黃蕭天,巴特,魏丕偉*,王凌云,何發(fā)明,王江林
四川輕化工大學(xué)(宜賓 644000)
枳椇(Hovenia dulcis)為鼠李科拐棗屬落葉喬木[1],始載于《唐本草》,別名拐棗、龍爪、雞爪果、萬(wàn)壽果等,被國(guó)家衛(wèi)計(jì)委列入食藥兩用中藥名單。主要分布在四川、廣西、湖北、廣東、貴州等省份[2]。枳椇成熟的肉質(zhì)果梗中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì),主要包括生物堿、活性黃酮類物質(zhì)、三萜皂苷類、苯丙素類、多糖等[3-5];因此枳椇也含有很多功效,如減肥降脂[6]、保肝解酒[7]、抗腫瘤[8]、增加免疫力與抗疲勞[9]等,是一種極具開(kāi)發(fā)利用的植物資源,經(jīng)過(guò)發(fā)酵制成的枳椇果酒也繼承了枳椇其豐富的營(yíng)養(yǎng)和獨(dú)特的風(fēng)味,具有良好的藥用價(jià)值與市場(chǎng)價(jià)值。
由于枳椇本身含有較多的蛋白質(zhì)、果膠、色素等[10]物質(zhì)以及受生產(chǎn)工藝條件的影響,枳椇果酒在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)渾濁、失光等現(xiàn)象,嚴(yán)重影響枳椇果酒的品質(zhì)。因此為提高枳椇酒的品質(zhì)、延長(zhǎng)其貨架期、增強(qiáng)其穩(wěn)定性,需對(duì)枳椇果酒進(jìn)行澄清工藝優(yōu)化及穩(wěn)定性檢測(cè)。試驗(yàn)選取明膠、皂土、殼聚糖、硅藻土、果膠酶5種澄清劑,進(jìn)行單因素澄清試驗(yàn),并選擇3款最佳的澄清劑進(jìn)行正交試驗(yàn),得出最佳復(fù)合澄清劑配比,結(jié)合穩(wěn)定性試驗(yàn),確定合理有效的澄清方法,以期為枳椇酒的生產(chǎn)加工提供理論依據(jù)。
枳椇干果(產(chǎn)地湖北黃岡);釀酒酵母(安琪葡萄酒酵母);明膠(成都金山化學(xué)試劑有限公司);皂土(上海試四赫維化工有限公司);果膠酶(法國(guó)LAIFEMAND公司);殼聚糖(鄭州萬(wàn)博食品配料有限公司);殼聚糖(鄭州萬(wàn)博食品配料有限公司);硅藻土(成都科龍化工試劑廠);蘆?。ê戏什┟郎萍加邢挢?zé)任公司);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
UV-5500PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);HS-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);FA2204N電子天平(常州市衡正電子儀器有限公司);GZ-250-HSII恒溫培養(yǎng)箱(韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司)。
1.3.1 枳椇果酒的發(fā)酵工藝流程
枳椇→烘干→研磨→加水混勻→偏重硫酸鉀處理→超聲波微處理→酶解→45 ℃水浴恒溫2 h→調(diào)pH 5.0→調(diào)糖度20%→發(fā)酵→澄清→過(guò)濾→成品→檢測(cè)
1.3.2 理化指標(biāo)的測(cè)定
1.3.2.1 酒精度
按照GB 5009.225—2006[11]規(guī)定的方法測(cè)定。
1.3.2.2 黃酮質(zhì)量濃度
1) 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定
蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:精密稱取蘆丁對(duì)照品19.5 mg,加入蒸餾水定容至100 mL。取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0和6.0 mL分別放置在25 mL試管中,加入30%乙醇溶液至6.0 mL,分別加入5%NaNO2的溶液和10%的Al(NO3)3溶液各1 mL,分別加入4% NaOH溶液10 mL。搖勻,靜置6 min,用空白溶液(蒸餾水)做參照。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度A,以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2) 枳椇果酒黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定
