季彩宏，張 楠，孟祥坤，王建軍*

(1. 揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，江蘇揚州 225009；2. 揚州市職業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，江蘇揚州 225009)

在哺乳動物中，Nrf2-Keap1通路主要調(diào)控細(xì)胞氧化還原平衡，參與細(xì)胞抗氧化和Ⅱ相解毒反應(yīng)(Kensleretal.，2007；Lobodaetal.，2016)。在該信號通路中，屬于Cnc-bZIP (cap ‘n’ collar/basic region leucine zipper)家族的Nrf2(核因子E2相關(guān)因子2，nuclear factor erythroid 2-related factor 2)，含有6個環(huán)氧氯丙烷(EHC，epichlorohydrin)相關(guān)蛋白同源結(jié)構(gòu)域(Neh，Nrf2-EHC homology)(Neh1-Neh6)，其中，氨基端Neh2功能結(jié)構(gòu)域是Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Keap1，Kelch-like ECH-associated protein 1)的結(jié)合區(qū)，后者在正常的生理條件下與Nrf2結(jié)合并將其隔離、錨定在胞漿，促進Nrf2的泛素化和蛋白酶體降解(Kobayashietal.，2006; Tianetal.，2018)。

害蟲抗藥性問題是害蟲綜合治理中最重要的問題之一，明確抗藥性機制是害蟲抗藥性治理的基礎(chǔ)。昆蟲中第一個鑒定的Nrf2同源基因是黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的CncC基因(Mohleretal.，1991；Sykiotis and Bohmann，2008)，可調(diào)控36種細(xì)胞色素P450、17種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6種尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)和55種ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(Misraetal.，2011)。進一步對DDT抗性品系91R和RDDTR的研究發(fā)現(xiàn)，敲減CncC或者過表達Keap1都可導(dǎo)致與DDT抗性相關(guān)的細(xì)胞色素P450基因Cyp6a8和Cyp6a2的表達下調(diào)(Misraetal.，2013)。對赤擬谷盜Triboliumcastaneum的研究發(fā)現(xiàn)，CncC可調(diào)控與溴氰菊酯抗性相關(guān)的8個CYP6BQ基因的表達(Kalsi and Palli, 2015)。對棉蚜Aphisgossypii的研究發(fā)現(xiàn)，CncC可調(diào)控與棉酚耐性相關(guān)的CYP6DA2基因表達(Pengetal.， 2016)。對朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus的研究發(fā)現(xiàn)，CncC可調(diào)控CYP389B1、CYP391A1和CYP392A28等與甲氰菊酯抗性相關(guān)基因的表達(Shietal.，2017)。最近對馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata的研究發(fā)現(xiàn)，CncC可調(diào)控CYP9Z25、CYP9Z29、CYP6BJa/b和CYP6BJ1v1等4個與馬鈴薯次生物質(zhì)解毒代謝和吡蟲啉抗性相關(guān)P450基因的表達(Kalsi and Palli, 2017)。這些研究表明，昆蟲Nrf2-Keap1信號通路可調(diào)控I相、II相和III解毒代謝基因的表達，在昆蟲抗藥性進化過程中具有重要作用。

二化螟Chilosuppressalis(Lepidoptera: Pyralidae)是水稻作物上一種主要的害蟲，目前，對二化螟的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥，但隨著化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，二化螟先后對殺蟲單、三唑磷、毒死蜱、氟蟲腈和氯蟲苯甲酰胺等殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性(Suetal.，2014；常菊花，2016；Luetal.，2017；Yaoetal.，2017)。本文克隆了二化螟CsCncC和CsKeap1基因，測定了CsCncC和CsKeap1基因在二化螟不同發(fā)育階段和不同組織的mRNA表達水平，并研究了CsCncC和CsKeap1基因?qū)⑾x劑氯蟲苯甲酰胺的誘導(dǎo)響應(yīng)，為進一步研究二化螟對氯蟲苯甲酰胺等殺蟲劑的代謝抗性機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與試劑

