陳思彥，孫維婧，王子旭，陳耀星，曹 靜，董玉蘭

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

在我國的生豬規(guī)?；B(yǎng)殖中，妊娠期母豬常使用限位欄養(yǎng)殖。雖然這種養(yǎng)殖方法能夠節(jié)省養(yǎng)殖空間、提高養(yǎng)殖效率、方便孕期管理、疫苗免疫和精準(zhǔn)飼喂，但也使孕豬長期處于制動(dòng)應(yīng)激狀態(tài)，這種應(yīng)激不僅不符合動(dòng)物福利的要求，還會(huì)造成母豬生理和心理上的雙重?fù)p傷，影響母豬的激素分泌、神經(jīng)營養(yǎng)和生育繁殖等機(jī)能，甚至對(duì)子代健康產(chǎn)生負(fù)面作用，最終導(dǎo)致母豬的使用年限下降，淘汰率升高，給豬場造成經(jīng)濟(jì)損失。因此，如何正確評(píng)估限位欄養(yǎng)殖對(duì)母豬造成的影響，降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，提高后備母豬的繁殖力也逐漸引起學(xué)者和養(yǎng)殖界的關(guān)注。同時(shí)，妊娠模型動(dòng)物豬應(yīng)激反應(yīng)的研究對(duì)人類妊娠期應(yīng)激導(dǎo)致疾病的機(jī)理研究和防治同樣具有啟發(fā)意義。下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)是機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分。當(dāng)應(yīng)激源刺激機(jī)體時(shí)，信號(hào)從大腦皮層傳入邊緣系統(tǒng)，作用于下丘腦，在HPA軸的調(diào)控下，最終釋放大量糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)。應(yīng)激時(shí)HPA軸的功能是由海馬、下丘腦室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)和杏仁核共同調(diào)節(jié)的，GC又可反饋?zhàn)饔糜诤ｑR的糖皮質(zhì)激素受體(GR)和鹽皮質(zhì)激素受體(MR)引起一系列反應(yīng)。應(yīng)激能夠引起海馬形態(tài)和功能的改變。大量證據(jù)表明[1-2]，海馬是應(yīng)激損傷的敏感區(qū)[3]，應(yīng)激會(huì)對(duì)海馬突觸可塑性、神經(jīng)元存活、海馬神經(jīng)發(fā)生、海馬神經(jīng)元細(xì)胞代謝和機(jī)體記憶力等各個(gè)方面造成影響?？伤苄员徽J(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)內(nèi)、外部刺激時(shí)產(chǎn)生的適應(yīng)性結(jié)構(gòu)重組以改變功能的能力[4-10]。大量資料顯示，在應(yīng)激改變海馬形態(tài)和功能的過程中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可能充當(dāng)了重要的角色。海馬中BDNF的表達(dá)水平在急性或慢性的應(yīng)激中均有敏感的變化[11-13]，而BDNF的減少也是影響海馬神經(jīng)元的發(fā)生[14-15]、導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的退行性變化和突觸的可塑性變化的一個(gè)因素[16-17]。而且，海馬神經(jīng)元中BDNF/TrkB由5-HT2A受體介導(dǎo)、雌激素參與的信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控[18]，其下突觸級(jí)聯(lián)反應(yīng)涉及突觸可塑性[19]，提示BDNF是妊娠母豬應(yīng)激反應(yīng)時(shí)影響突觸可塑性且可監(jiān)測的重要指標(biāo)蛋白。本研究選用8～9月齡的巴馬小型母豬，將配種成功的母豬隨機(jī)分為應(yīng)激組(n=3)和對(duì)照組(n=3)，應(yīng)激組從妊娠第1天開始飼養(yǎng)于定制的母豬限位欄中，模擬實(shí)際生產(chǎn)中孕豬所承受的制動(dòng)應(yīng)激環(huán)境，對(duì)照組在寬敞自由的環(huán)境中飼養(yǎng)，其他飼養(yǎng)條件相同。妊娠第18天處死動(dòng)物，采集孕豬血液，進(jìn)行相關(guān)激素水平的檢測；分離孕豬的海馬組織，檢測海馬BDNF表達(dá)水平，并通過尼氏染色和鍍銀染色檢測海馬的神經(jīng)元丟失率、樹突復(fù)雜度以及樹突棘數(shù)量等多個(gè)指標(biāo)，來研究心理應(yīng)激在胚胎著床期對(duì)孕豬造成的類固醇激素合成功能的變化及對(duì)海馬神經(jīng)元可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理 于北京實(shí)創(chuàng)世紀(jì)小型豬養(yǎng)殖基地購入6頭雌性巴馬小型豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，所有母豬月齡相近(8～9月齡)、體重相似(20～30 kg)且健康無病。將其均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下(溫度為22 ℃；12 h/12 h光照制度；每日上午8:00開燈，下午8:00關(guān)燈)并自由采食飲水。將實(shí)驗(yàn)?zāi)肛i成功配種后隨機(jī)分為兩組，每組3頭：1)對(duì)照組：將每頭妊娠巴馬小型豬單獨(dú)飼養(yǎng)于干凈、寬闊的環(huán)境下，可自由活動(dòng)；2)制動(dòng)應(yīng)激組：將每頭妊娠巴馬小型豬單獨(dú)飼養(yǎng)于50 cm×60 cm×100 cm的金屬籠中，孕豬只可前后小范圍運(yùn)動(dòng)，無法左右轉(zhuǎn)頭。

