印陸儀，冀德君，王涵哲, 張 威

(揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

始豐微型牛是中國(guó)浙江省地方保護(hù)品種天臺(tái)黃牛的一個(gè)微型類(lèi)群。天臺(tái)黃牛分布在浙江省臺(tái)州市天臺(tái)縣，屬肉役兼用型的地方優(yōu)良品種。歷史上天臺(tái)縣山區(qū)交通不便，耕地水利條件差，山區(qū)梯田重疊，山塊小，土層淺，本地黃牛耐粗抗熱，行動(dòng)靈敏，對(duì)地形復(fù)雜的山地梯田耕作適應(yīng)能力強(qiáng)，便于放牧飼養(yǎng)，且肉質(zhì)鮮嫩，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇和人工選育而形成了一個(gè)當(dāng)?shù)攸S牛品種。在天臺(tái)黃牛群體中，按1.5歲公牛體高低于95 cm，母牛低于90 cm的標(biāo)準(zhǔn)劃分，存在著一定比例的微小體型個(gè)體，經(jīng)過(guò)十余年的分群管理和微小體型定向選育，逐步形成了一個(gè)微小體型類(lèi)群——始豐微型牛[1]。

中國(guó)南方黃牛較北方黃牛普遍體型較小，身軀與頭部表現(xiàn)為窄型。黃牛體型大小的形成與遺傳特性、生長(zhǎng)激素和性激素軸的調(diào)控有關(guān)[2]。生長(zhǎng)激素軸主要通過(guò)由垂體前葉嗜酸性粒細(xì)胞合成和分泌的生長(zhǎng)激素(GH)來(lái)調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育及相關(guān)代謝過(guò)程；GH可直接誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生IGF-1，同時(shí)GH和其受體結(jié)合可促進(jìn)由復(fù)合酸不穩(wěn)定亞基(ALS)和類(lèi)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3(IGFBP-3)組成三元IGF復(fù)合體，從而穩(wěn)定血液中的IGF-1水平[3]。IGF-1參與身體的營(yíng)養(yǎng)代謝，具有增加DNA和蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)葡萄糖和氨基酸吸收的功能[4]，其水平與體重增加呈正相關(guān)。外源性 IGF-1 能夠介導(dǎo)GH發(fā)揮促生長(zhǎng)的生理作用[5]。矮小動(dòng)物相關(guān)研究中，IGF-1基因在伴性矮小型雞肝臟中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于普通雞，在伴性矮小型雞肝臟中幾乎檢測(cè)不到IGF-1基因的表達(dá)[6]?？傊褐蠫H/GHR和IGF-1水平是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的主要基礎(chǔ)。

始豐微型牛是中國(guó)目前已知小型黃牛品系中體重最輕的類(lèi)群，成年微型牛體重150 kg左右、體高90 cm左右，24月齡屠宰率50%，凈肉率40%左右，肉用生產(chǎn)性能欠佳。國(guó)內(nèi)關(guān)于其種質(zhì)資源特性鮮有研究，是中國(guó)黃牛研究領(lǐng)域的空白。為探討始豐微型牛體型分化的分子機(jī)制，本試驗(yàn)對(duì)普通體型天臺(tái)黃牛和始豐微型牛的外周血生長(zhǎng)激素軸相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，以提供始豐微型牛的基礎(chǔ)生理生化信息，并嘗試對(duì)始豐微型牛體型形成機(jī)制進(jìn)行初步闡釋。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究的動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后開(kāi)展工作。本研究采用的微型牛和較大體型天臺(tái)黃牛來(lái)自浙江省天臺(tái)縣天臺(tái)黃牛保種場(chǎng)，因微型牛公牛存留數(shù)目太少，僅選取13～16月齡的健康始豐微型牛9頭(♀6，♂3)和較大體型天臺(tái)黃牛9頭(♀6，♂3)。

1.2 樣品采集與處理

在早上空腹(禁食一晚，自由飲水)情況下，每頭牛無(wú)菌頸靜脈采血5 mL，加EDTA 抗凝，4 000 r/min離心，取上清，4 ℃保存，及時(shí)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分析。