二化螟試蟲采集于揚州市儀征市水稻田(32.39 N，119.42 E)，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在溫度28℃±1℃，相對濕度70%±5%，光周期為16 ∶8(L ∶D)條件下，用人工飼料進行飼養(yǎng)(Huangetal.，2016)。SMARTer RACE 5′/3′ Kit、Mighty Amp、PrimeScriptTM1stcDNA Synthesis Kit、Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB Green Premix Ex TaqTM等酶和試劑盒購買于寶生物工程(大連)有限公司(Takara)；pEASY-T1克隆載體、Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞購買于北京全式金生物技術(shù)有限公司。95%氯蟲苯甲酰胺原藥購自美國杜邦公司。

1.2 二化螟處理

根據(jù)前期獲得的氯蟲苯甲酰胺對二化螟的毒力回歸線，分別配制含有LC30(0.092 mg/L)和LC70(0.47 mg/L)氯蟲苯甲酰胺的人工飼料(Huangetal.，2016)。使用含有氯蟲苯甲酰胺的人工飼料和對照飼料處理二化螟3齡幼蟲，每個處理接入60頭幼蟲，重復(fù)3次，分別在處理12 h、24 h和36 h后收集樣品試蟲，每5頭二化螟幼蟲為一個樣品。

1.3 二化螟CsCncC和CsKeap1的基因克隆與序列分析

根據(jù)試劑盒說明，使用Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取二化螟總RNA，置于-80℃條件下保存?zhèn)溆?。以提取的總RNA為模板，使用PrimeScriptTM1stcDNA Synthesis Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈模板。根據(jù)從二化螟轉(zhuǎn)錄組(Mengetal.，2019a)中鑒定到的CsCncC和CsKeap1序列片段，設(shè)計特異性引物(表1)，用于RT-PCR擴增并測序驗證。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系中包含：9 μL ddH2O、12.5 μL Amp Buffer、1 μL上游/下游引物(10 μM)、0.5 μL Amp聚合酶、1 μL cDNA模板。PCR擴增條件為：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸3 min，循環(huán)37次；72℃延伸10 min。使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit對PCR產(chǎn)物進行回收，并連接到pEASY-T1克隆載體上，進一步轉(zhuǎn)化到Trans 5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。

表1 本文中使用的引物

根據(jù)RT-PCR測序結(jié)果，設(shè)計特異性引物，使用SMARTer RACE 5′/3′ Kit對二化螟CsCncC和CsKeap1基因的5′和3′端進行擴增。分別使用CLUSTALW和MEGA 5.0軟件對二化螟CsCncC和CsKeap1進行多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)生分析。利用ExPASy在線軟件(https: //web.expasy.org/protparam/)對翻譯蛋白質(zhì)的蛋白分子質(zhì)量和等電點進行預(yù)測。通過與已發(fā)表的其它昆蟲同源基因的比對，分析CsCncC和CsKeap1的保守結(jié)構(gòu)域和特征性基序。

1.4 定量PCR(qPCR)檢測

根據(jù)克隆獲得的二化螟CsCncC和CsKeap1序列信息，設(shè)計特異性引物，使用熒光定量PCR對兩個基因在二化螟不同齡期、不同組織部位中的表達量進行分析。分別收集二化螟幼蟲、蛹和成蟲的不同齡期試蟲，并從3齡幼蟲中解剖出血淋巴、神經(jīng)索、腦、脂肪體、表皮、前腸、中腸、后腸和馬氏管組織，從24 h雌成蟲中解剖出卵巢組織。每個樣品收集3個生物重復(fù)。以在二化螟中穩(wěn)定表達的EF-1a為內(nèi)參基因(Huietal.，2011；Mengetal.，2019b)。熒光定量PCR反應(yīng)體系中含有10 μL 2×TB Green Premix Ex Taq，10 μM的上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，6 μL滅菌ddH2O。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)；在擴增結(jié)束后進行熔解曲線分析檢測擴增反應(yīng)的特異性。利用2ΔΔCt方法計算計算目標(biāo)基因的相對表達量，利用one-way ANOVA 進行差異顯著性分析與多重比較。實驗數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 二化螟CsCncC基因克隆及序列分析

