邢曉旭，張宗山，趙瑩瑩，張馨慧，曾丹丹，趙玉珠，張 旭

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

腹瀉是臨床常見疾病，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，也是制約畜牧業(yè)發(fā)展因素[1]，引起腹瀉原因包括細(xì)菌性腹瀉、病毒性腹瀉、寄生蟲性腹瀉及非傳染性腹瀉，預(yù)防和治療難度大[2]。因此尋找一種非特異性止瀉藥物成為目前亟待解決的問(wèn)題之一。

中草藥在腹瀉病防控方面具有一定潛力，多種傳統(tǒng)單味中藥及方劑已被證明具有澀腸止瀉作用[3]。同時(shí)，中藥在治療豬腹瀉病上具有副作用小、耐藥性低、藥物無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)[4]。甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflataBat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabraL.）干燥根和根莖，味甘性平，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳等功效，可與其他藥物連用止瀉[5]。異甘草素作為甘草提取物，已證明具有抗菌、抗病毒和增強(qiáng)免疫、減輕炎癥作用[6-7]。因此，異甘草素作為一種非特異性抗腹瀉藥物應(yīng)用前景良好。

中藥治療疾病是“多成分、多途徑、多靶標(biāo)”協(xié)同作用，無(wú)法從單一方面闡明其治療疾病的具體機(jī)制[8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門新興學(xué)科，通過(guò)整合多種組學(xué)、高通量篩選、分子交互驗(yàn)證、網(wǎng)絡(luò)可視化分析等相關(guān)技術(shù)揭示“藥物-基因-靶標(biāo)-疾病”之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，闡明藥物作用機(jī)理，已成為研究創(chuàng)新藥物重要途徑。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過(guò)整理歸納現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中信息，分析中藥與疾病之間相互關(guān)系[9]。

本研究利用蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉模型評(píng)價(jià)異甘草素抗腹瀉活性，再利用網(wǎng)絡(luò)藥理研究方法探討異甘草素治療腹瀉關(guān)鍵靶標(biāo)，基于分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證異甘草素與靶標(biāo)結(jié)合作用，揭示異甘草素治療腹瀉潛在分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)所用昆明白鼠購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)，雌雄各半。

1.2 試驗(yàn)藥品

異甘草素標(biāo)準(zhǔn)品（PHLC≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；蓖麻油（貨號(hào)：C6770）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉

取昆明白鼠50只，體重為18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，每組10只，灌胃給藥，試驗(yàn)分為空白對(duì)照組、腹瀉對(duì)照組、異甘草素（50mg.kg-1）低劑量組、異甘草素（100 mg.kg-1）中劑量組和異甘草素（200 mg.kg-1）高劑量組。試驗(yàn)前24 h禁食，異甘草素低、中、高劑量組分別口服灌胃異甘草素0.2 mL，空白對(duì)照組和腹瀉對(duì)照組口服灌胃含0.1%DMSO生理鹽水0.2 mL。0.5 h后，分別灌胃0.2 mL蓖麻油，空白對(duì)照組灌胃0.2 mL生理鹽水，試驗(yàn)觀察6 h，記錄各組小鼠精神和生理狀態(tài)及各組小鼠初次腹瀉時(shí)間和次數(shù)。

另取50只昆明白鼠，體重為18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，試驗(yàn)分組與處理方式同上，用適量碳粉代替蓖麻油灌胃，1.5 h后處死小鼠，記錄并計(jì)算各組小鼠腸道內(nèi)碳粉推進(jìn)比。

腸道碳粉推進(jìn)比計(jì)算公式為：推進(jìn)比=碳粉推進(jìn)長(zhǎng)度/腸管總長(zhǎng)度×100%。

1.3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.3.2.1 異甘草素及腹瀉疾病靶標(biāo)的檢索

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，https://www.tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索與異甘草素相關(guān)靶標(biāo)。將“Diarrhea”作為檢索詞，在GeneCards在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）中檢索腹瀉已知相關(guān)疾病靶點(diǎn)，得到腹瀉疾病靶點(diǎn)。將異甘草素相關(guān)蛋白與腹瀉相關(guān)靶標(biāo)作對(duì)比，尋找兩者交集靶標(biāo)，確定異甘草素治療腹瀉潛在靶點(diǎn)。

1.3.2.2 PPI靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用STRING平臺(tái)（https://string-db.org/）構(gòu)建交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），分析異甘草素治療腹瀉靶標(biāo)相互關(guān)系。將所有交集蛋白導(dǎo)入至STRING平臺(tái)，選擇“多重蛋白”分析，物種選擇為“mus”，根據(jù)結(jié)果選擇編碼相應(yīng)蛋白基因名稱，生成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，分析網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)度及蛋白富集系數(shù)，確定異甘草素治療腹瀉中調(diào)控關(guān)鍵蛋白。

