王曙東， 董 青， 王 可， 馬 倩

(1. 鹽城工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 紡織服裝學(xué)院， 江蘇 鹽城 224005； 2. 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215002； 3. 江蘇金麥穗新能源科技股份有限公司， 江蘇 鹽城 224013；4. 蘇州工業(yè)園區(qū)海歸人才子女學(xué)校， 江蘇 蘇州 215021)

組織工程學(xué)是一門通過具有生物相容性的支架材料修復(fù)或替代原有病變器官組織，并達(dá)到組織再生的交叉學(xué)科，組織工程支架材料應(yīng)具有仿天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，同時(shí)應(yīng)具有良好的生物相容性、生物可降解性和一定的力學(xué)性能[1-2]。近年來，生物可降解材料因其可制備綠色、環(huán)境友好型的復(fù)合材料而引起研究人員的興趣[3-4]。聚乳酸(PLA)是一種新型可降解材料，可從玉米、淀粉、馬鈴薯等可再生資源中提取出的淀粉合成而得，因具有良好的生物相容性、力學(xué)性能和易于加工，已被廣泛應(yīng)用于組織工程支架材料[5-6]。然而，聚乳酸組織工程支架材料仍存在力學(xué)強(qiáng)度不夠高，細(xì)胞相容性有待進(jìn)一步提高等問題[7]。

近年來，石墨烯因其特有的機(jī)械、電、光等特性[8-9]，已被廣泛應(yīng)用于傳感器、電池、光學(xué)設(shè)備和超級(jí)電容器[10-11]，石墨烯也已被證明具有潛在的生物醫(yī)學(xué)價(jià)值[12-13]。目前，已有多種方法可制備不同尺寸和結(jié)構(gòu)的石墨烯[14-15]，本文課題組之前已采用氫碘酸還原法制備還原氧化石墨烯(rGO)[16]。靜電紡絲技術(shù)可將天然或合成聚合物材料制備成由微納米纖維構(gòu)成的多孔支架材料，已被廣泛應(yīng)用于制備組織工程支架材料[17-18]。目前，國內(nèi)外已有采用靜電紡絲法制備PLA和石墨烯或氧化石墨烯復(fù)合材料的相關(guān)報(bào)道[19-20]，但采用rGO修飾或改性PLA納米纖維的報(bào)道較少。本文將PLA與制備的rGO以一定的質(zhì)量比例復(fù)合，并采用靜電紡絲法制備PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜，研究rGO的復(fù)合對(duì)納米纖維膜力學(xué)性能的影響，并對(duì)其細(xì)胞相容性進(jìn)行表征，為該復(fù)合納米纖維膜應(yīng)用于組織工程支架材料提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PLA(相對(duì)分子質(zhì)量為1 000 000)，山東岱罡生物科技有限公司；石墨粉，分析純，南京先豐納米材料科技有限公司；氯化鈉、濃硫酸、高錳酸鉀、過氧化氫、氫碘酸、N,N-二甲基甲酸胺(DMF)等，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；純水為實(shí)驗(yàn)室自制。小鼠胚胎成骨細(xì)胞，蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院提供。

1.2 PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的制備

采用文獻(xiàn)[21]方法制備氧化石墨烯，并采用氫碘酸還原法制備rGO。首先，將PLA/rGO復(fù)合物溶解(rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.4%和0.6%，當(dāng)rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過0.6%時(shí)，已很難在紡絲液中分散并形成團(tuán)聚)分散于DMF溶液中，紡絲液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%。然后，按照?qǐng)D1所示采用靜電紡絲方法制備PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜(rGO 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.0%、0.2%、0.4%和0.6%對(duì)應(yīng)樣品編號(hào)為1#、2#、3#和4#)。靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：電壓15 kV，紡絲液流速0.5 mL/h，紡絲口至收集裝置的距離15 cm。

圖1 靜電紡PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的制備示意圖Fig.1 Diagrammatic sketch of preparation of electrospinning PLA/rGO blended nanofibrous membrane

1.3 測(cè)試與表征

紡絲液黏度測(cè)試：采用AR2000型流變儀(美國TA儀器公司)測(cè)試PLA/rGO復(fù)合紡絲溶液的黏度，旋轉(zhuǎn)剪切范圍為0.1～100 s-1。

形貌觀察及纖維直徑測(cè)試：對(duì)復(fù)合納米纖維膜進(jìn)行噴金處理后，采用S-4800型掃描電子顯微鏡(SEM， 日本日立公司)觀察其表面形貌，并采用Photoshop 7.0測(cè)量掃描電鏡照片中100根纖維的直徑，取平均值得到納米纖維的平均直徑；將復(fù)合納米纖維膜放在銅網(wǎng)上，采用Hitachi 600型透射電子顯微鏡(TEM，日本日立公司)觀察PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

表面元素測(cè)試：采用S-4800型掃描電子顯微鏡及其配套TM3030型能譜儀(日本日立公司)掃描PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的微區(qū)中碳和氧元素的能譜圖。

