李哲 劉子倩 王胤 曾煥玉 李培峰

摘要：

為了尋找氧化應(yīng)激狀態(tài)下與心臟疾病有關(guān)的lncRNA，采用基因芯片法對正常心肌細胞和H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞進行l(wèi)ncRNA和mRNA表達圖譜分析，通過基因本體論和通路分析探索差異表達基因的功能，構(gòu)建lncRNA和mRNA共表達網(wǎng)絡(luò)，從差異表達的lncRNA中選取10組上調(diào)和10組下調(diào)差異顯著的lncRNA進行RT-qPCR驗證。研究結(jié)果表明，在正常心肌細胞和氧化應(yīng)激下的心肌細胞中，lncRNA和mRNA的表達均有差異，在差異上調(diào)顯著的10組lncRNA中，RT-qPCR檢測結(jié)果與芯片結(jié)果一致，這表示它們可能是心臟疾病的潛在治療靶點。

關(guān)鍵詞：

芯片分析;lncRNA;基因本體論分析;通路分析;共表達網(wǎng)絡(luò);RT-qPCR

中圖分類號： R735.7

文獻標(biāo)志碼：A

收稿日期：2021-04-25

基金項目：

國家自然科學(xué)基金海外青年基金（批準(zhǔn)號：82050410450、81850410551）資助;山東省自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號：ZR2019BH014）資助。

通信作者：

曾煥玉（AUNG Lynn Htet Htet），女，博士，主要研究方向為利用高通量測序，生物信息學(xué)，細胞生物學(xué)方法研究衰老及心腦血管疾病的機理機制;李培峰，男，博士，教授，主要研究方向為神經(jīng)元衰老，自由基生物醫(yī)學(xué)研究，細胞凋亡與心血管疾病的研究，心血管疾病的分子機制研究等。E-mail：peifli@qdu.edu.cn

氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡在冠狀動脈疾病[1]、心肌病[2]、心肌炎[3]、心力衰竭[4]和高血壓[5]等多種類型心臟病的病理過程中起著重要作用[6]，心肌細胞的凋亡通常始于心肌中活性氧的產(chǎn)生[7]，而活性氧的產(chǎn)生會造成細胞積累大量的自由基[8]，自由基不僅損傷組織和細胞[9]，還能誘發(fā)心臟病[10]。目前，保護H9c2等心肌細胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的分子機制尚不清楚[11-12]，因此尋找與氧化應(yīng)激有關(guān)的潛在的治療靶點迫在眉睫。長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）是指長度大于200 nt[13]，序列保守且表達水平低的RNA[14]，lncRNA在表觀遺傳[15]、轉(zhuǎn)錄[16]和轉(zhuǎn)錄后[17]水平上調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，或直接調(diào)節(jié)蛋白活性[18]，近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)lncRNA是心臟類疾病的治療靶點[19]，在心臟再生[20]和修復(fù)[21]中起著至關(guān)重要的作用。在H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中，02 mmol H2O2僅誘導(dǎo)心肌細胞凋亡[22-23]。本文采用生物信息學(xué)方法篩選出差異表達的lncRNA和mRNA，對差異表達的基因進行富集分析，通過RT-qPCR實驗對預(yù)測結(jié)果進行驗證，為尋找心臟疾病的潛在治療靶點、探究心臟疾病的發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本

實驗所用H9c2細胞來源于大鼠心肌細胞系，由中國科學(xué)院（上海）細胞庫提供。從每組樣本中提取總的RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳評估RNA完整性，采用Nanodrop ND-1000檢測RNA的質(zhì)量和數(shù)量。

1.2 微陣列分析

設(shè)計大鼠lncRNA陣列來識別lncRNA和蛋白編碼基因。從Rat lncRNA Orthologo數(shù)據(jù)庫、NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫和UCSC ALL-mRNA記錄數(shù)據(jù)庫中篩選出約9 000個lncRNA。

1.3 RNA標(biāo)記和陣列雜交

按照安捷倫單色微陣列基因表達方法進行樣品標(biāo)記和陣列雜交。mRNA從總RNA中純化，去除rRNA。對每個樣本進行擴增，采用隨機引物法轉(zhuǎn)錄成熒光cRNA。標(biāo)記的cRNA用RNeasy Mini Kit純化，用NanoDrop ND-1000測定標(biāo)記cRNA的濃度和比活性。加入阻斷劑和破碎緩沖液，將標(biāo)記的cRNA片段化，60 ℃加熱30 min，最后加入雜交緩沖液稀釋標(biāo)記cRNA。將雜交溶液組裝到lncRNA芯片載玻片上，載玻片在雜交儀中65°C孵育17 h后用DNA微陣列掃描儀對雜交陣列進行清洗、固定和掃描。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Agilent Feature Extraction軟件（版本11011）分析采集的微陣列圖像。使用genspring GX v1151軟件包分析lncRNA和mRNA。篩選標(biāo)準(zhǔn)：P<005，logFC>2。

1.5 LncRNA的篩選和驗證

從下調(diào)和上調(diào)差異表達的lncRNA中分別選出差異顯著的10組lncRNA，進行RT-qPCR驗證，分析其表達變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩組樣本中l(wèi)ncRNA和mRNA表達的變化

用基因芯片法對正常H9c2和H2O2誘導(dǎo)的H9c2兩組樣本中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達圖譜進行分析，如圖1所示。圖中“綠色”表示低相對表達，“紅色”表示高相對表達。箱式圖表示數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理后，所有l(wèi)ncRNA和mRNA的數(shù)據(jù)分布基本相同。散點圖中X軸和Y軸的值是兩組樣本數(shù)據(jù)歸一化后的平均值，綠色的線代表變化倍數(shù)（默認的變化倍數(shù)值是20）。結(jié)果顯示，正常H9c2細胞和H2O2處理的H9c2細胞中l(wèi)ncRNA的表達存在顯著差異，共有1 097個顯著失調(diào)的lncRNA，包括662個上調(diào)和435個下調(diào)的lncRNA。