通過克隆獲得二化螟CsCncC基因2 845 bp cDNA全長序列(GenBank登錄號：MW147281)，其中包含一個長度為2 160 bp的開放閱讀框，一個262 bp的5′非翻譯區(qū)為和一個423 bp的3′非翻譯區(qū)(圖1)。二化螟CsCncC基因編碼719個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為80.59 kDa，等電點為5.87。

圖1 二化螟CsCncC基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of CsCncC in Chilo suppressalis

氨基酸多重序列比對發(fā)現(xiàn)，二化螟CsCncC蛋白具有Nrf2家族的典型結(jié)構(gòu)特征，如含有高度保守的CNC類型的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(basic leucine zipper，bZIP)和ETGE基序，但DLG基序變?yōu)镈MG(圖2)。對不同昆蟲CncC的系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，二化螟CsCncC與鱗翅目昆蟲CncC聚于同一支(圖3)。

圖2 二化螟CsCncC與其它昆蟲CncC的氨基酸序列比對Fig.2 Multiple alignments of CncC from Chilo suppressalis and other insects

圖3 二化螟CsCncC的系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CsCncC

2.2 二化螟CsKeap1基因克隆及序列分析

通過克隆獲得二化螟CsKeap1基因2 544 bp cDNA全長序列(GenBank登錄號：MW147282)，其中包含一個長度為1 923 bp的開放閱讀框，一個321 bp的5′非翻譯區(qū)為和一個300 bp的3′非翻譯區(qū)(圖4)。二化螟CsKeap1基因編碼640個氨基酸，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為71.15 kDa，等電點為5.87。

圖4 二化螟CsKeap1基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of CsKeap1 in Chilo suppressalis

氨基酸多重序列比對發(fā)現(xiàn)，二化螟CsKeap1蛋白具有昆蟲Keap1家族的典型結(jié)構(gòu)特征，如高度保守的BTB(bric-abrac/tramtrack/broad complex)區(qū)域、干預(yù)區(qū)(IVR，intervening region)/linker domain和雙甘氨酸或Kelch重復(fù)區(qū)(DGR，double glycine or Kelch repeat)(圖5)。對不同昆蟲Keap1的系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，二化螟CsKeap1與鱗翅目昆蟲Keap1共聚一枝，具有較高的同源性(圖6)。

2.3 CsCncC和CsKeap1的時空表達模式分析

2.3.1CsCncC和CsKeap1在二化螟不同發(fā)育階段的表達模式分析

對CsCncC和CsKeap1在二化螟不同發(fā)育齡期(幼蟲、蛹和成蟲)中的表達模式分析發(fā)現(xiàn)，CsCncC在蛹末期的表達量最高，在其它齡期的表達水平變化不大(圖7)。CsKeap1在二化螟預(yù)蛹期表達量最低，在成蟲初期的表達水平顯著高于其它齡期，羽化24 h后CsKeap1的表達水平顯著降低并維持在較低水平(圖8)。

2.3.2CsCncC和CsKeap1在二化螟不同組織中的表達模式分析

分別解剖二化螟神經(jīng)索、腦、前腸、中腸、后腸、馬氏管、血淋巴、脂肪體、表皮和卵巢組織，對CsCncC和CsKeap1在二化螟不同組織部位的表達量進行測定分析。結(jié)果顯示，CsCncC在神經(jīng)組織腦和神經(jīng)索中的表達量較低，在中腸和馬氏管中高表達，此外在前腸和卵巢中也具有較高的表達量(圖9)。CsKeap1在二化螟脂肪體中的表達量最高，在中腸、馬氏管、神經(jīng)索和卵巢中也具有較高的表達水平(圖10)。

