王鑫 買爾旦·阿不來(lái) 藺益紅 張文濤

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)多由原發(fā)病灶結(jié)核分枝桿菌血行播散所致，是一種常見的肺外結(jié)核，約占肺外結(jié)核的10%，具有較高的病亡率和致殘率，即使已接受治療，病亡率仍高達(dá)約30%[1]，且發(fā)展中國(guó)家的病亡率是發(fā)達(dá)國(guó)家的2～3倍[2]。但由于TBM起病隱匿，早期臨床表現(xiàn)及腦脊液常規(guī)和生化檢查結(jié)果不典型，導(dǎo)致其早期診斷較為困難，極易導(dǎo)致誤診、治療延遲，以致死亡率增加[3]。由于患者自身免疫功能在一定程度上影響著疾病進(jìn)展和藥物療效，故直接反映機(jī)體自身免疫功能的CD細(xì)胞水平(CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞)的變化也極有可能與TBM患者抗結(jié)核治療及免疫治療的有效性密切相關(guān)[4]。因此，筆者通過(guò)分析HIV抗體陰性TBM患者臨床分期及治療前后外周血CD細(xì)胞的變化情況，探討其與TBM患者治療轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

采用前瞻性研究的方法，選取2016年3月至2020年2月于新疆醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院就診且符合入組標(biāo)準(zhǔn)的102例TBM患者作為研究對(duì)象，包括男55例(53.9%)，女47例(46.1%)；年齡范圍為18～76歲，平均年齡為(42.06±16.05)歲；發(fā)病時(shí)間為6～25 d，平均發(fā)病時(shí)間為(16.54±3.38) d；其中，12例為單純性TBM，49例合并繼發(fā)性肺結(jié)核，41例合并血行播散性肺結(jié)核。參照英國(guó)醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)分期方法[5]，研究對(duì)象包括Ⅰ期22例、Ⅱ期37例、Ⅲ期43例。于研究對(duì)象治療前及抗結(jié)核治療2周后，檢測(cè)其外周血CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值。本研究通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，入組研究對(duì)象均簽署知情同意書。

入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合TBM診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)首次發(fā)病且入組前3個(gè)月內(nèi)未使用抗結(jié)核藥物治療；(3)腦脊液分枝桿菌培養(yǎng)或抗酸染色陽(yáng)性；(4)頭顱CT或MRI檢查發(fā)現(xiàn)腦積液、腦梗塞、腦膜炎性病變，伴或不伴局灶性神經(jīng)損傷；(5)臨床表現(xiàn)為頭痛、顱內(nèi)壓增高等。排除其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、合并其他部位感染性疾病、臨床資料不完整或中途退出、有肝腎功能衰竭史、合并惡性腫瘤，以及HIV抗體陽(yáng)性者。

二、研究方法

1.樣本采集：所有患者在入院當(dāng)日上午及抗結(jié)核治療2周后抽取外周靜脈血10 ml，加入到含有乙二胺四乙酸鉀溶液的抗凝真空試管中，送檢驗(yàn)科行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

2.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)：使用FACS Canto Ⅱ型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)外周血樣本中CD3+、CD4+、CD8+水平及CD4+/CD8+比值。使用生工生物工程(上海)股份有限公司提供的試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。操作步驟如下：分別取2.0 ml外周血樣本放入測(cè)試塑料管中，在3000 r/min下離心5 min(離心半徑10 cm)，去上清，留約10 μl管底沉淀物，分別加入三色熒光標(biāo)記(熒光標(biāo)記試劑、紅細(xì)胞裂解液及同型對(duì)照)的免洗試劑(CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP)直接熒光染色。取抗凝血1 ml，白細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)至(4.0～10.0)×109/L，在管底部加入20 μl CD3/CD4/CD8抗體和100 μl肝素抗凝血，混勻后室溫避光孵育30 min。加1×紅細(xì)胞裂解液1 ml混勻，繼續(xù)孵育15 min，上機(jī)檢測(cè)，得到相應(yīng)的T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3.臨床TBM分期和療效標(biāo)準(zhǔn)：(1)TBM分期[5]：Ⅰ期為Glasgow評(píng)分15分，即無(wú)特異性癥狀或僅有腦膜炎癥狀，無(wú)局灶性神經(jīng)系統(tǒng)體征；Ⅱ期為Glasgow評(píng)分11～14分，即并發(fā)輕度神經(jīng)功能障礙體征，意識(shí)清醒；Ⅲ期為Glasgow評(píng)分10分及以下，即出現(xiàn)昏迷、驚厥等嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙體征。評(píng)分越高，病情越輕。(2)治療療效[6]：根據(jù)患者治療后的臨床癥狀(頭痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱等)、肺部病灶、血紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)等情況將療效分為好轉(zhuǎn)(臨床癥狀改善、ESR恢復(fù)正常、腦積液檢驗(yàn)正常、胸部病灶顯著吸收>1/3、肺部空洞縮小>1/3)與惡化(未達(dá)到好轉(zhuǎn)組指標(biāo))。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、治療前后外周血CD細(xì)胞的變化

研究對(duì)象治療2周后，CD3+、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均明顯高于治療前，而治療前后CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見表1。

表1 102例結(jié)核性腦膜炎患者治療前后外周血CD細(xì)胞的變化情況

二、各臨床分期TBM患者治療前后外周血CD細(xì)胞變化的比較

治療后不同臨床分期TBM患者的CD3+、CD4+T細(xì)胞水平與CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均較治療前明顯改善。治療前和治療后不同分期TBM患者之間比較，Ⅲ期患者的CD3+、CD4+T細(xì)胞水平與CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期患者，Ⅱ期患者上述指標(biāo)水平均明顯低于Ⅰ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見表2。

