徐銀娟 趙國(guó)連 崔曉利 王佩 談小文 楊珊珊 伍浩

早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是結(jié)核病的防治共識(shí)。分枝桿菌培養(yǎng)及菌種鑒定是結(jié)核病病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是確定結(jié)核病診斷和化療方案的重要依據(jù)。BACTEC MGIT 960(簡(jiǎn)稱“ MGIT 960”)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的分枝桿菌快速培養(yǎng)方法之一，但因其為進(jìn)口試劑，存在價(jià)格昂貴、培養(yǎng)成本較高的問(wèn)題，增加了結(jié)核病患者的經(jīng)濟(jì)壓力，也使得一些基層醫(yī)院無(wú)法開展此項(xiàng)工作，明顯影響了結(jié)核病的及時(shí)診治和增加了疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。因此，研發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的分枝桿菌快速培養(yǎng)方法對(duì)我國(guó)結(jié)核病防治工作意義重大。

近年來(lái)，由我國(guó)自主研發(fā)的新型改良培養(yǎng)試劑相對(duì)于進(jìn)口試劑具有價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì)，已被國(guó)內(nèi)較多實(shí)驗(yàn)室使用，但對(duì)其檢測(cè)性能的評(píng)價(jià)報(bào)道不多。因此，筆者以MGIT 960培養(yǎng)為參照標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)新型國(guó)產(chǎn)改良Middlebrook液體培養(yǎng)試劑對(duì)分枝桿菌進(jìn)行培養(yǎng)的檢測(cè)效能，為其在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的應(yīng)用推廣提供參考。

材料和方法

一、標(biāo)本采集

采集2021年3—4月西安市胸科醫(yī)院診治的疑似肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本和肺泡灌洗液標(biāo)本，對(duì)其中質(zhì)量合格的89份痰液標(biāo)本和61份肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌改良試劑(Middlebrook液體培養(yǎng)試劑)培養(yǎng)(改良試劑法)和MGIT 960培養(yǎng)。

二、試劑和儀器

1.培養(yǎng)試劑：分枝桿菌改良培養(yǎng)試劑、改良生長(zhǎng)添加劑及雜菌抑制劑均由廣東希格生物科技有限公司生產(chǎn)。MGIT 960培養(yǎng)試劑、MGIT 960生長(zhǎng)添加劑及雜菌抑制劑均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

2.鑒定試劑：采用MPB 64結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)和抗酸染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

3.自配標(biāo)本消化液：N-乙酰-L-半胱氨酸-4%氫氧化鈉(NALC)和磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=6.8)。

4.實(shí)驗(yàn)儀器：BACTECTMMGITTM960 全自動(dòng)分枝桿菌快速培養(yǎng)儀。

三、研究方法

1.肺結(jié)核診斷：參照《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[1]標(biāo)準(zhǔn)。

2.標(biāo)本處理：液化標(biāo)本，視標(biāo)本性狀加入1～2倍體積的NALC于渦旋震蕩器中震蕩1 min，使痰標(biāo)本充分均勻化，室溫靜置18 min后加入PBS，3000×g離心20 min，棄上清后加入1 ml PBS緩沖液，震蕩混勻后靜置10 min。再取0.5 ml上清液分別接種于MGIT 960 液體培養(yǎng)基和改良試劑液體培養(yǎng)基中，混勻，放入MGIT 960系統(tǒng)孵育屜中培養(yǎng)，由儀器自動(dòng)監(jiān)測(cè)并報(bào)告結(jié)果，最長(zhǎng)觀察時(shí)間為42 d。

3.結(jié)果判讀：當(dāng)MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)超過(guò)42 d仍報(bào)告陰性，且肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)，則報(bào)告為分枝桿菌陰性。當(dāng)培養(yǎng)系統(tǒng)報(bào)告為陽(yáng)性時(shí)，則使用涂片抗酸染色進(jìn)一步確認(rèn)，若僅發(fā)現(xiàn)抗酸染色陰性菌，則報(bào)告為培養(yǎng)陰性，且將該培養(yǎng)管登記為“污染”管；若未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌則報(bào)告為陰性；若發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌，再使用MBP64抗原檢測(cè)試劑(膠體金法)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌鑒定。

