楊亞麗 ， 田 榮 ， 袁 茵 ， 王艷佳 ， 楊曉玲 △

（1寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2國家衛(wèi)生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3寧夏血管損傷與修復(fù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川750004）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是體內(nèi)甲硫氨酸和蛋氨酸循環(huán)的代謝產(chǎn)物，在正常情況下一般維持在較低的水平。目前研究已證實(shí)，高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）可以作為多種疾病如心腦血管疾病、腎損傷和腦卒中等的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］，尤其是冠心病和腦卒中等，其致病機(jī)制與促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、增加血小板聚集、損傷血管內(nèi)皮和激活免疫反應(yīng)等有關(guān)［2-3］。Ras 相關(guān)蛋白1（Ras-related protein 1，Rap1）是小分子 G 蛋白 Ras超家族成員之一，在各種因子刺激下，與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，對細(xì)胞的增殖、遷移和分化等進(jìn)行調(diào)控，已成為疾病防治的新靶標(biāo)［4］。Pei 等［5］發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）通過觸發(fā)腺苷酸環(huán)化酶激活gp91phox，而該過程涉及Rap1A 激活，提示Rap1A 通過免疫炎癥反應(yīng)參與了疾病的調(diào)控。但Rap1A 在Hcy 致巨噬細(xì)胞增殖及其在免疫應(yīng)答中的作用尚不清楚。本研究以ANA-1小鼠巨噬細(xì)胞為研究對象，探討Rap1A 在Hcy 致ANA-1 細(xì)胞增殖及M1 極化中的作用，為Hcy 相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑

ANA-1 小鼠巨噬細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)中心。Hcy（Sigma）；胎牛血清購自 Gibco；蛋白提取試劑盒和蛋白定量試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）；總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒（TaKa-Ra）；抗Rap1A 單克隆抗體和抗p27 單克隆抗體（Abcam）；抗增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體（Affinity）；EdU 染色試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司）；小鼠ELISA 檢測試劑盒（伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；Rap1A干擾腺病毒（Ad-shRNA/Rap1A）由漢恒生物科技有限公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。

2 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺（江蘇安泰）；CO2培養(yǎng)箱（Heraeus）；5415D 型微量臺式離心機(jī)（Eppendorf）；BS110S 型精密天平（Sartorius）；熒光定量PCR 儀、垂直電泳儀和Model 680全自動酶標(biāo)儀（Bio-Rad）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將ANA-1 細(xì)胞以1×106個接種于25T透氣培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清及1%青-鏈霉素的 RPMI-1640 培養(yǎng)液，于 37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔日換液，根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)約每瓶2×106個時傳代。用含終濃度100 μmol/L 的 Hcy 培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞 24 h，建立 HHcy 細(xì)胞模型，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 細(xì)胞分組及Rap1A 干擾腺病毒轉(zhuǎn)染 將3.1培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的細(xì)胞鋪于6 孔板，用100 μmol/L 的 Hcy 干預(yù) 24 h 后，記為 Hcy 組；正常對照（control）組僅加入等量的完全培養(yǎng)基；將10 μL 感染復(fù)數(shù)為100 的Ad-shRNA/Rap1A 及其陰性對照（AdshRNA/GFP），分別轉(zhuǎn)染至ANA-1 巨噬細(xì)胞后用100 μmol/L Hcy 處理，分別記為Hcy+Ad-shRNA/Rap1A組和Hcy+Ad-shRNA/GFP組；6 h后換正常培養(yǎng)基，由于腺病毒載體中含有GFP基因，48 h 后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.3 CCK-8 檢測ANA-1 細(xì)胞活力 取指數(shù)增殖期的ANA-1 細(xì)胞接種于96 孔板（每孔3×103個）。將培養(yǎng)板放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)孵育過夜，待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時，用100 μmol/L Hcy 刺激24 h 后，分別向 96 孔板每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm 處的吸光度（A）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.4 EdU 染色法檢測細(xì)胞增殖 細(xì)胞處理方法同3.3，將處理后的細(xì)胞按照每孔1×104的密度接種到24 孔板，刺激24 h 后，根據(jù)EdU 染色試劑盒檢測DNA 增殖活性，向細(xì)胞中加入 50 μmol/L EdU 試劑，孵育 2 h 后，PBS 洗掉未滲入 DNA 的 EdU 并加入 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS 洗除固定液，加入Apollo 染液室溫避光孵育30 min，PBS 洗除染液并用Hochest染核30 min。于熒光顯微鏡觀察并隨機(jī)獲取5個視野的熒光圖像，采用ImageJ軟件對EdU陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5 RT-qPCR 檢測 mRNA 表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后，收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，測定樣品純度與濃度后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在NCBI查詢各基因的CDS，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，序列見表1。以cDNA 為模板擴(kuò)增各目的基因，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40 個循環(huán)，最后延伸10 min。目的基因的相對表達(dá)用2-ΔΔCt法分析。