在持續(xù)制動(dòng)應(yīng)激處理的第18天上午對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后心臟放血處死。用開顱器取出完整豬腦，于延髓后切斷，從正中矢狀面將大腦一分為二，左半球分離出各腦部結(jié)構(gòu)并置于液氮凍存，右半球完整置于4%多聚甲醛固定。

血漿獲?。褐苿?dòng)應(yīng)激處理前1 d記為D0(發(fā)情期)，試驗(yàn)期間分別于D0和D18采集孕豬頸靜脈血樣。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 兔單克隆抗體BDNF(ab108319，abcam，美國)，RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(CW0211)均購自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司。豬促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)ELISA 試劑盒(CEA835Po)和豬5-羥色胺(5-HT)ELISA檢測試劑盒(CEA808Ge)均購自武漢云克隆科技股份有限公司。YP1200電子天平購自上海第二天平儀器廠，生物組織包埋機(jī)購自浙江科迪儀器設(shè)備有限公司，高速臺(tái)式離心機(jī)購自長沙湘儀離心儀器有限公司，酶標(biāo)儀購自美國BLO-RAD，多管放射免疫計(jì)數(shù)器購自合肥眾成機(jī)電技術(shù)公司，轉(zhuǎn)膜電泳槽購自北京六一儀器廠，電泳儀購自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血液激素含量的測定 檢測血漿中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)的濃度：按照ELISA試劑盒說明書操作檢測血漿中CRH的濃度。

檢測血漿中的促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)和皮質(zhì)醇(cortisol，COR)濃度：使用放射免疫法。將血漿樣品解凍，分別加樣，混勻后室溫放置15 min，3 500 g轉(zhuǎn)速離心15 min。棄上清，檢測各管沉淀的放射性計(jì)數(shù)并采用“相對(duì)結(jié)合率-對(duì)數(shù)計(jì)量的分?jǐn)?shù)對(duì)數(shù)”的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合。

1.2.2 尼氏染色 海馬在4%多聚甲醛中固定，經(jīng)過修塊、梯度脫水、透明浸蠟，切片每張厚度15 μm。將石蠟切片脫蠟并在酒精下行水化，進(jìn)行尼氏染色，將切片置于尼氏染液中染色10 min，在蒸餾水中輕洗5 s，然后放入95%酒精中分色，分色程序視染色效果而定，一般為95%酒精Ⅰ 1 min、95%酒精Ⅱ 1 min、95%酒精Ⅲ 1 min，再酒精上行脫水，入二甲苯，最后中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。視野可見尼氏體呈深藍(lán)色，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色，背景為無色或者淡藍(lán)色。