以1 mL枳椇果酒代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液,并按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算黃酮質(zhì)量濃度。
1.3.3 澄清度波長(zhǎng)的選定
采用全波段掃描的方式,在400~800 nm下進(jìn)行掃描,選擇最低吸光度下對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)。
1.3.4 澄清劑的配制1%明膠溶液[12]、1%硅藻土溶液[13]、10%皂土溶液[14]、1%殼聚糖溶液[15]、1%果膠酶溶液[16]。
1.3.5 單因素試驗(yàn)
取10 mL發(fā)酵7 d的枳椇果酒于試管中,分別按表1試驗(yàn)方案加入澄清劑,迅速震蕩搖勻,室溫靜置48 d,取上清液,在最佳波長(zhǎng)下,測(cè)其透光率,并且按照1.3.2的方法,測(cè)定枳椇果酒中黃酮質(zhì)量濃度。
表1 5種澄清劑單因素試驗(yàn)水平
1.3.6 正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選取3種澄清效果最佳的澄清劑,在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用三因素三水平的正交試驗(yàn),確定復(fù)合澄清劑的最佳配比,并取最適配比做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn),驗(yàn)證其可行性。
1.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)
根據(jù)澄清試驗(yàn)結(jié)果,選取最佳澄清工藝處理果酒,并取上清液做穩(wěn)定性試驗(yàn),包括蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、鐵穩(wěn)定性、銅穩(wěn)定性、氧化穩(wěn)定性、生物穩(wěn)定性[17-20]。
2.1.1 枳椇果酒黃酮質(zhì)量濃度
由1.3.2得到線性回歸方程為y=9.808 2x-0.004 2,R=0.999 5。結(jié)果表明,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在0.00~6.08 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,并測(cè)得枳椇果酒在510 nm下的吸光度為0.14,根據(jù)該方程,可以算出枳椇果酒中黃酮質(zhì)量濃度為14.70 mg/L。
對(duì)枳椇果酒進(jìn)行400~800 nm的波段掃描,隨著波長(zhǎng)增加,吸光度逐漸減小直至平衡,波長(zhǎng)為680 nm時(shí),吸光度達(dá)到最低,此時(shí)的透光率最大,因此,選用680 nm作為枳椇果酒最佳澄清波長(zhǎng)。與之相對(duì)應(yīng)的吸光度為0.103,此時(shí)的透光率為78.8%。
2.3.1 明膠添加量對(duì)枳椇果酒澄清效果的影響
明膠作為果酒常用澄清劑,可結(jié)合中單寧并吸附其他雜質(zhì)形成沉淀[21]。由圖2所示,在明膠添加量范圍內(nèi),透光率呈先上升后下降趨勢(shì),添加量5.0 g/L時(shí),透光率達(dá)到最大值64.60%。隨添加量增大,透光率明顯下降,可能是由于酒中單寧含量過(guò)少,過(guò)量的明膠本身就會(huì)形成懸浮物,導(dǎo)致澄清度下降[22]。但最佳透光率64.60%顯著低于枳椇果酒原來(lái)的透光率78.8%,因此不采用明膠澄清枳椇果酒。
圖2 明膠添加量對(duì)枳椇果酒澄清效果的影響
2.3.2 硅藻土添加量對(duì)枳椇果酒澄清效果的影響
硅藻土是一種生物成因的硅質(zhì)沉積巖,由于其結(jié)構(gòu)的特殊性,賦予它強(qiáng)力的吸附性;同時(shí),它還可以吸附部分的果膠、色素、酵母等其他固體懸浮物,從而達(dá)到澄清原酒的目的[23]。由圖3可知,在硅藻土添加量范圍內(nèi),透光呈先上升后下降再趨于穩(wěn)定趨勢(shì),另外,黃酮質(zhì)量濃度呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì),硅藻土添加量0.2 g/L時(shí),透光率達(dá)到最大值88.03%,黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到最大值為8.51 mg/L。因此,取硅藻土添加量0.2 g/L時(shí),進(jìn)行靜置試驗(yàn)。