表1 CD80、CD86、CD163、CD200R、Rap1A、PCNA、p27及GAPDH的引物序列Table 1. Primer sequences of CD80，CD86，CD163，CD200R，Rap1A，PCNA，p27 and GAPDH

3.6 Western blot 檢測 p27、PCNA 和 Rap1A 蛋白的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測樣品中的蛋白濃度，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗膜10 min×3次，加入Ⅰ抗（p27、PCNA、Rap1A和β-actin 抗體，均按1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，次日回收Ⅰ抗，PBST 洗膜 10 min×3 次，再加入 HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，充分洗膜后，加入ECL 發(fā)光液，顯色、曝光，保存圖片，以β-actin 為內(nèi)參照，Image Lab軟件進(jìn)行定量分析。

3.7 ELISA法檢測炎癥因子IL-6和TNF-α濃度 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA 說明書，在包被IL-6和TNF-α 抗體的96 孔板中前2 列每孔依次加入100 μL 標(biāo)準(zhǔn)工作液，其他每孔加入 100 μL 待測樣品，給酶標(biāo)板覆膜，37 ℃孵育90 min。將25×的濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋后進(jìn)行洗滌，隨后每孔加入100 μL 生物素抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗滌后每孔加入100 μL酶結(jié)合工作液，進(jìn)行孵育和洗滌，加入顯色劑90 μL，混勻后37 ℃孵育30 min，最后每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，450 nm波長處檢測各孔吸光度（A）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞內(nèi)IL-6和TNF-α的濃度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。先評估數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布，再進(jìn)行正態(tài)分布數(shù)據(jù)的方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的兩組數(shù)據(jù)采用非配對t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)的單因素比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Hcy對ANA-1細(xì)胞增殖的影響

ANA-1 細(xì) 胞 經(jīng) 100 μmol/L Hcy 刺 激 24 h 后 ，CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Hcy 組的吸光度顯著高于control組（P＜0.05），見圖1A；EdU 染色結(jié)果顯示，Hcy 組EdU 摻入 ANA-1 細(xì)胞核的量最多（P＜0.01），見圖1B。

2 ANA-1 細(xì)胞中 p27 和 PCNA 的 mRNA 及蛋白表達(dá)變化

RT-qPCR 及 Western blot 結(jié)果顯示，與 control 組相比，Hcy 組 p27 的 mRNA 及蛋白水平明顯降低（P＜0.05），PCNA 的 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），見圖2。以上數(shù)據(jù)均表明Hcy促進(jìn)ANA-1巨噬細(xì)胞增殖。

3 ANA-1細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6和TNF-α濃度

ELISA 結(jié)果顯示，與 control 相比，Hcy 組 ANA-1細(xì)胞分泌IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05），見圖3。這提示Hcy 促進(jìn)ANA-1 細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子IL-6和TNF-α。