1.3.2.3 基因本體論（Geneontology，GO）分析

將篩選出的交集靶點(diǎn)基因?qū)隬ebGestalt在線工具，對(duì)交集靶點(diǎn)作GO富集分析，將物種與背景設(shè)定為“mus”，根據(jù)P＜0.05描述蛋白質(zhì)顯著程度，分析交集靶標(biāo)所集中的生物學(xué)過(guò)程，探討異甘草素治療腹瀉所影響的分子通路。

1.3.2.4 KEGG通路富集分析

與GO分析原理相同，將篩選出的靶點(diǎn)導(dǎo)入WebGestalt在線工具，對(duì)交集靶點(diǎn)作KEGG富集分析，將物種與背景設(shè)定為“mus”，根據(jù)P＜0.05描述顯著程度，得到異甘草素治療腹瀉疾病主要作用通路，分析顯著通路。

1.3.3 分子對(duì)接

在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www1.rcsb.org/）檢索關(guān)鍵蛋白晶體結(jié)構(gòu)，利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索異甘草素3D結(jié)構(gòu)。利用Discovery situido 2016作分子對(duì)接，采用C-CDOCK半柔性對(duì)接，計(jì)算異甘草素與關(guān)鍵靶標(biāo)相互作用潛在結(jié)合構(gòu)想和結(jié)合能，確定潛在異甘草素與關(guān)鍵靶標(biāo)相互作用模式。

1.3.4 熒光定量PCR

取昆明白鼠10只，體重為18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分成兩組，每組5只，分別為健康對(duì)照組、異甘草素組。異甘草素組口服灌胃0.2 mL 200 mg.kg-1異甘草素溶液，對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。6 h后，處死小鼠，取各小鼠腸段組織研磨，利用RNA提取試劑盒提取組織中RNA，再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)NovoStart?SYBRqPCR SuperMix Plus法實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)作qPCR。所用引物見表1。將上述體系加于0.1 mL八聯(lián)管內(nèi)，混勻后瞬離上機(jī)。反應(yīng)體系為：水（RNase-Free ddH2O）5μL，上、下游引物（10μmol.L-1）各0.5μL，預(yù)混染料（NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus）10μL，模板（cDNA）4μL，共計(jì)20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30 s；95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；92℃5 s，60℃1 min，95℃continues；50℃30 s。反應(yīng)結(jié)束后，讀取Ct值，運(yùn)用ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。確定異甘草素對(duì)MAPK14、NCOA2、PPARG和ESR1基因表達(dá)的影響。

表1 熒光定量PCR引物Table1 Primersfor quantitative PCR reactions

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均開展3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，使用Excel 2016和SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＞0.05表示無(wú)顯著性差異，不標(biāo)記；0.01＜P＜0.05表示顯著性差異，以*標(biāo)記；P＜0.01表示極顯著性差異，以**標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 異甘草素對(duì)蓖麻油小鼠腹瀉的治療作用

本研究通過(guò)蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉模型評(píng)價(jià)異甘草素抗腹瀉作用，腹瀉對(duì)照組小鼠試驗(yàn)開始后6 h精神沉郁，不喜運(yùn)動(dòng)，四肢蜷縮，小鼠被毛粗亂；用藥組小鼠精神狀態(tài)良好，生理狀態(tài)正常，與空白對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。如圖1所示，與腹瀉對(duì)照組相比，異甘草素顯著降低小鼠腹瀉次數(shù)（P＜0.05），延緩小鼠初次腹瀉時(shí)間（P＜0.05），且呈一定劑量依賴。同時(shí)，與腹瀉對(duì)照組相比，異甘草素還可顯著抑制腸道蠕動(dòng)（P＜0.05），延緩碳粉推進(jìn)距離，減少腹瀉發(fā)生。試驗(yàn)結(jié)果表明異甘草素對(duì)蓖麻油誘導(dǎo)小鼠腹瀉具有良好治療作用。

圖1 異甘草素對(duì)蓖麻油誘導(dǎo)的小鼠腹瀉治療作用Fig.1 Effect of isoliquiritigenin on castor oil induced diarrhea in mice