拉曼光譜測(cè)試：采用HR800型共聚焦顯微拉曼光譜儀(法國HORIBA Jobin Yvon公司)測(cè)試PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的拉曼光譜，測(cè)試范圍為3 000～500 cm-1。

力學(xué)性能測(cè)試：采用Instron 3365型強(qiáng)伸度測(cè)試儀(美國Instron公司)測(cè)試PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的拉伸性能，夾持長度為20 mm，拉伸速率為20 mm/min， 預(yù)加張力為0.2 cN。根據(jù)納米纖維膜的斷裂強(qiáng)力、斷裂伸長率、彈性模量等數(shù)據(jù)，獲得應(yīng)力-應(yīng)變曲線[22]。每組樣品測(cè)試3組，取平均值。

細(xì)胞相容性測(cè)試：采用小鼠胚胎成骨細(xì)胞培養(yǎng)來表征PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的細(xì)胞相容性，采用四唑鹽比色(MTT)法測(cè)定細(xì)胞在纖維膜上的生長情況[23]。

2 結(jié)果與討論

2.1 PLA/rGO復(fù)合紡絲溶液的流變性能

圖2(a)示出PLA/rGO復(fù)合紡絲溶液的形貌?？梢姡杭働LA紡絲溶液呈透明無色狀，加入rGO分散后紡絲液呈現(xiàn)黑色，且隨著rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，紡絲溶液顏色逐漸加深；rGO在PLA與DMF體系中分散良好，無團(tuán)聚和沉淀現(xiàn)象。圖2(b)示出含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)rGO的紡絲溶液的黏度?？梢姡弘S著rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，復(fù)合紡絲溶液的黏度逐漸增加，這是由于rGO分散于聚乳酸紡絲溶液中，分子間相互作用力增強(qiáng)，導(dǎo)致溶液黏度增大。

圖2 PLA/rGO復(fù)合紡絲溶液的外觀形貌和流變性能Fig.2 Morphology (a) and rheological property (b) of PLA/rGO blended spinning solution

2.2 PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜形貌結(jié)構(gòu)

圖3示出PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的形貌結(jié)構(gòu)照片。由圖3(a)可見，1#納米纖維膜具有多孔結(jié)構(gòu)，纖維粗細(xì)和分布較為均勻，纖維平均直徑約為150 nm。 由圖3(b)～(d)可見：復(fù)合納米纖維膜的纖維直徑較1#納米纖維膜有一定程度的增加，納米纖維膜的纖維直徑達(dá)到180～220 nm，這是由于紡絲液黏度增加的緣故。與1#納米纖維膜相比，有不規(guī)則球狀物分布于復(fù)合納米纖維膜(2#～4#)表面及內(nèi)層，且隨著rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，球狀物的數(shù)量也有一定程度增加。根據(jù)課題組之前相關(guān)研究結(jié)果表明[24]，分布于納米纖維膜中的不規(guī)則球狀物是PLA納米纖維包覆的rGO顆粒。

圖3 不同rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PLA/rGO 復(fù)合納米纖維膜的SEM照片(×5 000)Fig.3 SEM images of PLA/rGO blended nanofibrous membrane with different mass fraction of rGO(×5 000)

圖4示出rGO及PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的透射電鏡照片。由圖4(a)可見，rGO為單層片狀結(jié)構(gòu)，尺寸大小為微納米級(jí)別。由圖4(b) rGO高分辨率透射電鏡照片可見，rGO擁有良好的晶體狀結(jié)構(gòu)。由圖4(c)、(d) 4#復(fù)合納米纖維的透射電鏡照片可見，有不規(guī)則球狀物串于復(fù)合納米纖維上，這與掃描電鏡分析結(jié)果是一致的，且通過透射電鏡可清楚地觀察到不規(guī)則球狀物內(nèi)部為片狀rGO，表明rGO被成功地復(fù)合至PLA納米纖維膜中。

圖4 rGO及PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的透射電鏡照片F(xiàn)ig.4 TEM images of rGO and PLA/rGO blended nanofibrous membrane. (a) Low resolution image of rGO; (b) High resolution image of rGO; (c) Low resolution image of 4#; (d) High resolution image of 4#

2.3 PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜化學(xué)結(jié)構(gòu)

為進(jìn)一步驗(yàn)證rGO被成功地復(fù)合至PLA納米纖維膜中，測(cè)定了PLA及PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的拉曼光譜圖，如圖5所示。可知，rGO的復(fù)合未改變PLA的結(jié)構(gòu)，與純PLA納米纖維膜相比，PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜均在1 580和1 340 cm-1處出現(xiàn)2處特征峰，分別歸屬于rGO中碳的G峰和D峰[25]，進(jìn)一步驗(yàn)證了rGO被成功地復(fù)合至PLA納米纖維中。由圖5還可見，隨著rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜拉曼光譜圖的G峰的強(qiáng)度逐漸增加，進(jìn)一步表明復(fù)合至PLA納米纖維膜rGO顆粒的數(shù)量逐漸增加，這與掃描電鏡分析結(jié)果是一致的。

