侯金星，李 勝，韓金澄，吳雙虎，安小鵬，王沛捷，李云甫*

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省畜牧技術(shù)推廣總站,陜西 西安 710014；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；4.三原縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 三原 713800)

乳腺上皮細(xì)胞是乳腺組織泌乳的基本單位，乳腺組織經(jīng)歷哺乳-退化-哺乳的循環(huán)途徑影響乳腺上皮細(xì)胞增殖、分化、凋亡和重塑[1]。而這些循環(huán)過程中，乳腺上皮細(xì)胞受激素，生長(zhǎng)因子，miRNAs等眾多因素調(diào)控影響其功能[2]。有研究表明乳腺上皮細(xì)胞的增殖能力與乳腺的發(fā)育及泌乳等功能有密切的聯(lián)系[1]。因此，本試驗(yàn)旨在探究miRNA對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控作用，這一結(jié)果對(duì)于探索乳腺發(fā)育等生物學(xué)功能具有重要的意義。

MiRNAs是一種長(zhǎng)度為19～22 bp的內(nèi)源性非編碼RNA，miRNAs可以特異性結(jié)合到靶基因的3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或被阻斷翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[3-4]。細(xì)胞增殖[5]、凋亡[6]、分化[7]、免疫[8]、腫瘤[9]等重要過程都有miRNAs的參與。近年來發(fā)現(xiàn)miRNAs在乳腺發(fā)育過程扮演重要角色[10]。一方面，miRNAs可以通過調(diào)控PCNA，C-MYC，cyclinD1等增殖相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞增殖[11]。另一方面，miRNAs可以通過調(diào)控Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞凋亡[12]。miR-214通過抑制PCNA以及WNT靶基因cyclinD1和C-MYC的表達(dá)負(fù)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖[13]。此外，miR-573通過靶向Bax負(fù)調(diào)節(jié)Caspase3的表達(dá)影響核髓細(xì)胞的增殖和凋亡[14]。目前，Chi-miR-3031在奶山羊上皮細(xì)胞凋亡中的研究還很少，盡管Chi-miR-3031可以通過激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路下調(diào)IGFBP5的表達(dá)促進(jìn)了奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白的合成與分泌[15]。然而，Chi-miR-3031對(duì)乳腺上皮細(xì)胞其他功能的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

試驗(yàn)前期通過對(duì)低泌乳期(產(chǎn)后2 d)和泌乳高峰期(產(chǎn)后90 d)的乳腺組織進(jìn)行高通量測(cè)序，根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果篩選出泌乳高峰期差異高表達(dá)的Chi-miR-3031[16]。因此，本試驗(yàn)首先在體外合成Chi-miR-3031的模擬物及其抑制劑，并將其轉(zhuǎn)染至奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中，通過CCK-8，RT-qPCR，Western blot的方法，探究Chi-miR-3031調(diào)控奶山羊乳腺上皮細(xì)胞增殖及凋亡的具體機(jī)制，為闡明miRNAs調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞功能和乳腺發(fā)育的分子機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本試驗(yàn)所用的乳腺組織采自扶風(fēng)某奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)，將乳腺組織用PBS沖洗3次，然后放入滅菌的加有雙抗的PBS溶液中，分離培養(yǎng)出乳腺上皮細(xì)胞。乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液:DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司) 、10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)(Gibico公司)、1%青霉素鏈霉素混合液(Penicillin-Streptomycin Solution，PS)(Gibico公司)。細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(CCK-8)購(gòu)自南京恩晶生物有限公司。封閉液: 含 5% 脫脂奶粉的 PBS。一抗: 小鼠抗β-ACTIN (稀釋比1：1000)和兔抗Bcl2、Bax、Caspase3多克隆抗體(稀釋比1：1000)。二抗：HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠(稀釋比1:1000)和山羊抗兔抗體(稀釋比1:500)。以上抗體均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)Chi-miR-3031引物序列5'-GGGCTGGCTCCCTCGGCCCC-3'合成Chi-miR-3031的體外模擬物(mimic)，抑制劑(inhibitor)及其陰性對(duì)照組NC(negative control)，inhibitor NC。將奶山羊乳腺上皮細(xì)胞分別培養(yǎng)至6孔板和96孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用細(xì)胞轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)液OPTI-MEMI分別孵育Lipofectamine 2000及miRNA的模擬物5 min后，混合后加入細(xì)胞培養(yǎng)板中放置于37 ℃，5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中20 min。6 h后將OPTI-MEMI培養(yǎng)液更換為F12培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。