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

基于數(shù)據(jù)檢索，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中共找到與異甘草素相關(guān)蛋白靶標(biāo)34個(gè)，在GeneCards在線數(shù)據(jù)庫(kù)共找到與腹瀉相關(guān)靶標(biāo)蛋白5 686個(gè)，其中交集靶標(biāo)共計(jì)14個(gè)，蛋白名稱如表2所示。這些交集靶標(biāo)與腹瀉的發(fā)生和異甘草素均具有一定相關(guān)性，可能是異甘草素治療腹瀉的靶標(biāo)。

表2 交集靶標(biāo)信息Table 2 Intersection target information

將上述交集蛋白名稱導(dǎo)入至STRING平臺(tái)，通過(guò)STRING平臺(tái)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，種屬選擇為“mus”。試驗(yàn)結(jié)果見圖2，共有4個(gè)蛋白與其他蛋白無(wú)關(guān)聯(lián)，其余蛋白與網(wǎng)絡(luò)中其他蛋白均產(chǎn)生緊密相關(guān)性，網(wǎng)絡(luò)中蛋白節(jié)點(diǎn)數(shù)為13，網(wǎng)絡(luò)預(yù)期邊數(shù)為5，共產(chǎn)生17條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為2.62，PPI富集P值為1.11×10-5，表明網(wǎng)絡(luò)中蛋白與蛋白高度關(guān)聯(lián)，其中有絲分裂活化蛋白激酶14（MAPK14）、核受體輔活化因子2（NCOA2）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）及雌激素受體1（ESR1）在PPI中節(jié)點(diǎn)數(shù)最高，為關(guān)鍵蛋白。異甘草素可能通過(guò)影響上述4個(gè)關(guān)鍵蛋白活性或調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響整個(gè)網(wǎng)絡(luò)，達(dá)到治療腹瀉目的。

圖2 交集靶標(biāo)蛋白互作圖Fig.2 PPI of intersection target

2.3 KEGG分析

對(duì)上述靶標(biāo)基因作富集分析，KEGG分析結(jié)果見圖3，這些蛋白主要參與成纖維細(xì)胞增值通路調(diào)節(jié)、平滑肌細(xì)胞凋亡過(guò)程調(diào)節(jié)及應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，表明異甘草素可能通過(guò)上述基因通路和生物學(xué)過(guò)程，達(dá)到治療腹瀉目的。

圖3 KEGG分析Fig.3 KEGG analysis

2.4 GO分析

對(duì)異甘草素治療腹瀉的相關(guān)靶標(biāo)作GO基因富集分析，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，不同顏色分別代表不同富集類別，紅色代表生物學(xué)過(guò)程、藍(lán)色代表細(xì)胞成分、綠色代表分子功能。

圖4 GO分析Fig.4 GO analysis

結(jié)果表明這些靶標(biāo)基因與應(yīng)激反應(yīng)、生物學(xué)運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞信息傳遞等生物學(xué)過(guò)程緊密聯(lián)系。同時(shí)，這些靶標(biāo)基因參與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核物質(zhì)調(diào)控，與蛋白互作及細(xì)胞信息傳遞高度相關(guān)。

2.5 分子對(duì)接

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，找到異甘草素治療腹瀉的4個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)，分別為MAPK14、NCOA2、PPARG以及ESR1。通過(guò)分子對(duì)接分析異甘草素與4個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)結(jié)合作用。如圖5所示，異甘草素分別有效占據(jù)4個(gè)蛋白活性腔內(nèi)，異甘草素在該結(jié)構(gòu)域內(nèi)與底物存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，抑制蛋白功能。異甘草素與4個(gè)蛋白結(jié)合能分別為-30.25、-42.65、-37.64和-46.56 KJ.mol-1。表明異甘草素可自發(fā)與4種蛋白產(chǎn)生結(jié)合，是靶標(biāo)潛在競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。

2.6 異甘草素對(duì)靶標(biāo)基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證異甘草素與關(guān)鍵靶標(biāo)關(guān)系，利用熒光定量PCR檢測(cè)異甘草素對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)基因表達(dá)的影響。異甘草素顯著下調(diào)MAPK14、NCOA2、PPARG及ESR1基因表達(dá)，結(jié)果見圖6。表明異甘草素通過(guò)影響關(guān)鍵靶標(biāo)基因表達(dá)調(diào)控腹瀉相關(guān)通路，達(dá)到治療腹瀉的作用。

圖6 異甘草素對(duì)關(guān)鍵靶標(biāo)基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of isoglycyrrhizin on the expression of key target genes