圖5 不同rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PLA/rGO 復(fù)合納米纖維膜的拉曼光譜圖Fig.5 Raman spectra of PLA/rGO blended nanofibrous membrane with different mass fraction of rGO

2.4 PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜力學(xué)性能

PLA及PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的力學(xué)性能如圖6和表1所示。

表1 PLA/rGO復(fù)合納米纖維的力學(xué)性能Tab.1 Mechanical property of PLA/rGO blended nanofibrous membrane

圖6 PLA/rGO復(fù)合納米纖維的力學(xué)性能Fig.6 Mechanical property of PLA/rGO blended nanofibrous membrane

由圖6可見，1#納米纖維膜的斷裂強(qiáng)度以及彈性模量較小，分別為(0.88±0.12)和(1.52±0.21) MPa， 斷裂伸長率為(57.53±4.28)%，復(fù)合rGO后的PLA納米纖維膜的斷裂強(qiáng)度和彈性模量

較1#納米纖維膜有一定程度提高，斷裂伸長率有一定程度下降。隨著rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，復(fù)合納米纖維膜的斷裂強(qiáng)度和彈性模量逐漸增加，當(dāng)rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%時(shí)，4#復(fù)合納米纖維膜的斷裂強(qiáng)度和彈性模量分別達(dá)到(2.02±0.21)和(4.93±0.51) MPa，分別是1#納米纖維膜的2.3倍和3.2倍，表明rGO的復(fù)合對(duì)于PLA納米纖維膜具有較好的增強(qiáng)作用。

2.5 PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜細(xì)胞相容性

小鼠胚胎成骨細(xì)胞在PLA及PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜上培養(yǎng)7 d后的細(xì)胞增殖情況如表2所示?？梢?，小鼠胚胎成骨細(xì)胞在PLA及PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜上均可較好地生長和增殖，這是因?yàn)镻LA具有良好的生物相容性，且納米纖維膜為多孔結(jié)構(gòu)。MTT結(jié)果顯示，rGO的復(fù)合在一定程度上有利于細(xì)胞在PLA納米纖維膜上的增殖。這可能是由于rGO的電子傳遞特性，有利于促進(jìn)細(xì)胞生長[26]；另一方面，可能是由于rGO的復(fù)合，使得PLA納米纖維膜的含氧基團(tuán)數(shù)量增加，提升了納米纖維膜表面親水性，有利于細(xì)胞生長與增殖。

表2 小鼠胚胎成骨細(xì)胞在PLA及PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜上的增殖情況Tab.2 Proliferation of mouse embryonic osteoblasts on PLA and PLA/rGO blended nanofibrous membrane

圖7示出PLA及PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜能譜的碳和氧元素的分布圖。結(jié)果顯示，PLA納米纖維膜的表面氧碳元素含量比為0.20，隨著rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，復(fù)合納米纖維膜表面的氧碳元素比逐漸提高，當(dāng)rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí)，復(fù)合納米纖維膜的表面氧碳元素比增至0.27，驗(yàn)證了rGO的復(fù)合，使得PLA納米纖維膜表面的含氧基團(tuán)數(shù)量增加，提升了材料表面親水性，有利于細(xì)胞生長與增殖。上述結(jié)果表明本文制備的復(fù)合納米纖維膜具有良好的生物相容性。

圖7 PLA及PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜的表面碳、氧元素分布情況Fig.7 EDS images of C and O elements on surface of PLA and PLA/rGO blended nanofibrous membrane. (a) C element on surface of 1#; (b) O element on surface of 1#; (c) C element on surface of 2#; (d) O element on of 2#; (e) C element on surface of 3#; (f) O element on surface of 3#; (g) C element on surface of 4#; (h) O element on surface of 4#

3 結(jié) 論

本文將一定質(zhì)量的還原氧化石墨烯(rGO)分散于聚乳酸(PLA)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)紡絲溶液中，通過靜電紡絲法制備得到PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜，并研究了其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞相容性，得出如下主要結(jié)論。

1)rGO可較好地分散于PLA和DMF紡絲液中，隨著rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，復(fù)合紡絲液的黏度增加。

2)PLA/rGO復(fù)合納米纖維平均直徑為180～220 nm， rGO以不規(guī)則球狀形式分布于PLA納米纖維膜中，隨著rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，復(fù)合在納米纖維中的球狀物的數(shù)量也有一定程度增加。

3)rGO的復(fù)合未改變PLA的結(jié)構(gòu)，且使PLA納米纖維膜的力學(xué)性能有一定增加，隨著rGO質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，復(fù)合納米纖維膜的斷裂強(qiáng)度逐漸增加。

4)小鼠胚胎成骨細(xì)胞可在復(fù)合納米纖維膜上生長和增殖，說明PLA/rGO復(fù)合納米纖維膜具有較好的細(xì)胞相容性，rGO的復(fù)合有利于細(xì)胞在PLA納米纖維膜上的增殖。