1.3 ELISA測(cè)定

針對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)因子GH、GHR和IGF-1，采用商用ELISA試劑盒(上海研瑾生物公司)進(jìn)行測(cè)定。 具體方法如下：首先稀釋ELISA試劑盒內(nèi)各標(biāo)準(zhǔn)品，在酶標(biāo)包被板上設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中準(zhǔn)確加樣50 μL，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL，倍比稀釋后輕微振蕩，封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。然后洗滌5次，拍干。接著加入HRP酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外，重復(fù)溫育、洗滌步驟，最后加入底物溶液(TMB)50 μL，輕輕震蕩混勻，覆膜，37 ℃ 避光顯色15 min后，每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀(Labsystems MultiskanMS-352，芬蘭)進(jìn)行450 nm波長(zhǎng)測(cè)量測(cè)定OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

依據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)定數(shù)據(jù)，用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法，分析不同體型組間3個(gè)指標(biāo)的差異。

2 結(jié) 果

2.1 不分性別不同體型間3個(gè)因子含量的比較

不分性別下，微型牛組GH含量(27.68±2.46 μg/L)極顯著低于對(duì)照組(31.67±3.52 μg/L) (P<0.01)；微型組GHR含量 (13.89±2.29 μg/L) 略高于對(duì)照組(12.90±1.66 μg/L)(P>0.05)；微型組IGF-1含量(20.36±2.84 μg/L) 略低于對(duì)照組(20.66±3.68 μg/L) (P>0.05) (圖1)。說(shuō)明生長(zhǎng)激素水平高低仍然是影響天臺(tái)黃牛體型大小的主要因素。

圖1 不分性別情況下不同體型間3個(gè)因子含量比較**表示二者差異極顯著(P<0.01)。下同F(xiàn)ig.1 Comparison of blood biochemical indices betweenminiature and normal body size cattle** represents highly significant difference(P<0.01)

2.2 母牛不同體型間3個(gè)因子含量的比較

母牛中，微型牛組GH含量(27.30±2.11 μg/L)極顯著低于正常體型對(duì)照組(32.11±3.80 μg/L) (P<0.01)；微型組GHR含量(14.92±1.62 μg/L)反而極顯著高于對(duì)照組(12.50±1.57μg/L) (P<0.01)；微型組IGF-1含量(19.49±2.99 μg/L)略低于對(duì)照組(20.74±4.14 μg/L)(P>0.05)。說(shuō)明了母牛上，生長(zhǎng)激素水平高低是影響體型大小的主要因素，然而微型組GHR含量反常過(guò)高，且IGF-1水平并未同步提升，暗示微型牛可能存在GH-GHR結(jié)合上的缺陷，從而導(dǎo)致微型牛生長(zhǎng)發(fā)育受阻。

圖2 母牛不同體型間3個(gè)因子含量的比較Fig.2 Comparison of blood biochemical indicesbetween miniature and normal body size of heifers

2.3 公牛不同體型間3個(gè)因子含量的比較

公牛中，微型牛組GH含量 (28.44±3.11 μg/L) 略低于對(duì)照組(30.77±3.01 μg/L)，GHR含量(11.78±2.05 μg/L)略低于對(duì)照組(13.71±1.65 μg/L)，IGF-1含量(22.10±1.54 μg/L)略高于對(duì)照組(20.52±2.88 μg/L)，3個(gè)因子含量?jī)山M間差異均不顯著(P>0.05) (圖3)。結(jié)果顯示，公牛上，微型牛IGF-1含量并不低于大體型公牛。

圖3 公牛不同體型間3個(gè)因子含量的比較Fig.3 Comparison of blood biochemical indicesbetween miniature and normal body size of bulls

