尚婧曄，張光葭，丹巴澤里，王 奇，喻文杰，何 偉，廖 沙，沈蕓舟，黃 燕*，王 謙，鐘 波，劉 陽*

(1.四川省疾病預防控制中心，成都 610041；2.甘孜藏族自治州州疾病預防控制中心，康定 626099；3.涼山彝族自治州疾病預防控制中心，西昌 615000)

犬科動物是棘球絳蟲的主要終末宿主和傳染源。了解犬科動物感染蟲種及其感染水平，可以明確不同終末宿主在棘球蚴病傳播中所起作用和風險程度，為棘球絳蟲終末宿主的防控提供重要的策略依據。由于樣本獲取困難、檢測方法有限，長期以來，包括流浪犬在內的棘球絳蟲野外終宿主感染水平的調查始終是一個棘手的問題。出于對野生動物保護和食肉動物危險性的考慮，早期采用的捕殺剖檢或藥物導泄收集蟲體的方法已經不再適用。非損傷性采樣的糞樣檢測是目前最具有操作性的方法。與家犬不同，野外動物糞樣為野外撿拾，來源并不明確。不同動物糞便雖然具有一定的外觀形態(tài)特征，但單憑眼觀鑒別其來源，仍可能出現(xiàn)偏差。簡單進行病原檢測而不對樣本來源進行準確辨識，很可能會因為納入其他非目標宿主樣本而造成檢測陽性率遠低于實際感染率，或掩蓋單一宿主的高感染率，難以保證結果的準確性。因此，利用分子生物學方法進行樣本的溯源極為重要。

目前，國內棘球絳蟲終末宿主種類分子鑒別的研究不多，且主要集中于單一屬內物種的鑒別[1-2]。線粒體DNA(mtDNA)因具有多拷貝、變異快、缺乏重組、分子量小等特點，被廣泛應用于各種動、植物的分子鑒定和分類，已證實對多種哺乳動物具有良好的區(qū)分效果[3-6]。本研究以采集自棘球絳蟲高流行區(qū)野外環(huán)境中的犬科動物糞便為樣本，以mtDNA控制區(qū)(D-loop)基因為分子標記，對不同犬科動物同源序列進行比對分析，探索mtDNA D-loop高變區(qū)序列用于棘球絳蟲主要終末宿主鑒別的可能性，同時，通過糞-抗原檢測，對樣本棘球絳蟲感染情況進行調查。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本研究檢測糞樣101份，于2016年采集自甘孜州石渠縣真達、呷依、格孟3鄉(xiāng)的野外環(huán)境，包括居民定居點周圍和狐貍、狼等棘球絳蟲野外終末宿主洞穴口及經常出沒的區(qū)域。根據糞樣外觀形態(tài)和采集地點，對糞樣來源宿主種類進行初步鑒定，將采集的樣本分為3組：1)疑似狼糞樣32份，主要采自狼洞口和高山、半高山牛、羊、藏原羚等大型哺乳動物活動較多的地方，糞便較粗長，顏色泛白，帶有少量動物長毛發(fā)和較多、較大的動物骨頭；2)疑似狐糞樣30份，主要采自狐洞口和半高山、沿河高原草甸高原鼠兔、青海田鼠等小型哺乳動物活動頻繁的地區(qū)，糞便較細長，呈灰黑色，帶有較多動物短毛發(fā)；3)疑似犬糞樣本39份，主要采自定居點周邊高原鼠兔、青海田鼠等小型哺乳動物活動較多的地區(qū)，糞便粗細、長短多介于狼和狐之間，呈棕黑或灰黑色，帶有動物短毛發(fā)。

所有樣本于-80 ℃冷凍保存1個月以上，以滅活蟲卵。

1.2 主要試劑和儀器

主要使用試劑包括QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen,Germany)，GoTaq G2 Hot Start Master Mixes(Promega,USA)，犬糞包蟲抗原檢測試劑盒(深圳市康百得生物科技有限公司，中國)。主要使用儀器包括AB2720 PCR儀(Applied Biosystems，USA)，電泳儀(BioRad，USA)，凝膠成像儀(BioRad，USA)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠，中國)。