圖5 二化螟與其它昆蟲Keap1的氨基酸序列比對Fig.5 Multiple alignments of Keap1 from Chilo suppressalis and other insects

圖6 二化螟Keap1的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.6 Phylogenetic analysis of CsKeap1

圖7 CsCncC基因在二化螟不同發(fā)育齡期中的相對表達量Fig.7 Relative expression levels of CsCncC gene in different developmental stages of Chilo suppressalis

圖8 CsKeap1基因在二化螟不同發(fā)育齡期中的相對表達量Fig.8 Relative expression levels of CsKeap1 gene in different developmental stages of Chilo suppressalis

圖9 CsCncC基因在二化螟不同組織中的相對表達量Fig.9 Relative expression levels of CsCncC gene in different tissues of Chilo suppressalis

圖10 CsKeap1基因在二化螟不同組織中的相對表達量Fig.10 Relative expression levels of CsKeap1 gene in different tissues of Chilo suppressalis

2.4 二化螟CsCncC和CsKeap1對氯蟲苯甲酰胺的誘導(dǎo)響應(yīng)

使用LC30和LC70劑量氯蟲苯甲酰胺處理二化螟3齡幼蟲，測定藥劑處理對二化螟CsCncC和CsKeap1的表達量的影響。結(jié)果顯示，使用LC30劑量氯蟲苯甲酰胺分別處理幼蟲12 h、24 h和36 h后，相比于對照，CsCncC在處理12 h和24 h后下調(diào)表達，在處理36 h后的表達量無顯著變化(圖11-A)；CsKeap1的表達量均顯著降低(圖11-B)。使用LC70劑量氯蟲苯甲酰胺處理后，CsCncC在處理12 h和24 h后的表達水平無顯著變化，在處理36 h后被顯著誘導(dǎo)表達(圖11-A)；CsKeap1的表達量在處理12 h后顯著下降，在處理24 h后無明顯變化，在處理36 h后則顯著上調(diào)表達(圖11-B)。

圖11 二化螟CsCncC(A)和CsKeap1(B)對氯蟲苯甲酰胺的誘導(dǎo)響應(yīng)Fig.11 Induction responses of CsCncC(A) and CsKeap1(B) to chlorantraniliprole treatment in Chilo suppressalis

3 結(jié)論與討論

Nrf2-Keap1通路調(diào)控細(xì)胞氧化還原平衡以及保護性細(xì)胞抗氧化和Ⅱ相解毒反應(yīng)，對于維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有至關(guān)重要的作用。本文對二化螟CsCncC和CsKeap1進行了克隆，結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，與哺乳動物Nrf2相似，CsCncC具有負(fù)責(zé)與小Maf蛋白(small Maf proteins)形成異源二聚體并與靶標(biāo)基因的抗氧化反應(yīng)元件(ARE，antioxidant response element)結(jié)合的bZIP結(jié)構(gòu)(Nioietal.，2005)以及對結(jié)合keap1起關(guān)鍵作用的保守性ETGE基序(Chowdhryetal.，2013)，但與其它鱗翅目昆蟲一致，與Nrf2和Keap1識別結(jié)合相關(guān)的DLG基序變?yōu)镈MG(Huetal.，2018)。Cskeap1蛋白分別含有BTB、linker和Kelch結(jié)構(gòu)域。BTB結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)Keap1形成同源二聚體和招募Cullin-3 (Cul3)過程中具有重要作用(Tkachevetal.，2011；Pitoniak and Bohmann, 2015)。IVR結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸，對氧化應(yīng)激信號敏感(Kimetal.，2014；Yangetal.，2017)。在正常條件下，Keap1會與Nrf2相互結(jié)合形成異二聚體，多余的Nrf2會被迅速降解掉，從而維持胞質(zhì)中Nrf2的低水平。當(dāng)機體受到氧化刺激時，Keap1的IVR區(qū)域會被迅速激活，這個過程會抑制Nrf2的降解，從而誘導(dǎo)Nrf2在胞質(zhì)中的積累(Lietal.，2008)。DGR區(qū)也叫Kelch區(qū)，其中含有5個雙甘氨酸重復(fù)序列，是Keap1與Nrf2的結(jié)合區(qū)。系統(tǒng)發(fā)生分析也表明，CsCncC和CsKeap1與其它鱗翅目昆蟲同源蛋白聚為一支。