1.3 Western blot

根據(jù)1.2方法處理6孔板中的細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，按照說明提取蛋白質(zhì)在115V電壓下電泳2 h，后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后根據(jù)目的蛋白分子量選擇合適的區(qū)間將PVDF膜切開，進(jìn)行一抗、二抗的孵育、顯影、照膠。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè)(CCK-8)

根據(jù)1.2方法處理96孔板中的細(xì)胞，分別在培養(yǎng)21 h和45 h時(shí)每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光繼續(xù)培養(yǎng)3 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm的OD值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)處理得到的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，顯著性檢驗(yàn)通過one-way ANOVA比較法進(jìn)行運(yùn)算。4次重復(fù)的數(shù)據(jù)結(jié)果均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與方法

2.1 Chi-miR-3031對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

通過CCK8法分別檢測(cè)處理后24 h和48 h的山羊乳腺上皮細(xì)胞的活力。結(jié)果如圖1A所示，與NC相比，Chi-miR-3031 mimic顯著促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的活力(24 h和48 h，P<0.05)，而與inhibitor NC相比， miR-3031 inhibitor顯著抑制乳腺上皮細(xì)胞活力(48 h，P<0.05)。RT-qPCR結(jié)果顯示，與NC組相比，Chi-miR-3031 mimic顯著提高PCNA，C-MYCmRNA的表達(dá)量。反之，與inhibitor NC組相比，3031 inhibitor顯著降低PCNA和C-MYCmRNA的表達(dá)量(圖1B～C)。

圖1 Chi-miR-3031對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響A. CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力；B. 轉(zhuǎn)染24 h后PCNA的mRNA表達(dá)水平；C. 轉(zhuǎn)染24 h后C-MYC的mRNA表達(dá)水平;*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同F(xiàn)ig. 1 Effect of Chi-miR-3031 on mammary epithelial cells proliferationA. Cell viability detected by CCK-8 assay; B. The mRNA expression of PCNA after transfection for 24 h;C. The mRNA expression of C-MYC after transfection for 24 h;* means P<0.05, ** means P<0.01. The same bellow

2.2 Chi-miR-3031對(duì)Bcl-2及bax蛋白表達(dá)量的影響

通過Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖2A所示，與NC組相比，Chi-miR-3031 mimic顯著增加Bcl-2的蛋白表達(dá)量(P<0.01)，與inhibitor NC相比，miR-3031 inhibitor顯著抑制Bcl-2的蛋白表達(dá)量(P<0.05)。隨后，本試驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因Bax的蛋白表達(dá)水平，如圖2B所示，分別與NC、inhibitor NC相比較，Chi-miR-3031 mimic對(duì)Bax蛋白表達(dá)無顯著影響，而miR-3031 inhibitor顯著增加Bax蛋白表達(dá)量(P<0.05)。Bcl-2/Bax的比值可以作為判斷細(xì)胞凋亡作用的標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)中，與NC相較，Chi-miR-3031 mimic顯著升高Bcl-2/Bax比值(P<0.01)，而與inhibitor NC相較， miR-3031 inhibitor顯著降低Bcl-2/Bax的比值(P<0.01)，如圖2C所示。

圖2 Chi-miR-3031對(duì)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響A. Western Blot 檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)；B. Western Blot 檢測(cè)Bax蛋白的表達(dá)；C. Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比率Fig. 2 The influence of Chi-miR-3031 on theprotein expression of Bcl-2/BaxA. The protein levels of Bcl-2 were detected by Western Blot;B. The protein levels of Bax were detected by Western Blot;C. The rate of Bcl-2/Bax protein expression