1.3 基因組DNA提取

參考文獻[1]方法對糞樣中可能存在的宿主腸道脫落組織、細胞碎片等進行富集處理后，按照糞便DNA提取試劑盒操作說明提取糞樣基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 宿主物種鑒別

1.4.1 PCR擴增和測序 參考文獻[7]合成用以擴增哺乳動物mtDNA D-loop區(qū)的通用引物L15995：5′ -CTCCACTATCAGCACCCAAAG-3′，H16498：5′-CCTGAAGTAAGAACCAGATG-3′。PCR反應體積為25 μL，包含1×GoTaq G2 Hot Start Master Mixes，上下游引物0.4 μmol·L-1，DNA模板20～50 ng。擴增條件為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送擎科生物技術公司進行雙向測序。

1.4.2 序列分析 所獲序列經DNAStar軟件進行自動雙向拼接并加以適當手動調整后，采用ClustalX2軟件[8]進行多重比對。使用DnaSP5軟件[9]分析序列單倍型與變異位點。將單倍型序列與Genbank數(shù)據庫中已發(fā)表物種序列進行BLAST比對。利用MEGA7軟件[10]計算基于Kimura-2-parameter模型(K2P)的遺傳距離，同時以小家鼠(Musmusculus)為外群，采用最大似然法(Maximum Likehood，ML)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 棘球絳蟲抗原檢測

1.5.1 糞-抗原檢測 糞樣經適當搗碎處理后，按照犬糞包蟲抗原檢測試劑盒操作說明，采用ELISA夾心法對糞樣中棘球絳蟲抗原進行檢測。

1.5.2 數(shù)據處理 采用EXCEL軟件對數(shù)據進行整理，采用SPSS軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析，使用χ2檢驗對不同來源樣本棘球絳蟲抗原陽性率差異進行比較。

2 結 果

2.1 宿主物種鑒別

2.1.1 PCR擴增結果 提取的101份糞樣DNA中有74份擴增出目的條帶，PCR產物電泳結果顯示在350～400 bp出現(xiàn)清晰的單一條帶，擴增產物可用于后續(xù)測序分析，樣本檢測成功率為73.27%(圖1)。

2.1.2 序列變異與單倍型分析 所獲74條序列經比對、剪切后，最終整理為297 bp的同源序列(GenBank登錄號：MZ189011～MZ189084)，定義單倍型20個，根據序列堿基差異大小，分為4個單倍型集合，其中單倍型H1～H6核苷酸變異位點13個，6個單倍型間堿基差異為1～10個；單倍型H7～H10核苷酸變異位點5個，4個單倍型間堿基差異為1～5個；單倍型H11～H15核苷酸變異位點11個，5個單倍型間堿基差異為1～8個；單倍型H16～H20核苷酸變異位點5個，5個單倍型間堿基差異為2～5個(表1、2)。單倍型集間，以單倍型H1～H6與H7～H10堿基差異最小，平均為17.83，其次為單倍型H11～H15與H16～H20，平均堿基差異為38.64，單倍型H1～H6、H7～H10與單倍型H11～H15、H16～H20間堿基差異較大，平均為64.85～70.10。

表1 單倍型H1～H10線粒體控制區(qū)基因變異位點Table 1 Mutation sites in the mtDNA control region of H1-H10

2.1.3 序列相似度比對 經Blast比對，所有單倍型序列均與GenBank數(shù)據庫中已公布的單一物種同源序列高度相似，對比結果分別為犬(Canislupusfamiliaris)、灰狼(Canislupus)、紅狐(Vulpesvulpes)和藏狐(Vulpesferrilata)4種犬科動物(表3)。

表3 單倍型序列BLAST比對結果Table 3 BLAST results of the haplotype sequences

1～9.檢測的糞便樣本；M.DL5000 DNA相對分子質量標準；N.無模板對照1-9.Fecal samples detected in the study;M.DL5000 DNA molecular weight markers;N.No template control圖1 PCR擴增結果Fig.1 The results of the PCR amplification

表2 H11～H20線粒體控制區(qū)基因變異位點Table 2 Mutation sites in the mtDNA control region of H11-H20