神經(jīng)元密度評(píng)價(jià)方法：根據(jù)神經(jīng)元形態(tài)和神經(jīng)纖維排列的不同，海馬本部被分為CA1、CA2、CA3和CA4 4個(gè)區(qū)。從海馬切片中隨機(jī)選取6張相同定位切片，在放大400倍條件下，從CA1區(qū)和CA3區(qū)含有完整結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元區(qū)域開始，連續(xù)采集3個(gè)不重疊的視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)元數(shù)量，求均值以代表正常形態(tài)神經(jīng)元密度[20]。

1.2.3 鍍銀染色 將新鮮取材的豬腦半球放入4%多聚甲醛中固定一周以上，然后使用1.5%重鉻酸鉀鉻化，3%的硝酸銀溶液浸泡鍍銀48 h，脫水、包埋、切片、封片后即可進(jìn)行觀察。

樹突測量標(biāo)準(zhǔn)。在孕豬海馬CA3區(qū)選取具有代表性的錐體細(xì)胞，在齒狀回(dentate gyrus，DG)選擇獨(dú)立的與周圍神經(jīng)元交叉較少的顆粒細(xì)胞進(jìn)行圖像采集、圖像處理和分析，神經(jīng)元采集標(biāo)準(zhǔn)：1)選取位于切片厚度中部的錐體細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，盡量避免樹突的缺失；2)盡量選取相對(duì)獨(dú)立的，與周圍的神經(jīng)元樹突有較少交叉的神經(jīng)元進(jìn)行分析。照片使用Olympus成像系統(tǒng)在20倍物鏡下連續(xù)采集圖像，通過均勻微調(diào)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋在切片不同焦距采集連續(xù)的神經(jīng)元的圖像，每個(gè)視野采集6張圖像。神經(jīng)元的二維重建采用Neuronstudio軟件，圖像的測量分析使用Image-J win64軟件，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS軟件。數(shù)據(jù)描述為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，數(shù)據(jù)比較P≤0.05 視為有顯著差異，Graphpad軟件作圖[21]。

Sholl分析法是一種對(duì)神經(jīng)元樹突復(fù)雜度進(jìn)行定量分析的經(jīng)典方法，可用于確定樹突形態(tài)。從神經(jīng)元胞體開始，每隔相同距離畫一個(gè)圈覆蓋樹突，由同心圓與樹突交叉點(diǎn)的數(shù)量來評(píng)估神經(jīng)元樹突的復(fù)雜性，神經(jīng)元樹突追蹤可獲得神經(jīng)元樹突分支點(diǎn)的數(shù)量以及神經(jīng)元樹突的總長度。

樹突棘測量標(biāo)準(zhǔn)。樹突棘是神經(jīng)元樹突上的微小突起，是和其他神經(jīng)元的軸突末梢形成突觸的結(jié)構(gòu)。樹突棘的主要形狀包括瘦長型、短粗型、蘑菇形和絲狀偽足。每張切片選擇3個(gè)處于切片正中、樹突盡量完整的神經(jīng)元參與統(tǒng)計(jì)，每個(gè)神經(jīng)元選取5根只有一個(gè)分支點(diǎn)的二級(jí)樹突參與統(tǒng)計(jì)，在100倍油鏡下選取和背景無交叉的、總體處于同一焦距的、平行于鏡頭的樹突，通過均勻微調(diào)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋在切片不同焦距采集連續(xù)的樹突圖像，使用Photoshop合成一個(gè)較為清晰的視野，每個(gè)視野選取相對(duì)直的長20 μm的樹突節(jié)段進(jìn)行計(jì)數(shù)，樹突棘密度即為視野內(nèi)總樹突棘數(shù)目除以樹突分支長度。