4 Hcy對ANA-1細(xì)胞M1和M2極化標(biāo)志物的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與 control 相比，Hcy 組細(xì)胞的 M1 表型標(biāo)志物 CD80 和 CD86 的 mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.05），見圖4A、B，而M2 表型標(biāo)志物CD163和CD200R 的 mRNA 表達(dá)顯著減少（P＜0.05），見圖4C、D，提示Hcy可有效促進(jìn)ANA-1細(xì)胞M1極化。

Figure 1. Effects of Hcy on the proliferation of ANA-1 cells were detected by CCK-8 assay（A）and EdU staining（B；×200）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 Hcy對ANA-1細(xì)胞增殖能力的影響

Figure 2. Expression of p27 and PCNA in Hcy-treated ANA-1 macrophages. RT-qPCR（A）and Western blot（B）were used to detect the expression of p27 and PCNA. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 Hcy處理的ANA-1細(xì)胞中p27和PCNA的表達(dá)情況

Figure 3. Effects of Hcy on the production of inflammatory cytokines from ANA-1 cells. A：the level of interleukin-6（IL-6）；B：the level of tumor necrosis factor-α（TNF-α）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 Hcy對ANA-1細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子的影響

Figure 4. Effects of Hcy on the polarization of ANA-1 cells. A and B：the mRNA levels of CD80 and CD86（M1 polarization markers）；C and D：the mRNA levels of CD163 and CD200R（M2 polarization markers）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 Hcy對ANA-1細(xì)胞M1和M2極化標(biāo)志物的影響

5 Rap1A在ANA-1細(xì)胞中的表達(dá)變化

RT-qPCR 和 Western blot 結(jié)果顯示，與 control 組相比，Hcy組Rap1A的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），見圖5。以上結(jié)果說明，Hcy 能夠促進(jìn)Rap1A在ANA-1巨噬細(xì)胞中表達(dá)。

Figure 5. Effects of Hcy on the expression of Rap1A in ANA-1 cells. RT-qPCR（A）and Western blot（B）were used to detect the expression of Rap1A. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 Hcy對ANA-1細(xì)胞中Rap1A表達(dá)的影響

6 Rap1A在Hcy誘導(dǎo)的ANA-1細(xì)胞增殖中的作用

為進(jìn)一步驗(yàn)證Rap1A 是否調(diào)控Hcy 誘導(dǎo)的ANA-1 細(xì)胞增殖過程，將ANA-1 巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染AdshRNA/Rap1A，熒光顯微鏡觀察感染效率達(dá)80%以上收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)（圖6A）；RT-qPCR 和Western blot 檢測ANA-1細(xì)胞中Rap1A被干擾后自身表達(dá)的改變，結(jié)果如圖6B、C 所示，ANA-1 細(xì)胞AdshRNA/Rap1A 轉(zhuǎn)染成功。通過 CCK-8 實(shí)驗(yàn)和 EdU 染色檢測ANA-1 細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，與Hcy+Ad-shRNA/GFP 組相比，Hcy+Ad-shRNA/Rap1A 組細(xì)胞增殖能力減弱，EdU 陽性細(xì)胞摻入量減少（P＜0.01），見圖6D、E。進(jìn)一步使用RT-qPCR 和Western blot 檢測增殖相關(guān)蛋白p27 和PCNA 的表達(dá)改變，結(jié)果顯示，與Hcy+Ad-shRNA/GFP 組相比，Hcy+AdshRNA/Rap1A 組細(xì)胞中 p27 的表達(dá)增加，PCNA 的表達(dá)降低（P＜0.05 或P＜0.01），見圖7。該結(jié)果表明敲減Rap1A表達(dá)可緩解Hcy引起的ANA-1細(xì)胞增殖。