2.3 Chi-miR-3031對(duì)Caspase3蛋白表達(dá)量的影響

如圖3所示，與NC相比，Chi-miR-3031 mimic顯著抑制Caspase3的蛋白表達(dá)(P<0.01)，與inhibitor NC相比，miR-3031 inhibitor顯著促進(jìn)Caspase3的蛋白表達(dá)(P<0.01)。

圖3 Chi-miR-3031對(duì)Caspase3蛋白表達(dá)的影響(Western Blot檢測(cè))Fig. 3 The influence of Chi-miR-3031 on the proteinexpression of Caspase3 (detected by Western Blot)

3 討 論

近年來，miRNAs在調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞的增殖和凋亡[1]以及乳腺發(fā)育[17]過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)通過高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與初乳期相比，泌乳高峰期薩能奶山羊乳腺組織中差異高表達(dá)的Chi-miR-3031在乳腺發(fā)育和泌乳功能方面作用突出[15]。然而miRNA調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞的功能是通過直接或者間接影響細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的功能因子實(shí)現(xiàn)的。一方面，研究表明不管是miR-498抑制食管癌的增殖與遷移[18]，還是低密度脂蛋白刺激下，miR-148b抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡[19]，都能通過間接調(diào)控細(xì)胞中PCNA、C-MYC的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。本試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染Chi-miR-3031至奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NC組相比，乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量與活力明顯增加，并且細(xì)胞內(nèi)PCNA、C-MYC的mRNA表達(dá)水平顯著升高，這表明Chi-miR-3031能顯著促進(jìn)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的增殖，而Chi-miR-3031抑制劑能顯著抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖，這與前人的研究完全一致[11,18,20]。此外，miR-203促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡[21]，miR-216b抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡[22]，還是miR-497抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]，都是通過間接激活Bcl-2、Bax、Caspase-3級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑，形成凋亡復(fù)合體，誘導(dǎo)細(xì)胞核分裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Chi-miR-3031能顯著促進(jìn)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的比率，并且抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)。這一結(jié)果表明，Chi-miR-3031通過促進(jìn)Bcl-2/Bax的表達(dá)率以及負(fù)調(diào)控Caspase-3的表達(dá)能顯著抑制奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的凋亡，而Chi-miR-3031抑制劑能顯著促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的凋亡。

另一方面，miRNAs能調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)乳蛋白的合成與分泌。研究表明，miR-148a，miR-186和miR-200a等miRNAs在乳中表達(dá)豐富，并且與牛乳腺泌乳量呈正相關(guān)。miR-18a、miR-221/222簇可調(diào)節(jié)乳中乳糖的合成[24]。Chi-miR-3031能通過下調(diào)IGFBP5的表達(dá)促進(jìn)β酪蛋白的合成[15]。除此之外，miRNAs通過直接靶向結(jié)合mRNA序列的3'-UTR，形成沉默復(fù)合體，降解或阻斷細(xì)胞內(nèi)功能因子的轉(zhuǎn)錄與翻譯，從而影響細(xì)胞的增殖與凋亡功能[3]。miR-24-3p靶向MEN1加速細(xì)胞內(nèi)G1/S期轉(zhuǎn)變，促進(jìn)牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖[25]。miR-21-3p靶向IGFBP5促進(jìn)牛乳腺上皮細(xì)胞的活力和增殖[26]。

目前，關(guān)于Chi-miR-3031在乳腺方面的功能研究較少，盡管在本研究中證明了Chi-miR-3031能促進(jìn)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，但是這種調(diào)控機(jī)制不是直接的，而是間接調(diào)控的。因此，進(jìn)一步篩選出Chi-miR-3031下游靶基因，這對(duì)于探究Chi-miR-3031在乳腺上皮細(xì)胞中增殖和凋亡的分子調(diào)控機(jī)制是十分重要的，這也為Chi-miR-3031調(diào)控乳腺發(fā)育的分子機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

4 小 結(jié)

綜上所述，Chi-miR-3031通過調(diào)控PCNA、C-MYC的mRNA表達(dá)水平顯著促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖。此外，Chi-miR-3031通過抑制Bcl-2/Bax/Caspase3級(jí)聯(lián)信號(hào)抑制奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的凋亡。