1.2.4 Western blot 新鮮組織提取蛋白。用RIPA倍比稀釋蛋白樣品并使用酶標(biāo)儀測量吸光光度值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白樣品濃度后用RIPA將蛋白樣品濃度調(diào)平。將未變性蛋白與Loading buffer混合煮樣使之變性后，進(jìn)行電泳，然后冰浴轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后將PVDF膜放入脫脂奶中封閉，用一抗(BDNF)孵育過夜，用TBST洗滌后再放入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗中，室溫?fù)u床孵育2 h，之后進(jìn)行熒光顯色，最后使用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集。目的蛋白和內(nèi)參蛋白的面積和光密度使用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)。目的蛋白表達(dá)量=(目的蛋白面積×光密度)/(內(nèi)參蛋白面積×光密度)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用軟件 SPSS 23.0(SPSS Sciences，Chicago，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析對(duì)照組與應(yīng)激組的差異顯著性。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤”，P≤0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 孕豬血漿中應(yīng)激相關(guān)激素的水平

在制動(dòng)應(yīng)激處理18 d后，應(yīng)激組血漿CRH水平較應(yīng)激前上升221.65%(t=2.71，P=0.046)，較同時(shí)間的對(duì)照組顯著上升296.36%(t=3.026，P=0.038，圖1A)。由放射免疫法測得，在第18天時(shí)應(yīng)激組血漿ACTH水平較應(yīng)激前上升64.97%(t=5.151，P=0.007)，較同時(shí)間的對(duì)照組高出62.98%(t=4.549，P=0.010，圖1B)；而COR水平較應(yīng)激前上升97.76%(t=5.131，P=0.007)，較同期對(duì)照組顯著高出 109.86%(t=5.602，P=0.005，圖1C)。制動(dòng)應(yīng)激處理后，孕豬血漿中的各級(jí)應(yīng)激激素水平均顯著上升，表明成功建立孕豬制動(dòng)應(yīng)激模型。

D0 表示制動(dòng)應(yīng)激開始前1 d，D18 表示制動(dòng)應(yīng)激第18天。*表示制動(dòng)應(yīng)激組與相同日齡的對(duì)照組具有顯著性差異(P≤0.05)D0 represents the day before the restraint stress treatment,and D18 represents the 18th day of restraint stress treatment.* indicates that the difference is significant between the control group and the stress group (P≤0.05)圖1 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬血漿CRH、ACTH和COR水平的影響Fig.1 The effect of restraint stress on plasma CRH,ACTH and COR level in pregnant sows

2.2 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬海馬組織結(jié)構(gòu)的影響

尼氏染色法是一種通過堿性染料染色神經(jīng)組織的方法，本研究使用尼氏染色來對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察是否有神經(jīng)元丟失的情況發(fā)生。將孕豬海馬石蠟切片進(jìn)行尼氏染色后，在DG的顆粒細(xì)胞層中，對(duì)照組的顆粒細(xì)胞整體染色均勻，胞核大且呈卵形，細(xì)胞排列緊密；應(yīng)激組中，顆粒細(xì)胞胞核排列整體松散，胞核染色不均且整體呈錐形，顆粒細(xì)胞內(nèi)側(cè)的膠質(zhì)細(xì)胞和多形細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)基本一致，無明顯可見差異(圖2A)。而在海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)中，對(duì)照組錐體細(xì)胞層的錐體細(xì)胞核大而圓，頂樹突長而直，投向分子層，其中CA3區(qū)整體排列整齊緊密，CA1區(qū)較為松散，尼氏體染色均勻、無凝集、無分散；應(yīng)激組海馬的CA3區(qū)部分錐體細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀，排列松散，肉眼可見部分神經(jīng)元位置空缺，而在應(yīng)激組CA1區(qū)的錐體細(xì)胞中可見尼氏小體分布減少，染色較淺。

通過神經(jīng)元計(jì)數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激組CA1區(qū)中的錐體細(xì)胞數(shù)量和對(duì)照組無顯著差異(P=0.221 9，圖2B)，應(yīng)激組海馬CA3區(qū)的錐體細(xì)胞層顯著低于對(duì)照組11.3%(t=2.318，P=0.034，圖2C)，應(yīng)激組齒狀回中顆粒細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組也下降31.7%(t=3.407，P=0.003，圖2D)，故在應(yīng)激組的CA3區(qū)和DG均發(fā)生了神經(jīng)元丟失的情況。