7 敲減Rap1A表達(dá)后ANA-1細(xì)胞M1及M2極化標(biāo)志物的變化情況

為進(jìn)一步明確Hcy 通過Rap1A 調(diào)控ANA-1 細(xì)胞的M1 極化，在ANA-1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ad-shRNA/Rap1A后，RT-qPCR 檢測 M1 和 M2 極化標(biāo)志物的 mRNA 水平。檢測結(jié)果顯示，與Hcy+Ad-shRNA/GFP 組相比，Hcy+Ad-shRNA/Rap1A 組的 M1 極化標(biāo)志物 CD80 和CD86 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05），見圖8A、B，M2 極化標(biāo)志物CD200R 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而 CD163 表達(dá)無明顯變化，見圖8C、D。該結(jié)果表明敲減Rap1A表達(dá)能夠抑制ANA-1 細(xì)胞發(fā)生 M1 極化，說明 Hcy 通過 Rap1A 調(diào)控 ANA-1 細(xì)胞的M1極化。

Figure 6. Effect of Rap1A knockdown on the proliferation of ANA-1 cells. A：fluorescence microscopic observation of Ad-shRNA/Rap1A infection efficiency（×200）；B and C：RT-qPCR and Western blot were used to detect the expression of Rap1A in ANA-1 cells transfected with Ad-shRNA/Rap1A；D and E：CCK-8 assay and EdU staining（×200）were used to detect the effect of Rap1A on the proliferation of ANA-1 cells. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Hcy+Ad-shRNA/GFP group.圖6 敲減Rap1A表達(dá)對ANA-1細(xì)胞增殖的影響

討 論

Figure 7. Effects of Rap1A knockdown on the expression of proliferation-related proteins in ANA-1 cells. RT-qPCR（A and B）and Western blot（C and D）were used to detect the expression of p27（A and C）and PCNA（B and D）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs Hcy+Ad-shRNA/GFP group.圖7 敲減Rap1A的表達(dá)對ANA-1細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Hcy 是一種在必需氨基酸甲硫氨酸代謝過程中形成的含硫氨基酸。正常情況下，血清Hcy 水平低于 5 μmol/L，當(dāng)血清 Hcy 水平超過 15 μmol/L 時被稱為HHcy［6］。Hcy 被認(rèn)為是動脈粥樣硬化和心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［7-8］。Hcy有2種代謝途徑，即轉(zhuǎn)硫途徑和轉(zhuǎn)甲基途徑，這也是Hcy 致病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，其中，Hcy 通過轉(zhuǎn)硫途徑引起的氧化應(yīng)激和免疫應(yīng)答是Hcy 的致病機(jī)制之一［9］。由于巨噬細(xì)胞增殖和吞噬脂質(zhì)變成泡沫細(xì)胞是As 的重要環(huán)節(jié)［10］，因此探討Hcy 在巨噬細(xì)胞增殖中的機(jī)制具有重要的意義。本研究以ANA-1 巨噬細(xì)胞細(xì)胞為研究對象，以100 μmol/ L Hcy 刺激 ANA-1 巨噬細(xì)胞 24 h，成功構(gòu)建巨噬細(xì)胞增殖模型。巨噬細(xì)胞增殖能力的增強(qiáng)與多種增殖基因表達(dá)的變化有關(guān)。p27 是細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控分子，能夠阻礙多種cyclin分子與激酶形成復(fù)合體，進(jìn)而阻礙細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞增殖［11］，PCNA 既是細(xì)胞核內(nèi)DNA 多聚酶δ的輔因子、也是細(xì)胞周期發(fā)展的正性調(diào)控蛋白，能夠加速DNA 復(fù)制及細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖［12］。結(jié)果顯示Hcy刺激ANA-1巨噬細(xì)胞后，p27的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，而PCNA的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可通過吞噬外來微生物并提呈抗原［13］，在維持機(jī)體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡、對抗炎癥反應(yīng)、防御修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的可塑性，在不同的局部微環(huán)境下極化為不同的亞型，促炎的M1 型，即經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞；抗炎的M2型，即替代活化巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞這種不同表型的轉(zhuǎn)換調(diào)控者炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸［14］。CD80、CD86 和MHCⅡ等細(xì)胞表面分子在M1 型巨噬細(xì)胞高表達(dá)，M1 型細(xì)胞激活后可以分泌TNF-α 和IL-6 等炎癥因子，通過產(chǎn)生趨化因子激活Th1 型免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)［15］；而CD200R、CD163 和 CCL13 等細(xì)胞表面分子在 M2 型巨噬細(xì)胞高表達(dá)，M2 型細(xì)胞激活后釋放大量抑炎型細(xì)胞因子如IL-4 和IL-10 等，激活Th2 型免疫反應(yīng)，促進(jìn)炎癥的消除和組織損傷修復(fù)［16］，本研究結(jié)果顯示，M1 型巨噬細(xì)胞表面分子CD80 和CD86 的表達(dá)也明顯增加，而M2 型細(xì)胞表面分子CD200R 和CD163表達(dá)顯著降低，表明Hcy 能夠促進(jìn)ANA-1 巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，并誘導(dǎo)其發(fā)生M1極化。