圖3 硅藻土添加量對(duì)枳椇果酒澄清效果的影響
新發(fā)酵的酒,由于酒石酸鹽沉淀、色素沉淀、金屬破敗、微生物混濁等[24]因素。澄清度變化較大,因此需要對(duì)澄清后的枳椇酒進(jìn)一步檢測(cè)其不同儲(chǔ)存時(shí)間的透光度及黃酮質(zhì)量濃度變化。由圖4可知,將硅藻土添加量0.2 g/L的枳椇酒進(jìn)行不同時(shí)間的靜置處理,在靜置時(shí)間1~5 d范圍內(nèi),透光率緩慢下降,說(shuō)明硅藻土能在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到最佳澄清效果,但可能還有生物與非生物因素的影響,影響枳椇酒的長(zhǎng)期儲(chǔ)存。另外,黃酮質(zhì)量濃度呈先上升后減少再趨于穩(wěn)定趨勢(shì),靜置2 d時(shí),枳椇果酒中黃酮質(zhì)量濃度最高為9.63 mg/L。因此,最佳硅藻土添加量0.2 g/L、靜置時(shí)間2 d,此時(shí)透光率為86.73%,黃酮質(zhì)量濃度為9.63 mg/L。
圖4 靜置時(shí)間對(duì)枳椇果酒澄清的影響
2.3.3 皂土添加量對(duì)枳椇果酒澄清效果的影響
皂土吸水膨脹后形成膠體懸浮液,顆粒帶負(fù)電,吸附酒液中帶正電荷的蛋白質(zhì),形成絮狀沉淀,從而使酒液澄清[23]。由圖5可知,在皂土添加量范圍內(nèi),透光率呈先上升后下降再趨于穩(wěn)定趨勢(shì),皂土添加量4.0 g/L時(shí),澄清效果達(dá)到最佳,透光率達(dá)到87.10%,添加量超過(guò)4.0 g/L時(shí),透光率逐漸降低,可能是因?yàn)檫^(guò)量的皂土?xí)?dǎo)致下膠過(guò)量,引起酒體渾濁,同時(shí)影響酒體口感。另外,黃酮質(zhì)量濃度呈先上升再趨于穩(wěn)定趨勢(shì),添加量4.0 g/L時(shí),黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到最大,為7.80 mg/L。因此,取皂土添加量4 g/L時(shí),進(jìn)行靜置試驗(yàn)。
圖5 皂土添加量對(duì)枳椇果酒澄清效果的影響
由圖6可以知道,在靜置時(shí)間1~5 d范圍內(nèi),由透光率呈上升后下降趨勢(shì),靜置2 d時(shí),透光率達(dá)到最大值,為89.30%,之后緩慢下降,另外,黃酮質(zhì)量濃度呈下降再緩慢回升趨勢(shì),兩者可能是酒體依然存在穩(wěn)定性不好的原因。因此,最佳皂土用量4 g/L、靜置時(shí)間2 d,此時(shí)透光率達(dá)到89.30%,黃酮質(zhì)量濃度為8.68 g/mL。
圖6 靜置時(shí)間對(duì)枳椇果酒澄清的影響
2.3.4 果膠酶添加量對(duì)枳椇果酒澄清效果的影響
果膠酶又稱聚半乳糖醛酸水解酶,是分解果膠的一種復(fù)合物質(zhì),能夠提高果蔬的出汁率、降低粘度,具有提高果汁、果酒澄清度的作用[25],由圖7可所示,在果膠酶添加量范圍內(nèi),透光率呈先上升后緩慢下降的趨勢(shì),果膠酶添加量達(dá)到0.04 g/L時(shí),透光率達(dá)到最大值85.20%,添加量超過(guò)0.04 g/L時(shí),透光率呈緩慢下降趨勢(shì)。可能是果膠酶添加量過(guò)多,酶蛋白又會(huì)使果汁產(chǎn)生混濁現(xiàn)象,造成透光率下降[25]。另外,黃酮質(zhì)量濃度呈先上升后下降再趨于穩(wěn)定趨勢(shì),果膠酶質(zhì)量濃度0.04 g/L時(shí),黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到最大8.92 mg/L,其后,黃酮質(zhì)量濃度降低,可能是果膠酶過(guò)量添加,吸附了干浸出物,使黃酮質(zhì)量濃度降低。因此,取果膠酶添加量0.04 g/L時(shí),進(jìn)行靜置試驗(yàn)。
圖7 果膠酶添加量的對(duì)枳椇果酒澄清效果的影響
由圖8可知:在靜置時(shí)間1~5 d范圍內(nèi),透光率呈上升后下降趨勢(shì),靜置2 d時(shí),透光率達(dá)到最大值,為85.20%,與靜置1 d時(shí)的透光率84.03%相差不大,可能需要充分的時(shí)間才能分解掉酒體中的果膠;2 d后的透光率的緩慢下降,可能是因?yàn)榫企w沒(méi)有足夠的穩(wěn)定性。另外,黃酮質(zhì)量濃度呈下降再趨于穩(wěn)定趨勢(shì),靜置3 d時(shí),達(dá)到最低值8.62 mg/L,之后酒體趨于穩(wěn)定。因此,最佳果膠酶用量0.04 g/L、澄清時(shí)間1 d,此時(shí)透光率達(dá)到84.03%。黃酮質(zhì)量濃度為10.92 mg/L。