A.海馬組織學(xué)結(jié)構(gòu)，圖中黑色箭頭指示齒狀回中的顆粒細(xì)胞層，紅色箭頭指示 CA1 區(qū)和 CA3 區(qū)中的錐形細(xì)胞層,圖中比例尺=100 μm;B.CA1 區(qū)錐體細(xì)胞層；C.CA3 區(qū)錐體細(xì)胞層；D.齒狀回顆粒細(xì)胞層，*表示對(duì)照組和應(yīng)激組差異顯著(P≤0.05)A.Hippocampal stracture,the black arrow in the figure indicates the granulosa cell layer in the dentate gyrus,and the red arrow indicates the pyramidal cell layer in the CA1 and CA3 regions,scale bar =100 μm;B.Pyramidal cell layer in CA1 regions;C.Pyramidal cell layer in CA1 regions;D.Granule cell layer in DG,* indicates that the difference is significant between the control group and the stress group (P≤0.05)圖2 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬海馬結(jié)構(gòu)的影響及孕豬海馬尼氏染色的結(jié)果統(tǒng)計(jì)Fig.2 The effect of restraint stress on Nissl staining of hippocampus in pregnant sow and statistics of Nissl staining results in pregnant sows

2.3 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬海馬神經(jīng)可塑性的影響

2.3.1 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬海馬CA3區(qū)神經(jīng)元復(fù)雜度的影響 鍍銀染色可顯示出神經(jīng)元的胞體、樹突、軸突以及更微小的樹突棘結(jié)構(gòu)。為了評(píng)估制動(dòng)應(yīng)激對(duì)妊娠母豬大腦海馬CA3區(qū)(圖3A)神經(jīng)元可塑性的影響，對(duì)孕豬海馬切片進(jìn)行鍍銀染色(圖3B)，利用ImageJ軟件對(duì)神經(jīng)元的樹突追蹤后采取Sholl分析，結(jié)果表明：在孕豬海馬CA3區(qū)中，應(yīng)激組中海馬錐體細(xì)胞神經(jīng)元與同心圓交點(diǎn)的數(shù)量較對(duì)照組下降(圖3C)。應(yīng)激組和對(duì)照組CA3區(qū)中的錐體細(xì)胞頂樹突和基樹突的樹突平均長度均無顯著差異(P=0.847 6和P=0.938 5，圖3D)。應(yīng)激組CA3區(qū)錐體細(xì)胞的頂樹突終末點(diǎn)的數(shù)量較對(duì)照組減少61.3%(t=3.245，P=0.005，圖3E)，基樹突終末點(diǎn)的數(shù)量較對(duì)照組減少46.1%(t=2.542，P=0.02，圖3E)。故制動(dòng)應(yīng)激后，孕豬海馬CA3區(qū)的錐體神經(jīng)元樹突復(fù)雜度較對(duì)照組顯著下降。

A.成年豬海馬 CA3 區(qū)示意圖；B.CA3 區(qū)錐體細(xì)胞的鍍銀染色及樹突追蹤結(jié)果，圖中比例尺為 20 μm；C.CA3 區(qū)樹突 Sholl 交叉點(diǎn)分析；D.CA3 區(qū)平均樹突長度；E.CA3 區(qū)樹突終末點(diǎn)數(shù)量。*表示對(duì)照組和應(yīng)激組差異顯著(P≤0.05)A.Schematic diagram of hippocampal CA3 area of grown-up pig;B.Golgi’s staining and dendrite tracing results of pyramidal cells in CA3 region,scale bar=20 μm;C.Sholl intersection of CA3 region;D.Average dendritic length in CA3 region;E.Dendrite terminal number in CA3 region.* indicates that the difference is significant between the control group and the stress group (P≤0.05)圖3 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬海馬 CA3 區(qū)神經(jīng)元復(fù)雜度的影響Fig.3 The effect of restraint stress on neuronal dendrites complexity in hippocampus CA3 region of pregnant sow