2.2 差異表達基因的GO分析

GO分析包括生物過程分析、細胞成分分析和分子功能分析三個領(lǐng)域，如圖2所示。在生物過程分析中，單生物過程、單生物細胞過程以及生物調(diào)控是與下調(diào)mRNA相關(guān)的三個最重要的過程;而單個生物體的過程、自然調(diào)節(jié)和對刺激的反應(yīng)是與上調(diào)mRNA相關(guān)的三個最重要的過程。在細胞成分分析中，細胞外周、質(zhì)膜以及細胞外區(qū)是與下調(diào)mRNA相關(guān)的三個最重要的過程;而膜部分、膜和細胞外周的內(nèi)在組成部分與上調(diào)mRNA相關(guān)的三個最重要的過程。在分子功能分析中，結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)合以及離子結(jié)合是與下調(diào)mRNA相關(guān)的三個最重要的過程;而結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合和轉(zhuǎn)運蛋白活性是與上調(diào)mRNA相關(guān)的三個最重要的過程。

2.3 差異表達基因的通路分析

差異表達上調(diào)和下調(diào)的lncRNA的富集分析和通路分析如圖3。富集分析顯示，差異表達的lncRNA主要與細胞受體有關(guān)。通路分析鑒定了27條和51條由上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因靶向的基因通路。

2.4 共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

選取數(shù)個歸一化高表達、高倍數(shù)變化的mRNA，將其疊加在lncRNA-mRNA相關(guān)網(wǎng)絡(luò)上，以確定它們與lncRNA的關(guān)聯(lián)。差異顯著的基因被用于構(gòu)建lncRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖4所示。在網(wǎng)絡(luò)中，紅色節(jié)點代表顯著上調(diào)的基因，綠色節(jié)點代表顯著下調(diào)的基因，藍色節(jié)點表示lncRNA的編碼基因。

2.5 差異表達lncRNA的篩選和驗證

從下調(diào)和上調(diào)的差異lncRNA中分別選出10組差異顯著的lncRNA，如表1、表2所示。用RT-qPCR對lncRNA的表達進行驗證，如圖5所示。RT-qPCR結(jié)果顯示，在10組下調(diào)顯著的lncRNA中有2組與芯片結(jié)果一致，其余的無意義。在上調(diào)顯著的10組lncRNA中，RT-qPCR結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致，因此可能是氧化應(yīng)激的潛在治療靶點。*P<005，** P <001，*** P <0001。

2.6 討論

心臟疾病發(fā)病過程漫長，很難治愈，對人類健康造成了嚴重的威脅。隨著生活水平的提高，心臟疾病的患病率和死亡率逐年增加，心臟疾病會造成心肌細胞的凋亡[24-25]，而氧化應(yīng)激在心肌細胞凋亡過程中扮演著重要的角色[26-27]，因此研究氧化應(yīng)激狀態(tài)下心肌細胞凋亡的靶點尤為重要。

本研究使用基因芯片法，對兩組樣本的lncRNA和mRNA進行分析，篩選出1 097個差異表達的lncRNA，包括662個差異上調(diào)的lncRNA和435個差異下調(diào)的lncRNA。基因本體論分析顯示，這些差異表達的lncRNA可能與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而參與細胞的代謝;RT-qPCR結(jié)果顯示，在下調(diào)顯著的10個lncRNA中，只有Y08882_P1和BC085355_P1在兩組樣本中的表達與芯片結(jié)果一致，而上調(diào)顯著的10個lncRNA在兩組樣本中的表達均與芯片結(jié)果一致。

在動脈粥樣硬化中l(wèi)ncRNA有表達調(diào)控的作用[28-29]，通過與下游靶點的結(jié)合，從而調(diào)控與動脈粥樣硬化有關(guān)的基因的表達[30]。在分子功能分析中，結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合以及轉(zhuǎn)運蛋白活性是與上調(diào)基因相關(guān)的三個最重要的過程，這提示10組差異上調(diào)的lncRNA可能通過與下游蛋白結(jié)合繼而參與調(diào)控與心臟疾病有關(guān)基因的表達。

3 結(jié)論

本研究通過生物信息學(xué)和RT-qPCR等方法對樣本進行分析，最終篩選出10個可能與心臟疾病有關(guān)的lncRNA，可能是心臟疾病潛在的治療靶點，這為研究心臟疾病的機制提供了可靠的理論依據(jù)。本文還未詳細研究與10組上調(diào)lncRNA有關(guān)的下游靶基因，今后將重點研究其下游通路。

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Abstract：

In order to search for lncRNA related to heart disease under oxidative stress， the expression profiles of lncRNA and mRNA in normal cardiomyocytes and H2O2-induced cardiomyocytes were analyzed by microarray analysis. Then， the function of differentially expressed gene was explored through Gene Ontology （GO） and pathway analysis， and construct a lncRNA-mRNA co-expression network. Among the differentially expressed lncRNA， 10 lncRNA significantly differentially up-regulated and 10 down-regulated groups were selected for RT-qPCR verification. The results show that the expressions of lncRNA and mRNA were different in normal cardiomyocytes and in cardiomyocytes under oxidative stress. In the ten groups of significantly upregulated lncRNA， RT-qPCR detection results were consistent with the microarray results， indicating that they may be potential therapeutic targets for heart disease.

Keywords：

microarray; lncRNA; Go analysis; pathaway analysis; co-expression network; RT-qPCR