表2 不同臨床分期結(jié)核性腦膜炎患者治療前后外周血CD細(xì)胞變化情況

續(xù)表2

三、不同治療轉(zhuǎn)歸患者外周血CD細(xì)胞的變化

治療2周后，病情好轉(zhuǎn)者(好轉(zhuǎn)組)有90例(88.2%)，惡化者(惡化組)有12例(11.8%)。好轉(zhuǎn)組CD3+、CD4+T細(xì)胞水平與CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均明顯高于惡化組，而CD8+T細(xì)胞水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 不同治療轉(zhuǎn)歸結(jié)核性腦膜炎患者外周血CD細(xì)胞的變化情況

討 論

TBM患者預(yù)后較差，約50%會(huì)致殘，甚至死亡[7]。TBM在初期的數(shù)天或數(shù)周內(nèi)多表現(xiàn)為非特異性癥狀，隨后頭痛、發(fā)熱及嘔吐加重[8]。若患者的Glasgow昏迷量表評(píng)分低于10分，則死亡率超過(guò)50%[9-10]，尤其是重癥TBM患者，如果不能及時(shí)調(diào)整治療方案，死亡率會(huì)明顯升高。故監(jiān)測(cè)患者CD細(xì)胞的變化有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)患者免疫狀態(tài)及評(píng)估療效，及時(shí)調(diào)整治療方案，從而改善患者預(yù)后。

早期診斷并進(jìn)行早期經(jīng)驗(yàn)性治療對(duì)TBM患者尤為重要。有研究認(rèn)為，早期診斷和治療可以明顯改善TBM的預(yù)后，但目前的實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查敏感度較差，很難及早明確診斷，其治療效果的評(píng)估也尚無(wú)具體參考，患者生存機(jī)會(huì)的提高僅能依靠臨床醫(yī)師的早期經(jīng)驗(yàn)[11]。這將使TBM的早期診治面臨極大的挑戰(zhàn)。有研究表明，結(jié)核分枝桿菌入侵機(jī)體后會(huì)造成淋巴細(xì)胞大量增殖，降低機(jī)體免疫力，引起外周血中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平發(fā)生改變[12-14]。何畏等[15]研究也進(jìn)一步表明，對(duì)于肺結(jié)核患者，隨著外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)的逐步降低，結(jié)核分枝桿菌可能更易播散至肺外；故對(duì)于TBM患者，大多數(shù)患者的外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞水平均已較低，且病程越長(zhǎng)，CD3+和CD4+T細(xì)胞水平越低，TBM越嚴(yán)重。這在一定程度上反映了TBM病情的進(jìn)展和藥物療效，為臨床是否調(diào)整治療方案、判斷預(yù)后、評(píng)估抗結(jié)核療效提供了依據(jù)。而CD4+/CD8+T細(xì)胞比值也被認(rèn)為可以作為評(píng)估TBM患者病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)[15-16]。

對(duì)于患者治療期監(jiān)測(cè)，筆者結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為TBM患者經(jīng)積極治療，一般2周內(nèi)會(huì)出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)或無(wú)效/惡化，繼而進(jìn)入慢性遷延期，此后的抗結(jié)核及免疫治療均無(wú)良好療效。又因患者經(jīng)濟(jì)、家庭條件及住院時(shí)間等的影響，大多數(shù)患者會(huì)在2周左右出院或轉(zhuǎn)回當(dāng)?shù)刂委?，造成無(wú)法追溯；加之考慮到檢驗(yàn)方式、方法、儀器等不一致因素的影響，本研究對(duì)患者治療2周后的療效進(jìn)行監(jiān)測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，本組患者在抗結(jié)核治療2周后，CD3+、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)與CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均較治療前明顯提高，而CD8+T細(xì)胞水平無(wú)明顯變化，可能與研究樣本量較少有關(guān)，也可能是TBM患者病情較重，其在發(fā)病前期已有大量CD8+T細(xì)胞參與到抗結(jié)核免疫反應(yīng)中，使其在治療前后均處于最大應(yīng)急反應(yīng)，導(dǎo)致治療前后變化不明顯，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

另一方面，治療前和治療后TBM患者CD3+、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)與CD4+/CD8+T細(xì)胞比值均呈現(xiàn)出Ⅲ期患者明顯低于Ⅱ期和Ⅰ期患者，Ⅱ期患者明顯低于Ⅰ期患者的現(xiàn)象。這提示TBM患者病情分期越高，免疫受損越嚴(yán)重，細(xì)胞免疫功能恢復(fù)越難，其治療效果和預(yù)后也就越差，這部分患者對(duì)調(diào)整治療方案的需求也就越高。從不同患者治療效果來(lái)看，病情好轉(zhuǎn)患者的CD3+、CD4+T細(xì)胞與CD4+/CD8+T細(xì)胞比值水平均明顯高于病情惡化的患者，提示CD細(xì)胞水平的降低與TBM的預(yù)后不佳密切相關(guān)。

綜上所述，TBM患者抗結(jié)核治療2周后，CD3+、CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值水平均得到明顯改善，且病情好轉(zhuǎn)的患者明顯好于病情惡化的患者，臨床分期低的患者細(xì)胞免疫功能明顯好于分期高的患者。這些結(jié)果均表明CD細(xì)胞水平與TBM的預(yù)后密切相關(guān)。因此，動(dòng)態(tài)觀察TBM患者CD細(xì)胞水平的變化，可以早期對(duì)治療進(jìn)行干預(yù)，降低死亡率，改善預(yù)后。值得注意的是，由于本研究樣本量較小，結(jié)果可能出現(xiàn)偏倚，結(jié)論有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。