2.3.2 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬DG神經(jīng)元復(fù)雜度的影響 海馬中新生神經(jīng)元發(fā)生在DG(圖4A)的亞顆粒區(qū)，這些神經(jīng)元在發(fā)育成熟后會(huì)整合到現(xiàn)有的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中。錐體細(xì)胞的鍍銀染色及樹突追蹤結(jié)果見圖4B。Sholl分析結(jié)果顯示，應(yīng)激組妊娠母豬海馬DG中顆粒細(xì)胞的神經(jīng)元與同心圓交點(diǎn)的數(shù)量較對(duì)照組無顯著變化(圖4C)。應(yīng)激組DG的樹突平均長度(P=0.644)和顆粒細(xì)胞樹突終末點(diǎn)的數(shù)量(P=0.786)也較對(duì)照組無顯著性差異(圖4D和E)。故在18 d制動(dòng)應(yīng)激后，孕豬海馬DG中顆粒細(xì)胞的樹突復(fù)雜度無明顯變化。

A.成年豬海馬 DG 示意圖；B.DG 錐體細(xì)胞的鍍銀染色及樹突追蹤結(jié)果，圖中比例尺為 20 μm；C.DG樹突 Sholl 交叉點(diǎn)分析；D.DG 平均樹突長度；E.DG 樹突終末點(diǎn)數(shù)量。*表示對(duì)照組和應(yīng)激組差異顯著(P≤0.05)A.Schematic diagram of hippocampal DG area of grown-up pig;B.Golgi’s staining and dendrite tracing results of pyramidal cells in DG region,scale bar=20 μm;C.Sholl intersection of DG region;D.Average dendritic length in DG region;E.Dendrite terminal number in DG region.* indicates that the difference is significant between the control group and the stress group (P≤0.05)圖4 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬海馬DG神經(jīng)元復(fù)雜度的影響Fig.4 The effect of restraint stress on neuronal dendrites complexity in hippocampus CA3 region of pregnant sow

2.3.3 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬海馬CA3區(qū)和DG神經(jīng)元樹突棘的影響 鍍銀染色能顯示出神經(jīng)元樹突上的細(xì)小突起，這種突起就是承載著哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大多數(shù)興奮性突觸功能的樹突棘，樹突棘根據(jù)其形態(tài)通常被分為4類：蘑菇型樹突棘(mushroom spines)、細(xì)樹突棘(thin spines)、短粗樹突棘(stubby spines)和絲狀偽足(filopodia),見圖5A。樹突、樹突棘形態(tài)等見圖5B、C。一般絲狀偽足和細(xì)樹突棘無法十分準(zhǔn)確地區(qū)分計(jì)數(shù)，故將絲狀偽足也計(jì)入未成熟樹突棘中。樹突棘統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明(圖5D～G)：在18 d制動(dòng)應(yīng)激后，孕豬海馬CA3區(qū)的錐體細(xì)胞樹突上的樹突棘總數(shù)較對(duì)照組降低17.8%(t=2.115，P=0.046，圖5E)。DG中顆粒細(xì)胞樹突上的樹突棘總體數(shù)量較對(duì)照組降低19.3%(t=2.701，P=0.013，圖5G)。而將未成熟樹突棘和成熟樹突棘分開統(tǒng)計(jì)比較后發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激組CA3區(qū)未成熟樹突棘數(shù)量下降17.9%(t=3.099，P=0.01，圖5D)，成熟樹突棘數(shù)量下降31.28%(t=2.255，P=0.024，圖5D)。DG的成熟樹突棘數(shù)量下降26.8%(t=2.463，P=0.022，圖5F)，未成熟樹突棘數(shù)量變化不顯著(P=0.50，圖5F)。綜上所述，18 d的制動(dòng)應(yīng)激降低孕豬海馬CA3區(qū)和DG中的新生樹突棘的形成，同時(shí)增加CA3區(qū)中成熟樹突棘的消除，共同造成應(yīng)激組海馬CA3區(qū)和DG中神經(jīng)元樹突棘密度的減少。