3 討論

異甘草素具有良好抗腹瀉效果，可顯著降低腹瀉次數(shù)，延緩初次腹瀉時(shí)間，作為一種非特異性抗腹瀉藥物具有一定開發(fā)前景[10-11]。為更好探究異甘草素抗腹瀉作用機(jī)制，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法尋找異甘草素治療腹瀉關(guān)鍵蛋白。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是借助網(wǎng)絡(luò)研究藥物-靶標(biāo)-疾病之間關(guān)系，基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)信息再次整合，挖掘藥物治療疾病藥理作用的研究方法[12]。本研究探討異甘草素治療腹瀉的關(guān)鍵靶標(biāo)和關(guān)鍵通路，結(jié)果表明MAPK14、NCOA2、PPARG和ESR1可能是異甘草素治療腹瀉關(guān)鍵蛋白。同時(shí)，本研究利用熒光定量技術(shù)確定異甘草素對(duì)上述關(guān)鍵靶標(biāo)基因的影響。白東東等利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析白頭翁治療腹瀉分子機(jī)制，確定雌激素受體1（Estrogen receptor，ESR1）、CREB結(jié)合蛋白（CREB binding protein，CREBBP）等gned45個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)[13]，與本研究結(jié)果相似。在異甘草素治療腹瀉關(guān)鍵靶標(biāo)中，MAPK14在結(jié)腸炎中具有重要調(diào)節(jié)作用，研究表明蓖麻油可對(duì)腸黏膜產(chǎn)生強(qiáng)烈刺激，引起腸道炎癥導(dǎo)致動(dòng)物腹瀉[14]。此外，研究表明NCOA2參與腸道膽汁酸相關(guān)通路調(diào)節(jié)，與結(jié)腸炎發(fā)生和發(fā)展相關(guān)[15]。PPARG主要存在3個(gè)亞型，多在脂肪組織內(nèi)表達(dá)，參與膽固醇和脂質(zhì)代謝等生物學(xué)過(guò)程，對(duì)腸道內(nèi)微環(huán)境有一定調(diào)節(jié)作用，與腹瀉發(fā)生相關(guān)[16]。分子對(duì)接技術(shù)是目前篩選和設(shè)計(jì)靶向性藥物的有效手段，為藥物研發(fā)提供重要數(shù)據(jù)支撐和試驗(yàn)依據(jù)。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)進(jìn)行分子對(duì)接已成為藥物研發(fā)主要途徑[17]。在本研究中利用Discovery Stiudio 2016進(jìn)行半柔性對(duì)接，小分子可根據(jù)鍵轉(zhuǎn)角合理改變構(gòu)象，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。分子對(duì)接結(jié)果顯示異甘草素能夠有效與MAPK14、NCOA2、PPARG以及ESR1產(chǎn)生結(jié)合，結(jié)合能均為負(fù)值，說(shuō)明異甘草素可通過(guò)抑制上述關(guān)鍵靶標(biāo)活性影響腹瀉相關(guān)生物學(xué)通路，治療腹瀉。

KEGG和GO基因富集分析是分析“藥物-靶標(biāo)-通路”有效手段，KEGG分析結(jié)果表明交集蛋白與成纖維細(xì)胞增值的信號(hào)通路調(diào)節(jié)高度相關(guān)，成纖維細(xì)胞是疏松結(jié)締組織的重要細(xì)胞成分，對(duì)維持黏膜固有層和黏膜下層結(jié)構(gòu)具有重要生理作用[18]。表明異甘草素可通過(guò)調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖維持腸道管壁結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，防止腹瀉發(fā)生。GO分析結(jié)果顯示交集靶標(biāo)與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，而造成腹瀉原因之一是機(jī)體對(duì)環(huán)境改變而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[19]，表明異甘草素可通過(guò)控制應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生降低機(jī)體發(fā)生腹瀉情況。GO分析結(jié)果顯示異甘草素與離子之間相互作用有關(guān)，造成腹瀉發(fā)生最直接原因是腸道內(nèi)無(wú)機(jī)鹽離子失衡，異甘草素可通過(guò)抑制關(guān)鍵蛋白，引起相關(guān)基因表達(dá)，輻射至整個(gè)信號(hào)通路，影響胃腸道內(nèi)環(huán)境，延緩腹瀉發(fā)生?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究，表明異甘草素可能通過(guò)維持腸道內(nèi)環(huán)境，降低炎癥反應(yīng)，起抗腹瀉作用。

綜上所述，異甘草素作為抗腹瀉藥物具有良好開發(fā)前景。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，分析異甘草素治療腹瀉的潛在靶標(biāo)及可能影響的生物學(xué)過(guò)程，初步探討其抗腹瀉分子機(jī)制，為后續(xù)異甘草素抗腹瀉研究奠定理論基礎(chǔ)。