4.觀察指標(biāo)：記錄兩種方法培養(yǎng)陽(yáng)性數(shù)、污染數(shù)和報(bào)陽(yáng)時(shí)間(d)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用“百分率(%)”描述，組間差異的比較采用McNemar配對(duì)χ2檢驗(yàn)，檢測(cè)效能采用Kappa檢驗(yàn)。計(jì)量資料呈偏態(tài)分布，采用“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”描述，組間差異的比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較改良試劑法和MGIT 960培養(yǎng)法檢測(cè)分枝桿菌的陽(yáng)性率、污染率和報(bào)陽(yáng)時(shí)間的差異，并以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)改良試劑法的檢測(cè)效能。評(píng)價(jià)指標(biāo)：敏感度(%)=真陽(yáng)性份數(shù)/(真陽(yáng)性份數(shù)+假陰性份數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性份數(shù)/(真陰性份數(shù)+假陽(yáng)性份數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(%)=真陽(yáng)性份數(shù)/(真陽(yáng)性份數(shù)+假陽(yáng)性份數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值(%)=真陰性份數(shù)/(真陰性份數(shù)+假陰性份數(shù))×100%，陽(yáng)性似然比=敏感度/(1-特異度)，陰性似然比=(1-敏感度)/特異度。一致性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：Kappa值≤0.40時(shí)，表明一致性較差；0.400.80時(shí)，表明一致性好。

結(jié) 果

一、兩種分枝桿菌培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果

改良試劑法檢測(cè)痰液和肺泡灌洗液結(jié)核分枝桿菌的總陽(yáng)性率和各自陽(yáng)性率，以及總報(bào)陽(yáng)時(shí)間和各自報(bào)陽(yáng)時(shí)間與MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種方法檢測(cè)灌洗液標(biāo)本均無(wú)污染出現(xiàn)，但改良試劑法檢測(cè)痰液標(biāo)本的污染率(12.4%)明顯高于MGIT 960(4.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 兩種培養(yǎng)法檢測(cè)兩種標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性與污染情況

二、改良試劑法的檢測(cè)效能

以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，改良試劑法檢測(cè)痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的效能見表2。兩種方法進(jìn)行培養(yǎng)的一致性好，其中檢測(cè)痰液標(biāo)本的Kappa值為0.907，檢測(cè)肺泡灌洗液標(biāo)本的Kappa值為0.902。

表2 改良試劑法以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)對(duì)痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)效能

三、兩種液體培養(yǎng)基成本情況

改良培養(yǎng)試劑的成本為(49.6±10.5)元/份，MGIT 960試劑成本為(75.4±15.8)元/份，前者培養(yǎng)試劑的價(jià)格僅約為后者的60%。

討 論

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)診斷方法的發(fā)展，結(jié)核病的診斷時(shí)間被大大縮短，但是分枝桿菌培養(yǎng)對(duì)于表型藥物敏感性試驗(yàn)及涂片陰性結(jié)核病患者的檢測(cè)依然必不可少[2]。目前，分枝桿菌MGIT 960液體培養(yǎng)因其全自動(dòng)化結(jié)果判讀系統(tǒng)準(zhǔn)確度高、能夠增加實(shí)驗(yàn)室周轉(zhuǎn)速度而被推薦為結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn)[3]，但其液體培養(yǎng)試劑培養(yǎng)管(美國(guó)BD公司)和另一種常用Bac T/Alert 3D培養(yǎng)管(法國(guó)生物梅里埃公司)均為國(guó)外研發(fā)產(chǎn)品，存在價(jià)格昂貴、運(yùn)輸不便等問(wèn)題，嚴(yán)重消耗著我國(guó)的醫(yī)療衛(wèi)生資源。這也為我國(guó)自主研發(fā)的新型改良分枝桿菌液體培養(yǎng)試劑(Middlebrook液體培養(yǎng)試劑)提供了應(yīng)用空間。該試劑現(xiàn)已被多家機(jī)構(gòu)使用，其價(jià)格低廉、便于運(yùn)輸，具有良好的應(yīng)用價(jià)值，但與MGIT 960培養(yǎng)相比較，尚缺乏臨床數(shù)據(jù)的對(duì)比研究。