A.樹突棘的典型形態(tài)，包括細(xì)樹突棘、絲狀偽足、短粗樹突棘和蘑菇型樹突棘；B.應(yīng)激組和對(duì)照組的樹突形態(tài)；C.樹突棘的形狀和大小，圖中包括絲狀偽足、未成熟樹突和成熟樹突；D～G.樹突棘密度(即視野內(nèi)總樹突棘數(shù)除以樹突分支長度)A.Four typical dendritic spines morphology,including thin spines,filopodia,stubby spines and mushroom spines;B.Dendrite morphology in the stress group and the control group;C.shapes and sizes of dendritic spines,including filopodia,immature spines and mature spines;D-G.Dendrite spine density(Number of dendritic spines in the visual field divided by the length of dendritic branches)圖5 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬CA3區(qū)和DG神經(jīng)元樹突棘的影響Fig.5 The effect of restraint stress on neuronal dendrites spines in hippocampus CA3 region and DG of pregnant sow

2.4 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬海馬BDNF蛋白表達(dá)水平的影響

BDNF是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的中央神經(jīng)營養(yǎng)因子(central neurotrophic factor，NTF)[22]，在海馬中高表達(dá)[23-24]，與海馬相關(guān)的眾多神經(jīng)損傷性疾病有關(guān)[25]。Western blot結(jié)果顯示，應(yīng)激組中孕豬海馬內(nèi)的BDNF蛋白表達(dá)量較對(duì)照組降低70.6%(t=6.642，P=0.00，圖6)。

*表示對(duì)照組和應(yīng)激組差異顯著(P≤0.05)* indicates that the difference is significant between the control group and the stress group (P≤0.05)圖6 制動(dòng)應(yīng)激對(duì)孕豬海馬BDNF蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 The effect of restraint stress on BDNF level of hippocampus in pregnant sows

3 討 論

關(guān)于慢性應(yīng)激對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生的影響已經(jīng)有了眾多進(jìn)展，如慢性輕度應(yīng)激(chronic mildstress，CMS)可降低小鼠海馬內(nèi)分子層的突觸囊泡密度[26]，慢性隔離應(yīng)激(social instabilitystress)的雄性小鼠海馬中新生神經(jīng)元中存活率降低，且新生比例降低[27]。考慮到豬和人在應(yīng)激激素類型和海馬結(jié)構(gòu)上的相似性，因此我們認(rèn)為用豬作為妊娠期心理應(yīng)激的模型動(dòng)物更具有臨床意義。同時(shí)，探索限位欄養(yǎng)殖模式對(duì)于妊娠母豬生理、心理的影響也是學(xué)者和養(yǎng)殖界關(guān)心的重要課題。因此，作者通過構(gòu)建著床期孕豬制動(dòng)應(yīng)激模型，探索了著床期慢性心理應(yīng)激對(duì)孕豬海馬神經(jīng)可塑性的影響。