2.1.4 遺傳距離分析 基于K2P模型的遺傳距離分析結果顯示，20個單倍型之間遺傳距離為0.004～0.354。4個單倍型集間遺傳距離遠大于各集合內單倍型間遺傳距離；單倍型H1～H6與H7～H10、單倍型H11～H15與H16～H20間遺傳距離較與其他單倍型集間遺傳距離小；單倍型H1～H6、H7～H10、H11～H15、H16～H20分別與犬、灰狼、赤狐和藏狐遺傳關系最近(表4)。

表4 基于K2P模型的平均遺傳距離Table 4 Average genetic distance based on the K2P model

2.1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 構建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹表現(xiàn)出明顯的聚類現(xiàn)象，所有單倍型分為兩大支，其中單倍型H7～H10與灰狼參考序列(KT901460)聚集在一起，并與單倍型H1～H6及犬參考序列(JN695048)共處同一大分支；另一大分支是由單倍型H11～H15與赤狐參考序列(KJ846513)，以及單倍型H16～H20與藏狐參考序列(JF520840)各自聚集成簇后再形成的一個大支(圖2)。

2.2 棘球絳蟲感染檢測

經棘球絳蟲糞-抗原ELISA檢測共發(fā)現(xiàn)陽性樣本11份，陽性率為10.89%(11/101)(表5)。

小于75%的自展值未予顯示Bootstrap values below 75% were not shown圖2 基于線粒體控制區(qū)基因序列構建的ML系統(tǒng)進化樹Fig.2 ML tree based on mtDNA control region sequences

表5 棘球絳蟲糞-抗原ELISA檢測結果Table 5 The results of copro-antigen ELISA tests for detection of Echinococcus

3 討 論

棘球絳蟲終末宿主感染調查是棘球蚴病監(jiān)測的重點，也是防控的難點和薄弱點。糞便作為非損傷性采集樣本，可同時用于來源宿主的物種鑒定和棘球絳蟲的感染檢測，對棘球絳蟲終末宿主，尤其是野生終末宿主的調查研究具有重要意義。近年來的研究報道中所涉及的野外犬科動物感染調查均選擇以糞便為樣本，在檢測其內棘球絳蟲特異性抗原或核酸的同時，根據糞樣外形特征來推測其宿主來源[11-12]。本次研究結果證實，以糞樣形態(tài)特點和采樣環(huán)境來判斷樣本來源動物種類具有一定可行性，但也存在一定的誤差，尤其是犬糞，誤辨率較高。另外，由于眼觀鑒別嚴重依賴現(xiàn)場人員個人經驗，也極大地限制了該方法的推廣應用。本次檢測的101份糞樣中，74份通過糞樣DNA擴增、測序和分析，成功實現(xiàn)對其來源的4種犬科動物的鑒別，結果表明，分子檢測可有效鑒定糞便樣本來源動物種類，作為形態(tài)判別的修正依據，有效提升鑒定準確率。另一方面，研究結果也反映出糞樣檢測的不足，與血液、組織等樣本相比，糞便樣本檢測成功率一般相對較低。本次用于檢測的糞樣為野外撿拾，部分樣本可能因為曝露時間過長，受到高原陽光爆嗮或雨水沖刷，造成糞樣被某些有抑制作用的成分污染，或其內含有的宿主核酸降解，而未能成功擴增。研究結果提示，要進一步提升樣本檢出率，應盡量采集新鮮糞便用于分子檢測，同時，探索更為有效的目的成分富集前處理方法。

mtDNA目前被廣泛應用于物種鑒定、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生等研究，以cox1、細胞色素b(cytb)等編碼基因為代表的DNA條形碼技術在嚙齒類、魚類、鳥類等動物識別與分類研究中均取得了較為理想的結果[13-15]。然而，由于受到選擇壓力的影響，這些編碼基因通常無法有效區(qū)分親緣關系較近的物種，相較之下，作為mtDNA中唯一的非編碼區(qū)域，D-loop區(qū)因為缺乏選擇壓力，變異速度較編碼區(qū)基因更快，被認為對近緣和近期分化的物種具有更好的分辨能力[7]。本研究對成功擴增獲得的74份mtDNA D-loop區(qū)基因片段進行了分析，同源序列比對結果顯示，檢測序列可與GenBank中單一物種序列相匹配，多態(tài)性位點差異與遺傳距離分析結果與BLAST比對結果一致，所鑒定的物種間距離遠大于種內距離，滿足物種鑒定的判別條件，系統(tǒng)發(fā)育發(fā)育樹中，鑒別為同一物種的不同單倍型以高自展值進行聚類，支持其鑒別結果，綜合各項分析結果，可判斷糞樣來源分別為犬、灰狼、赤狐和藏狐4種犬科動物。研究表明，以mtDNA D-loop區(qū)序列分析作為犬科動物糞樣不同物種來源的鑒定依據具有可行性，該方法對包括狼及其近緣馴化種犬在內的棘球絳蟲主要終末宿主均具有較好的辨識能力。