本研究使用150份痰液和肺泡灌洗液臨床標(biāo)本，經(jīng)過(guò)統(tǒng)一的前處理方法，將標(biāo)本混懸液按照相同量分別加入到兩種培養(yǎng)試劑中進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，改良培養(yǎng)試劑法與MGIT 960培養(yǎng)對(duì)兩種標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)陽(yáng)性率無(wú)明顯差異，說(shuō)明改良試劑法對(duì)結(jié)核分枝桿菌的檢出能力與MGIT 960培養(yǎng)不相上下；進(jìn)一步參考楊順利等[4]對(duì)MGIT 960、Bac T/ALERT 3D和改良羅氏培養(yǎng)方法檢測(cè)痰標(biāo)本的陽(yáng)性率結(jié)果(分別為45.34%、42.27%和40.11%)，可以認(rèn)為本研究國(guó)產(chǎn)改良培養(yǎng)試劑對(duì)分枝桿菌的檢出能力要優(yōu)于其他類型的培養(yǎng)試劑。同時(shí)，改良培養(yǎng)試劑檢測(cè)痰液和肺泡灌洗液的報(bào)陽(yáng)時(shí)間也與MGIT 960培養(yǎng)的結(jié)果相差無(wú)幾，進(jìn)一步參考陳軍等[5]對(duì)BACTE MGIT 960、Bac T/ALERT 3D和羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)痰標(biāo)本的報(bào)陽(yáng)時(shí)間[分別為(14±7) d，(19±6) d和(26±7) d]的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MGIT 960培養(yǎng)的報(bào)陽(yáng)時(shí)間最短，故可以認(rèn)為改良培養(yǎng)試劑在報(bào)陽(yáng)時(shí)間方面不劣于MGIT 960和其他培養(yǎng)試劑。

在痰液標(biāo)本檢測(cè)污染率方面，改良試劑法明顯高于MGIT 960培養(yǎng)，也高于我國(guó)《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]要求的6%。筆者認(rèn)為有以下原因：首先，可能與改良培養(yǎng)試劑中的雜菌抑制劑組分與MGIT 960試劑中的組分存在差異有關(guān)。盡管筆者在配制改良培養(yǎng)試劑時(shí)，盡量將營(yíng)養(yǎng)添加劑和雜菌抑制劑所含成分與MGIT 960培養(yǎng)試劑相一致，但仍可能出現(xiàn)一定的差異，導(dǎo)致其對(duì)痰液標(biāo)本中常見菌群的抑制作用有所差別。其次，也可能與接種操作引起的系統(tǒng)誤差有關(guān)，即向培養(yǎng)基接種標(biāo)本懸液時(shí)先吸取0.5 ml加入BD管，再吸取0.5 ml加入改良管，有可能將含雜菌較多的沉渣帶入到改良管中，增加其污染率[7]。但兩種培養(yǎng)基對(duì)肺泡灌洗液報(bào)告陽(yáng)性的所有培養(yǎng)管均無(wú)污染，這可能與4%NALC處理液和雜菌抑制劑的雙重作用可使肺泡灌洗液標(biāo)本中的雜菌生長(zhǎng)受限，降低了污染風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)；也可能與下呼吸道感染較少、肺泡灌洗液標(biāo)本采集無(wú)菌化有關(guān)[8]。這些都提示，可以通過(guò)改善操作、接種時(shí)減少沉渣帶入、改變標(biāo)本前處理消化液中NaOH濃度[9]來(lái)降低污染率。盡管本款改良試劑對(duì)痰液標(biāo)本的高污染率沒(méi)有降低其陽(yáng)性檢出率，但按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程的要求，所有污染標(biāo)本均需進(jìn)行重處理，這將會(huì)增加試劑成本和日常工作量，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。

以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，改良試劑法檢測(cè)的敏感度和特異度均高于90%，說(shuō)明該方法診斷效能高，且與MGIT 960培養(yǎng)的診斷一致性好，Kappa值為0.905。而在價(jià)格方面，國(guó)產(chǎn)改良培養(yǎng)試劑有著明顯優(yōu)勢(shì)，其成本僅約為MGIT 960試劑的60%。這些均為改良培養(yǎng)試劑的廣泛應(yīng)用提供了有力支撐。但目前改良培養(yǎng)試劑尚缺乏對(duì)其他類型標(biāo)本(如組織、腦脊液、胸腹腔積液等)的培養(yǎng)結(jié)果，也不明確是否會(huì)影響一些以分枝桿菌培養(yǎng)為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如熔解曲線、GeneXpert MTB/RIF及藥物敏感性試驗(yàn)等，這些均有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，改良試劑法檢測(cè)痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的陽(yáng)性率及報(bào)陽(yáng)時(shí)間與MGIT 960培養(yǎng)無(wú)差異，診斷一致性好，且價(jià)格較低，可用于結(jié)核病患者痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本的培養(yǎng)，但應(yīng)注意痰液標(biāo)本檢測(cè)污染率較高的問(wèn)題。本研究為單中心研究，比對(duì)標(biāo)本份數(shù)有限，且僅分析了痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本的培養(yǎng)結(jié)果，可能降低結(jié)果的代表性，還需要多中心大樣本的研究。