突觸可塑性(synaptic plasticity)是指突觸的形態(tài)會(huì)朝著有利于某些神經(jīng)元通路的方向改變，同時(shí)減少與其他神經(jīng)元通路的聯(lián)系，這種可塑性被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)內(nèi)、外部刺激時(shí)產(chǎn)生的適應(yīng)性結(jié)構(gòu)重組以改變功能的能力。而神經(jīng)可塑性不僅反映在海馬神經(jīng)元構(gòu)建新的神經(jīng)通路的能力中，同時(shí)也反映在海馬神經(jīng)元的組織學(xué)特性里，包括樹突棘的大小和數(shù)量、突觸的數(shù)量以及新神經(jīng)元形成的可塑性。本研究的結(jié)果顯示，慢性應(yīng)激使孕豬海馬的部分細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，應(yīng)激組孕豬海馬DG顆粒細(xì)胞胞核排列松散，染色不均且整體呈錐形，并發(fā)生了神經(jīng)元丟失的情況；CA3區(qū)部分錐體細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀，整體排列松散，肉眼可見部分神經(jīng)元位置空缺；而在應(yīng)激組CA1區(qū)的錐體細(xì)胞中可見尼氏小體分布減少，染色較淺。CA3區(qū)的樹突復(fù)雜度也顯著下降，樹突長度則無顯著變化，但本研究鍍銀染色切片的厚度較薄，樹突并不一定能展現(xiàn)其全長并納入統(tǒng)計(jì)，這可能會(huì)影響樹突長度結(jié)果的可信度。樹突棘統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在CA3區(qū)，未成熟和成熟樹突棘數(shù)量較對(duì)照組均有顯著下降，在DG中成熟樹突棘也有顯著下降，這表明制動(dòng)應(yīng)激可減少海馬神經(jīng)元新生樹突棘的形成或影響新生樹突棘的存活率，同時(shí)加速成熟樹突棘的消除，共同造成海馬神經(jīng)元樹突棘密度的降低。細(xì)胞形態(tài)的變化、樹突復(fù)雜度和樹突棘的數(shù)量的變化共同表明，慢性心理應(yīng)激對(duì)于海馬的神經(jīng)元可塑性功能造成了負(fù)面影響。

慢性應(yīng)激通常會(huì)引起大腦中BDNF表達(dá)水平的降低，降低的程度和應(yīng)激的性質(zhì)和程度以及不同腦區(qū)都有直接關(guān)聯(lián)。大量研究表明，糖皮質(zhì)激素和BDNF表現(xiàn)出對(duì)海馬結(jié)構(gòu)和細(xì)胞可塑性的相反作用[34]，糖皮質(zhì)激素對(duì)海馬神經(jīng)元可塑性的慢性負(fù)面效果可能是通過降低BDNF的表達(dá)并下調(diào)與其相關(guān)的信號(hào)通路來達(dá)成的[35]。在Radecki等人的研究中，BDNF的緩慢灌注逆轉(zhuǎn)了慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的海馬長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)[36-39]和記憶功能的損傷，證明慢性應(yīng)激造成大腦中神經(jīng)元可塑性負(fù)面變化可能是通過降低神經(jīng)元營養(yǎng)供給這一方式達(dá)成[40]。在本研究中，制動(dòng)應(yīng)激后孕豬海馬內(nèi)的BDNF蛋白表達(dá)的顯著下降也可能參與了海馬神經(jīng)可塑性的負(fù)面轉(zhuǎn)歸。

限位欄養(yǎng)殖對(duì)于神經(jīng)可塑性的影響或許不僅僅與制動(dòng)應(yīng)激有關(guān)，還可能與運(yùn)動(dòng)量的減少有關(guān)。有研究顯示[41]，運(yùn)動(dòng)量對(duì)于大腦血管系統(tǒng)的發(fā)生也有影響，在有氧運(yùn)動(dòng)參數(shù)條件下，運(yùn)動(dòng)皮層中的血管結(jié)構(gòu)可塑性主要表現(xiàn)為新生血管生成，運(yùn)動(dòng)大鼠大腦區(qū)域毛細(xì)血管直徑增加，內(nèi)皮細(xì)胞核直徑增大。因此，作者推測，限位欄養(yǎng)殖所致的母豬運(yùn)動(dòng)量減少，對(duì)大腦供血造成影響，可能也是限位欄養(yǎng)殖模式影響神經(jīng)細(xì)胞可塑性的一個(gè)因素。

4 結(jié) 論

制動(dòng)應(yīng)激使應(yīng)激組孕豬海馬的DG和CA3區(qū)出現(xiàn)了神經(jīng)元丟失現(xiàn)象，CA3區(qū)錐形細(xì)胞樹突復(fù)雜度下降，神經(jīng)元成熟樹突棘和未成熟樹突棘數(shù)量均顯著降低，DG的成熟樹突棘顯著降低。故制動(dòng)應(yīng)激減弱了孕豬大腦海馬中CA3區(qū)和DG的神經(jīng)元可塑性。