圖8 靜置時(shí)間對(duì)枳椇果酒澄清的影響
2.3.5 殼聚糖添加量對(duì)枳椇果酒澄清效果的影響
殼聚糖是一種高分子聚合物,在微酸環(huán)境下,易被電子化,與氫離子、氨基結(jié)合形成帶有正電荷的分子,賦予其較強(qiáng)的吸附性,是一種典型的陽(yáng)離子型絮凝劑[26]。由圖9可知,殼聚糖添加量范圍內(nèi),透光率呈先上升后下降趨勢(shì)。殼聚糖質(zhì)量濃度0.4 g/L時(shí),透光率達(dá)到最大值為90.23%,隨著添加量繼續(xù)增加,透光率減少,其原因可能是過(guò)量的殼聚糖會(huì)包裹微粒,影響架橋作用。與此同時(shí),膠體表面還會(huì)產(chǎn)生二次吸附作用,影響澄清作用的持久性,吸附過(guò)多的有效成分,影響口感[26]。另外,黃酮質(zhì)量濃度呈先上升后下降再趨于穩(wěn)定趨勢(shì),殼聚糖添加量0.4 g/L時(shí),黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到最大,為10.31 mg/L,因此,取殼聚糖質(zhì)量濃度0.4 g/L時(shí),進(jìn)行靜置試驗(yàn)。
圖9 殼聚糖添加量對(duì)枳椇果酒澄清效果的影響
由圖10可知:在靜置時(shí)間1~5 d范圍內(nèi)時(shí),透光率呈上升后下降趨勢(shì),靜置2 d時(shí),透光率達(dá)到最大值為91.00%,其后,透光率的下降可能是因?yàn)槟z體表面還會(huì)產(chǎn)生二次吸附作用,進(jìn)而影響微粒的穩(wěn)定,影響澄清作用的持久性[26];在靜置時(shí)間1~5 d范圍內(nèi),黃酮質(zhì)量濃度先上升再下降后趨于穩(wěn)定,在靜置時(shí)間2 d時(shí),達(dá)到最大值為10.02 mg/L,2 d后的下降可能是殼聚糖膠體充分地接觸,在靜置時(shí)間3 d時(shí),達(dá)到最小值為8.24 mg/L。因此,最佳殼聚糖添加量0.4 g/L、澄清時(shí)間2 d,此時(shí)的透光率為91.00%,黃酮質(zhì)量濃度為10.02 mg/L。
圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程
圖10 靜置時(shí)間對(duì)枳椇果酒澄清的影響
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果綜合分析,硅藻土、皂土、果膠酶和殼聚糖對(duì)枳椇酒的澄清有明顯效果,其中殼聚糖透光率為91.0%,黃酮質(zhì)量濃度為10.02 mg/L,澄清效果最佳;其次皂土透光率為89.30%,黃酮質(zhì)量濃度為8.68 mg/L,透光率與澄清效果良好;硅藻土透光率為86.37%,黃酮質(zhì)量濃度為9.63 mg/mL,澄清效果次之,但黃酮質(zhì)量濃度較高;果膠酶透光率為84.03%,黃酮質(zhì)量濃度為10.92 mg/mL,雖然黃酮質(zhì)量濃度較高,但透光率較低,澄清效果相比一般;故選擇硅藻土、皂土和殼聚糖三者為最終的復(fù)合澄清劑。同時(shí)結(jié)合靜置試驗(yàn),確定靜置時(shí)間為2 d。
以透光率和黃酮質(zhì)量濃度為指標(biāo),比較皂土、硅藻土和殼聚糖在最佳添加量下對(duì)枳椇果酒的澄清效果。由正交試驗(yàn)結(jié)果可以得出影響透光率的主次因素A>C>B,即皂土>殼聚糖>硅藻土,優(yōu)水平為A3B1C1;同理,影響黃酮質(zhì)量濃度的主次因素C>B>A,即殼聚糖>硅藻土>皂土,優(yōu)水平為A2B1C2;由表3可知不同組合下,黃酮質(zhì)量濃度的變化并不顯著,因此,以透光率為主要指標(biāo),及A3B1C1組合為最佳試驗(yàn)組合,即皂土添加量6.0 g/L、殼聚糖添加量0.1 g/L、硅藻土添加量0.2 g/L。
表3 復(fù)合澄清劑澄清工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析
對(duì)最佳處理?xiàng)l件A3B1C1進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),以確定枳椇果酒澄清工藝的最佳方案。在復(fù)合澄清劑的處理下,取3次生物學(xué)重復(fù),枳椇果酒透光率為92.60%,高于正交試驗(yàn)結(jié)果中最高透光率92.30%,其黃酮質(zhì)量濃度為11.30 mg/L。
