, 20=0.153，P=0.927)，但D-M處理中雌成蟲的平均體重(17.5 mg)和雄成蟲的平均體重(10.8 mg)均稍高于其它3種飼料處理(圖5)。

圖5 不同飼料飼喂下異色瓢蟲突變體gr成蟲的體重Fig.5 Body weight of Harmonia axyridis mutant gr feeding on different diets注：相同小寫字母表示雌雄成蟲體重在不同飼料處理間無(wú)顯著差異(P>0.05)。Note: Same lowercase letters represented male and female adult body weights among different treatments has no significant differences (P>0.05).

2.2 外源補(bǔ)充多巴胺對(duì)鞘翅顏色參數(shù)的影響

鞘翅黑色斑點(diǎn)的Saturation值(飽和度)在不同處理間無(wú)顯著差異(F3, 88=1.269，P=0.290)；D-M處理成蟲鞘翅黑色斑點(diǎn)的Hue值(色調(diào))顯著高于其它3個(gè)處理(F3, 88=4.231，P=0.008)；Brightness值(亮度)在各處理間均無(wú)顯著差異，但D-L處理的Brightness值均低于其它3個(gè)處理(F3, 88=2.652，P=0.054)(圖6)。

圖6 不同飼料飼養(yǎng)新羽化成蟲鞘翅黑色部分顏色參數(shù)(SHB值)Fig.6 The SHB values of the elytra dark spots of newly emerged adults feeding on different diets注：不同小寫字母表示某一顏色參數(shù)在不同飼料處理間具有顯著差異(P<0.05)，S、H和B分別表示飽和度、色調(diào)和亮度。Note: Different lowercase letters represented a certain parameter among different treatments had significant differences (P<0.05), S, H and B respectively represented saturation values, hue values and brightness values.

3 結(jié)論與討論

在本試驗(yàn)中，使用未添加DA的飼料(CK)飼喂gr2齡幼蟲，均不能成功發(fā)育至3齡。前期研究中用相同人工飼料飼喂野生型異色瓢蟲1齡幼蟲，超過(guò)80%的2齡幼蟲可發(fā)育至3齡(Sunetal., 2018b)。上述結(jié)果表明，gr幼蟲可能對(duì)人工飼料的營(yíng)養(yǎng)利用具有缺陷，但取食添加DA的人工飼料后，超過(guò)69%的gr2齡幼蟲可發(fā)育至3齡，且D-H處理最高(87%)。此外，利用添加DA的人工飼料飼喂gr4齡幼蟲，各處理所得成蟲的平均體重均高于CK處理；D-M與D-L處理的羽化率高于CK處理。上述差異可能是DA促進(jìn)gr幼蟲取食量的增加，進(jìn)而提升了營(yíng)養(yǎng)水平。在果蠅Drosophilamelanogaster中的研究表明，DA能夠調(diào)控饑餓個(gè)體或已飽個(gè)體的覓食行為(Tsaoetal., 2018)，在應(yīng)對(duì)饑餓狀態(tài)中起著重要作用。以上結(jié)果表明DA對(duì)異色瓢蟲的幼蟲存活率、成蟲體重和羽化率具有促進(jìn)作用。

此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DA對(duì)異色瓢蟲的影響程度還取決于添加濃度。使用人工飼料飼喂發(fā)育至2齡的幼蟲，D-L處理的3齡幼蟲發(fā)育時(shí)間顯著短于D-H與D-M。此外，使用D-M飼喂發(fā)育至4齡幼蟲時(shí)，化蛹率及羽化率均高于其它3種飼料處理，且新羽化雌雄成蟲的平均體重均高于其它3種飼料處理。使用人工飼料飼喂發(fā)育至4齡幼蟲時(shí)，D-L飼喂下的幼蟲發(fā)育時(shí)間均短于其它飼料處理。上述結(jié)果表明中低濃度的DA適于異色瓢蟲生長(zhǎng)發(fā)育，濃度過(guò)高可能會(huì)影響取食或營(yíng)養(yǎng)攝取及吸收。DA濃度影響gr生長(zhǎng)發(fā)育可能具有如下原因：首先，DA在昆蟲體內(nèi)是一種神經(jīng)遞質(zhì)，其濃度是被嚴(yán)格調(diào)控的，濃度過(guò)高過(guò)低都將擾亂相應(yīng)的信號(hào)通路，引起昆蟲死亡或發(fā)育不良(Fuchsetal., 2014; Conleyetal., 2015; Bai and Palli, 2016)。其次，研究表明DA還可直接或間接調(diào)節(jié)其他激素的水平。體內(nèi)DA濃度變化造成相關(guān)激素的濃度變化過(guò)大同樣會(huì)影響昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育(Gruntenkoetal., 2005; 路玉婷, 2016; 楊文豪, 2018)。本試驗(yàn)飼喂發(fā)育至4齡的幼蟲時(shí)，D-L飼喂下的幼蟲發(fā)育時(shí)間均短于其他飼料處理。上述結(jié)果表明中低濃度多巴胺適于異色瓢蟲生長(zhǎng)發(fā)育。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在異色瓢蟲突變體gr幼蟲人工飼料中添加DA可促進(jìn)成蟲鞘翅黑色素的沉積，但仍受添加濃度的影響。D-L處理成蟲鞘翅黑色斑點(diǎn)的Brightness值最小(顏色最黑)，低于其他3種飼料處理。作為一種表皮著色的中間底物，DA在眾多昆蟲體色表型上起決定性作用，是昆蟲體內(nèi)重要的黑色素合成前體物質(zhì)(Walteretal., 1996)。本研究表明，在異色瓢蟲突變體幼蟲食物中低濃度補(bǔ)充DA有利于恢復(fù)成蟲鞘翅黑色斑點(diǎn)的顏色。前期也有研究表明在食物中添加類胡蘿卜素(另外一類重要的體色色素)可恢復(fù)瓢蟲Coleomegillamaculata突變體鞘翅黃-紅色部分的顏色(Allen, 2016)。近年來(lái)，隨著組學(xué)(Sunetal., 2017; Pietrantonioetal., 2018)、實(shí)時(shí)成像等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展流行，大量研究表明DA合成通路的關(guān)鍵酶TH和DDC在參與調(diào)控昆蟲翅斑的形成(Luetal., 2019)、蛹的黑化(melanization)(張道偉等, 2019)和翅鱗的顏色形成(Matsuoka and Monteiro, 2018)等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，在以后的研究中，從兩個(gè)合成關(guān)鍵酶著手可進(jìn)一步揭示DA在異色瓢蟲中的作用及其調(diào)控機(jī)理。

綜上所述，外源補(bǔ)充黑色素合成底物DA可影響異色瓢蟲突變體gr幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，并可影響成蟲鞘翅黑色素的沉積。本研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步探究DA調(diào)控異色瓢蟲表型及與生物學(xué)特性的關(guān)聯(lián)機(jī)制具有重要意義。