3 討 論

動(dòng)物身高是由多種遺傳因素決定的。動(dòng)物矮小性狀具有較強(qiáng)遺傳性，身高的遺傳力因品種而異，比如荷斯坦-弗利贊雜交牛身高的遺傳力估計(jì)為0.71，安格斯牛0.83。動(dòng)物矮小可分為成比例性和不成比例性?xún)深?lèi)情況。矮小動(dòng)物群體往往是成比例的。矮小動(dòng)物存在多種不同的遺傳形式，各自具有獨(dú)特的微進(jìn)化過(guò)程。一種是人為有意選擇(如中國(guó)版納小型豬等品種)；另一種是利用雜交優(yōu)勢(shì)選擇去除了純合子引致的有害性狀，如北歐紅牛存在與高產(chǎn)奶量關(guān)聯(lián)的某個(gè)基因缺失，純合化會(huì)導(dǎo)致胚胎死亡；或者是因?yàn)榇嬖谥畋丬?chē)基因；還可能由于群體規(guī)模較小，存在遺傳漂變[7]。

導(dǎo)致矮小性狀最簡(jiǎn)單直接的機(jī)制是單基因突變。近幾年，通過(guò)對(duì)矮小動(dòng)物的SNP研究，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)單基因突變引致的矮小性狀。矮型婆羅門(mén)牛GH1上的T200M變異[8]，矮型比利時(shí)藍(lán)牛RNF11剪切位點(diǎn)c.124-2A > G的變異[9]，矮型美洲安格斯牛PRKG2 上的無(wú)義突變C > T[10]，矮型日本褐牛EVC2上兩個(gè)突變[11]，矮型Tyrolean 灰牛EVC2上2 bp (AC) 的缺失[12]，Dexter牛ACAN上的突變[13]，矮型Fleckvieh 牛GON4L上1 bp (C) 的缺失[14]；在其它動(dòng)物上，還有矮小雞的IHH[15]，GHR[16]上的缺失、Texel綿羊SLC13A1[17]的缺失，以及人GH1上的T175A變異[18]，等。天臺(tái)黃牛屬于中等偏小體型類(lèi)，其中的始豐微型牛類(lèi)群并不具有矮型婆羅門(mén)牛GH1的矮化位點(diǎn)(T200M)[19]，國(guó)內(nèi)在黃牛體格大小形成機(jī)制方面的研究尚不充分，即使是已經(jīng)熟知的矮小型豬、雞[15]、馬等，都未能充分闡明其矮小機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，在母牛上，GH水平高低是影響體型大小的主要因素，然而微型牛GHR含量反常過(guò)高，且IGF-1水平并未同步提升，仍低于對(duì)照，這一現(xiàn)象和楊寧等[6]在雞伴性矮小的這3個(gè)基因表達(dá)研究結(jié)果基本一致，可能是GHR編碼產(chǎn)物異常阻礙了GH-GHR-IGF信號(hào)通路, 不能發(fā)揮正常的生理功能。不過(guò)最終確定，是IHH基因的11 896 bp缺失，導(dǎo)致軟骨發(fā)育期IHH表達(dá)水平降低，使得骨骼發(fā)育受阻[15]。另一方面，在公牛上，微型牛IGF-1含量并不低于大體型公牛，說(shuō)明雄激素很可能促進(jìn)了有別于GH/GHR-IGF1通路的其他促生長(zhǎng)通路，而影響著公牛體型大小的形成。本研究由于微型牛公牛數(shù)目太少，無(wú)法擴(kuò)大樣本量，在以后的調(diào)查研究中，繼續(xù)收集微型牛公牛樣本。另一方面，增加考察雄激素水平的檢測(cè)，了解微型牛群體中雄激素的水平。在機(jī)制方面，進(jìn)一步驗(yàn)證牛上的其他矮化位點(diǎn)。

4 結(jié) 論

始豐微型牛母牛GH含量極顯著低于正常體型天臺(tái)黃牛，GHR含量卻極顯著高于對(duì)照組，且IGF-1水平并未同步提升，說(shuō)明GH水平是影響體型大小的主要因素，始豐微型?？赡艽嬖贕H-GHR結(jié)合上的缺陷，導(dǎo)致其生長(zhǎng)發(fā)育受阻。公母牛IGF-1含量有差異，可能受性激素通路的干擾。