盡管基于mtDNAD-loop區(qū)對犬科動物的鑒別具有快捷、高效、簡易等優(yōu)點，但仍然存在一定的局限性。由于線粒體基因母系遺傳的特點，基于mtDNA的分析無法識別自然界中可能偶爾發(fā)生的雜交事件，對沒有生殖隔離的物種間自然交配產生的雜交及其回交子代個體的鑒別存在一定缺陷[16-17]。因此，為進一步提高鑒別的準確度，在對mtDNA D-loop區(qū)堿基序列進行分析比較的同時，可結合常染色體基因的雙親遺傳或Y染色體基因的父系遺傳分子標記對物種進行鑒別[18-20]。此外，采用微衛(wèi)星標記對物種個體進行識別分析，可進一步排除可能存在的來源于同一宿主的重復樣本，實現(xiàn)對棘球絳蟲終末宿主的精準識別，為棘球絳蟲終末宿主防控提供更為系統(tǒng)、全面的數(shù)據支撐。

家犬作為牧區(qū)重要的生產工具和人類的親密伙伴，與其相關的因素，如家庭是否養(yǎng)犬、犬只數(shù)量、是否與犬親密接觸等，被認為是我國棘球蚴病流行區(qū)、尤其是青藏高原地區(qū)棘球絳蟲傳播最重要的風險因素[21-23]，但自2006年我國棘球蚴病防治項目實施以來，經過近15年以家犬驅蟲為主的綜合防控，目前各流行區(qū)家犬棘球絳蟲感染率均已出現(xiàn)明顯下降，并維持于較低水平[24-26]。與此同時，流浪犬(無主犬)因其數(shù)量多、流動性大等特點，干預十分困難，其感染控制成效極為有限[27-28]，類似地，作為棘球絳蟲的保蟲宿主，狼、狐貍等野生犬科動物感染率也遠高于家犬[1,11]。本次對糞樣棘球絳蟲抗原檢測結果顯示，調查地區(qū)野外犬科動物具有較高的棘球絳蟲抗原陽性率，但相較于此前采用不同檢測方法對該地區(qū)野生犬科動物棘球絳蟲感染情況的調查結果，感染率有所下降，這可能是由于各研究項目調查時間、調查方法、樣本代表性，以及所涉及宿主種類等的不同而導致[29-31]。由于現(xiàn)有針對野外犬科動物棘球絳蟲感染情況的研究嚴重不足，依靠現(xiàn)有數(shù)據難以對當?shù)匾巴馊苿游锛蚪{蟲感染水平作出全面的有效推斷，但可以明確的是，在家犬棘球絳蟲感染率得到有效控制的情況下，包括流浪犬在內的野外犬科動物所具有的高感染率可能對流行區(qū)棘球絳蟲的傳播起到更大的作用，由其引起人群感染的危害不應被忽視。強化宿主物種鑒別與個體鑒定、病原分子檢測等關鍵技術，開展野外犬科動物棘球絳蟲感染水平監(jiān)測，有針對性地提出對野外犬科動物的防控措施，將有助棘球蚴病下一步防控目標的實現(xiàn)。

4 結 論

通過mtDNA D-loop區(qū)序列分析對野外犬科動物糞便的物種鑒別結果顯示，成功確定檢測的糞樣分別來自犬、灰狼、赤狐和藏狐4種犬科動物，同時，基于棘球絳蟲糞抗原的檢測發(fā)現(xiàn)，樣本來源個體具有較高的棘球絳蟲感染率。研究結果可為進一步提升棘球絳蟲野外終末宿主精準監(jiān)測質量提供技術依據，作為調查地區(qū)野生犬科動物棘球絳蟲感染數(shù)據的更新和補充，為當?shù)亻_展棘球絳蟲防控提供數(shù)據參考。