Figure 8. Effects of Rap1A knockdown on M1 and M2 polarization of ANA-1 cells. A and B：the mRNA levels of CD80 and CD86（M1 polarization markers）；C and D：the mRNA levels of CD163 and CD200R（M2 polarization markers）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs Hcy+Ad-shRNA/GFP group.圖8 敲減Rap1A表達(dá)對ANA-1細(xì)胞M1及M2極化標(biāo)志物表達(dá)的影響

Rap是腫瘤基因家族成員之一，廣泛分布于各種組織細(xì)胞中，與細(xì)胞的增殖、極性的形成、分化、粘附、運(yùn)動等多種生物學(xué)功能密切相關(guān)［17-18］。Rap 是一種小GTP酶，可以通過活性改變調(diào)控其功能［19］。Rap家族有兩個亞類，Rap1 和Rap2，其中Rap1 有含有2個亞型，Rap1A 和Rap1B，二者序列存在95%的同源性［20］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 抑制 Rap1A 的表達(dá)則能促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，表明Rap1A 參與細(xì)胞的增殖過程［21］。另有研究發(fā)現(xiàn)，PI3 激酶 γ 促進(jìn) Rap1A 介導(dǎo)的髓系細(xì)胞整合素α4β1 活化，導(dǎo)致腫瘤炎癥和生長［22］；HBV 感染通過上調(diào) miR-203a 從而靶向抑制Rap1A 的表達(dá)，影響 PI3K/ERK/p38/NFκB 通路，誘發(fā)肝炎，提示Rap1A 參與了機(jī)體的免疫應(yīng)答過程［23］。本研究結(jié)果顯示：Hcy 干預(yù)ANA-1 巨噬細(xì)胞后，Rap1A 的表達(dá)明顯增加，表明Rap1A 可能參與Hcy導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答過程。為了進(jìn)一步明確Rap1A 在Hcy 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖和極化中的作用，我們將Rap1A干擾腺病毒轉(zhuǎn)染至ANA-1 巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾Rap1A的表達(dá)不僅可以逆轉(zhuǎn)由Hcy 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖，還可以使M1 型巨噬細(xì)胞表面分子CD80 和CD86 的表達(dá)減少，M2 型細(xì)胞表面分子CD200R 表達(dá)顯著增加，但M2 標(biāo)志物CD163 表達(dá)無明顯變化，表明Rap1A 是Hcy 致巨噬細(xì)胞增殖及M1極化的重要機(jī)制。

綜上所述，Hcy 能夠促進(jìn)ANA-1 巨噬細(xì)胞增殖和M1 極化，其機(jī)制可能與Hcy 上調(diào)Rap1A 的表達(dá)有關(guān)，我們的研究提示，以Rap1A 為靶標(biāo)調(diào)控巨噬細(xì)胞的增殖與炎癥反應(yīng)，可能對臨床HHcy相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。