表2 澄清工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平 單位:g/L
果酒穩(wěn)定性主要受生物穩(wěn)定性與非生物穩(wěn)定性的影響,生物穩(wěn)定性主要包括蛋白質(zhì)與微生物等有機(jī)成分的影響,非生物穩(wěn)定性主要包括氧破敗、鐵破敗、銅破敗等影響[27]。取澄清工藝優(yōu)化后的枳椇果酒的上清液做穩(wěn)定性試驗(yàn)。
2.6.1 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性
通過(guò)單寧-加熱法試驗(yàn)觀察,對(duì)比酒體前后的差異,有沒(méi)有絮凝性沉淀。結(jié)果表明,澄清處理后的枳椇果酒沒(méi)有產(chǎn)生沉淀,少量的蛋白質(zhì)不足以發(fā)生蛋白質(zhì)破敗,其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性良好。
2.6.2 鐵穩(wěn)定性
果酒中的鐵一般以還原態(tài)的形式存在,但Fe3+極易與果酒中的某些成分如色素,單寧,磷酸鹽等結(jié)合產(chǎn)生不溶性沉淀[28]。結(jié)果表明,枳椇果酒沒(méi)有出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,且測(cè)得鐵含量為4 mg/L,果酒中鐵含量低于8 mg/L時(shí),果酒就不會(huì)發(fā)生鐵破敗病[29],證明其鐵穩(wěn)定性良好。
2.6.3 銅穩(wěn)定性
果酒中的銅易被還原成亞銅,形成難溶性化合物,在光照下亞硫酸將胱氨酸還原為半胱氨酸,然后半胱氨酸與銅生成不溶解的絡(luò)合物。試驗(yàn)測(cè)得銅含量0.3 mg/L,小于0.8 mg/L,沒(méi)有發(fā)生銅破敗[29],證明其銅穩(wěn)定性良好。
2.6.4 氧化穩(wěn)定性
放置24 h后的枳椇果酒與原枳椇果酒相比,色澤沒(méi)有明顯變化,亦沒(méi)有出現(xiàn)沉淀以及渾濁的現(xiàn)象。同時(shí)測(cè)得枳椇果酒中游離的二氧化硫的含量為34.53 mg/L。質(zhì)量濃度在30~50 mg/L[27]中,不會(huì)導(dǎo)致明顯的銅破敗和鐵破敗,所以枳椇果酒的氧化穩(wěn)定性好。
2.6.5 生物穩(wěn)定性
由于微生物對(duì)酒組成成分的代謝作用,會(huì)破壞酒的膠體平衡,導(dǎo)致酒體渾濁或沉淀生成[29]。在30 ℃恒溫箱中放置10 d的酒樣和原酒相比,沒(méi)有發(fā)生渾濁現(xiàn)象,沒(méi)有受到其他病菌的污染,說(shuō)明枳椇果酒的生物穩(wěn)定性較好。
通過(guò)使用明膠、硅藻土、殼聚糖、果膠酶、皂土5種澄清劑對(duì)枳椇果酒進(jìn)行澄清試驗(yàn),以透光率和黃酮質(zhì)量濃度為指標(biāo),同時(shí)對(duì)澄清后的枳椇果酒進(jìn)行靜置試驗(yàn),篩選出3種對(duì)枳椇果酒澄清效果較好的澄清劑:皂土、硅藻土和殼聚糖。正交試驗(yàn)優(yōu)化其配比后,復(fù)合澄清劑最佳配比為:皂土6 g/L,硅藻土0.1 g/L、殼聚糖0.4 g/L。通過(guò)驗(yàn)證性試驗(yàn),證明在最佳復(fù)合澄清劑配比下,靜置時(shí)間為2 d,其透光率達(dá)到92.6%,黃酮質(zhì)量濃度為1.13 mg/L,整體優(yōu)于單一澄清劑的澄清效果。
通過(guò)對(duì)處理后的枳椇果酒進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn),澄清后的枳椇酒擁有有良好的穩(wěn)定性。其中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與生物穩(wěn)定性良好,沒(méi)有絮凝性沉淀;同時(shí),酒體中鐵離子質(zhì)量濃度為4.0 mg/L,銅離子質(zhì)量濃度為0.3 mg/L,SO2質(zhì)量濃度為34.53 mg/L,均在合理范圍內(nèi),不會(huì)發(fā)生明顯的銅破敗與鐵破敗,氧化穩(wěn)定性良好。此復(fù)合澄清劑整體澄清效果良好,澄清后的枳椇果酒穩(wěn)定性高。由于澄清劑不同的澄清性質(zhì)及酒類的不同,復(fù)合澄清劑的澄清效果總體要優(yōu)于單一澄清劑,該試驗(yàn)為枳椇果酒的生產(chǎn)與加工奠定理論基礎(chǔ) 。