基因表達模式通常與其生理功能相關(guān)。對家蠶BombyxmoriLinnaeus的研究發(fā)現(xiàn)，BmCncC在5齡幼蟲表皮、馬氏管、頭部和脂肪體表達水平較高，Bmkeap1在5齡幼蟲脂肪體、頭部、生殖腺和表皮表達水平較高(Wangetal.，2020)。對馬鈴薯甲蟲的研究發(fā)現(xiàn)，LdCncC在幼蟲中腸、前胸腺和雌成蟲卵巢中高水平表達，LdKeap1在腦-心側(cè)體-咽側(cè)體復(fù)合體中表達水平最高，在幼蟲前腸、前胸腺和雌成蟲卵巢中表達水平也較高(Sunetal.，2017)。本文研究發(fā)現(xiàn)，CsCncC在二化螟中腸和馬氏管中的表達水平最高，在前腸和卵巢中也具有較高的表達水平；CsKeap1在二化螟脂肪體中的表達水平最高，在中腸、馬氏管、神經(jīng)索和卵巢中也具有較高的表達水平。消化道是昆蟲攝入外源化合物后的第一道防線，馬氏管和脂肪體是昆蟲對外源化合物進行降解和解毒代謝的重要組織，因此CsCncC和CsKeap1在二化螟不同組織中的表達模式表明這2個基因在二化螟的解毒代謝過程中具有重要作用。值得注意的是，與家蠶相似，CsCncC和CsKeap1在卵巢中也具有一定的表達水平，表明昆蟲CncC和Keap1除了在抗化學(xué)和氧化脅迫中具有重要作用外，還可能具有其它生理功能。

氯蟲苯甲酰胺是美國杜邦公司開發(fā)的高效、安全的二酰胺類殺蟲劑。研究發(fā)現(xiàn)，二化螟對氯蟲苯甲酰胺的抗性與細(xì)胞色素P450基因CYP6CV5，CYP9A68，CYP321F3和CYP324A12以及UDP-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶CsUGT40AL1和CsUGT33AG3的過表達相關(guān)(Xuetal.，2019；Zhaoetal.，2019)。本文使用LC30和LC70濃度氯蟲苯甲酰胺處理二化螟3齡幼蟲，發(fā)現(xiàn)LC30濃度處理并不能誘導(dǎo)CsCncC和CsKeap1的表達，而用LC70濃度處理36 h后這兩個基因表達水平都顯著上調(diào)。對家蠶的研究也發(fā)現(xiàn)，0.01 mg/L氯蟲苯甲酰胺處理家蠶5齡幼蟲后，脂肪體中BmCncC和Bmkeap1的mRNA表達水平均顯著上調(diào)(Maoetal.，2019)，但4 mg/L辛硫磷處理家蠶5齡幼蟲后24 h后，BmCncC的表達顯著上調(diào)，而Bmkeap1的表達水平顯著下調(diào)(Huetal.，2018)，表明農(nóng)藥對昆蟲CncC和Keap1的誘導(dǎo)效應(yīng)可能具有劑量依賴性，并且這種誘導(dǎo)效應(yīng)也因殺蟲劑而異。今后有必要進一步研究氯蟲苯甲酰胺處理對CsCncC亞細(xì)胞定位的影響以及CncC-keap1通路在二化螟對氯蟲苯甲酰胺抗性中的作用。