陳 旭，沈春洋，莫福磊，呂 瑞，李鑫茂，豆志滔，王傲雪*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

番茄是世界主要經(jīng)濟(jì)作物之一，原產(chǎn)自南美洲且在我國(guó)廣泛種植。近年來，低溫、干旱、極端高溫等非生物脅迫是制約番茄產(chǎn)量的重要因素，通過分子手段發(fā)掘番茄抗逆優(yōu)質(zhì)基因是解決這一難題的可行辦法[1]。油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroid，BR）是新型植物內(nèi)源激素,且是第一個(gè)被分離出具有活性的油菜素甾族化合物，可將植物體內(nèi)存在的抗逆潛能充分激發(fā)，使其通過內(nèi)部調(diào)節(jié)減緩植物遭遇各種不利外界環(huán)境時(shí)受到的傷害[2-3]。BZR（Brassinazole resistant）是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，作用于BR信號(hào)通路下游，主要通過調(diào)控一些響應(yīng)BR的相關(guān)基因表達(dá)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育并參與植物逆境應(yīng)答反應(yīng)[4]。Yin等在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)并鑒定得到BZR基因家族[5]。有報(bào)道稱BZR1蛋白在其N末端存在一個(gè)非典型螺旋-環(huán)-螺旋（Basic helix-loop-helix，bHLH）DNA結(jié)合基序（即BZR結(jié)構(gòu)域），可結(jié)合E-box結(jié)構(gòu)（CANNTG）或BRRE元件，誘導(dǎo)或者抑制靶基因表達(dá)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，BES1（BRI1-EMS-suppressor 1）也是一種轉(zhuǎn)錄因子，且和BZR1被劃分為同一個(gè)家族；二者DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相似性較高，因此BES1在植物BR信號(hào)通路中也同樣發(fā)揮關(guān)鍵作用，該基因主要調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育及一系列脅迫反應(yīng)[8]。

擬南芥中響應(yīng)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄因子RD26是BES1蛋白靶基因。當(dāng)RD26過表達(dá)時(shí)抑制BR信號(hào)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)，在擬南芥中，轉(zhuǎn)錄因子RD26與BES1存在相互作用，RD26過表達(dá)時(shí)抑制BES1在BR調(diào)節(jié)中的活性，負(fù)調(diào)控植物響應(yīng)干旱脅迫[9]。Saha等在白菜中發(fā)現(xiàn)15個(gè)BZR基因，對(duì)白菜冷處理后發(fā)現(xiàn)，BrBEH4在冷敏感白菜品種和耐冷白菜品種中表達(dá)模式不同，且證實(shí)BrBZR可能是調(diào)節(jié)CBF冷應(yīng)答途徑的一種轉(zhuǎn)錄激活因子，提高白菜耐冷性[10]。高溫脅迫主要損害植物葉綠體和線粒體功能，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧（ROS）過度積累，造成氧化損傷。Yin等在番茄中發(fā)現(xiàn)BZR1-like蛋白調(diào)控BR反應(yīng)，并通過調(diào)節(jié)FERONIA（FER）同系物提高番茄耐熱性[5]。CRISPR-bzr1突變體植株顯示生長(zhǎng)減慢，且對(duì)EBR不敏感。BZR1突變損害RBOSH1誘導(dǎo)、抑制質(zhì)外體中H2O2產(chǎn)生和耐熱性減弱。而BZR1過表達(dá)則增強(qiáng)質(zhì)外體H2O2產(chǎn)生和高溫應(yīng)答能力，得出BZR1是番茄耐高溫關(guān)鍵基因[11]。

目前，在番茄中對(duì)于BZR轉(zhuǎn)錄因子家族研究相對(duì)較少。本研究利用生物信息學(xué)手段，綜合分析BZR基因家族生物學(xué)特征和表達(dá)模式，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析番茄BZR基因在不同脅迫條件下表達(dá)情況，為BZR基因?qū)Ψ涯婢趁{迫響應(yīng)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

本試驗(yàn)選用番茄材料為AC（Ailsa Craig）；選取顆粒飽滿種子，播種于基質(zhì)土：蛭石為3∶1栽培基質(zhì)中，常規(guī)栽培管理，光周期為16 h/8 h。當(dāng)番茄生長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，作低溫脅迫、干旱脅迫、高溫脅迫及鹽脅迫。低溫脅迫處理?xiàng)l件為：4°C處理0、1、6、12和24 h；干旱脅迫處理?xiàng)l件為：濃度為10%聚乙二醇（Polyethylene glyco，PEG）處理0、1、6、12和24 h；高溫脅迫處理?xiàng)l件為：42℃處理0、1、6、12和24 h；鹽脅迫為200 mmol.L-1NaCl溶液浸泡幼苗根部0、1、6、12和24 h。

每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，取每株番茄幼苗嫩葉，置于離心管中，然后迅速放置在液氮中速凍，保存于-80℃冰箱中備用。

1.2 番茄BZR基因家族成員鑒定

在茄科數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站SGN（Sol Genomics Network，https://solgenomics.net/）下載番茄基因組文件（SL4.0）和基因組注釋、總蛋白序列文件（ITAG4.0）。在Pfam數(shù)據(jù)庫（https://pfam.xfam.org/）下載BZR保守結(jié)構(gòu)域（PF05687）隱馬爾可夫模型（Hidden markov model，HMM）文件。使用HMMER 3.0軟件hmmsearch功能，在番茄總蛋白序列中搜索與BZR結(jié)構(gòu)域相似蛋白，且設(shè)置E值為1×10-5過濾搜索結(jié)果，得到候選番茄BZR基因家族成員。將候選成員蛋白質(zhì)序列提交到SMART（http://smart.embl.de/）、Pfam和CDD（Conserved Domains Database，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）3個(gè)數(shù)據(jù)庫，確認(rèn)其是否含有BZR結(jié)構(gòu)域，確定番茄BZR基因家族成員。

1.3 番茄BZR基因家族成員序列分析

利用ExPasy（https://www.expasy.org）在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)SlBZR基因編碼氨基酸長(zhǎng)度、等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量。使用MEGA7.0中MUSCLE比對(duì)番茄BZR蛋白序列，獲得番茄BZR蛋白間進(jìn)化關(guān)系。使用MEME-v4.12.0鑒定番茄BZR蛋白序列中保守基序（Motif），最大保守結(jié)構(gòu)域數(shù)量設(shè)置為10，最小motif寬度為6，最大motif寬度為20。然后利用TBtools分析并可視化進(jìn)化樹、保守基序信息。為鑒定BZR基因相關(guān)順式作用元件，提取BZR基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp堿基基因組序列，提交到PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)順式作用元件。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析與染色體定位

在Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）與葡萄（Vitisvinifera）蛋白序列文件，利用1.2中方法鑒定擬南芥、馬鈴薯與葡萄中BZR基因家族成員，將鑒定得到物種BZR蛋白序列與番茄BZR蛋白序列使用MEGA7.0中MUSCLE比對(duì)，利用鄰接法（Neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrapping值設(shè)置為1 000，其余參數(shù)為默認(rèn)值，最后使用iTOL（https://itol.embl.de）網(wǎng)站美化進(jìn)化樹。

1.5 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達(dá)分析

在GEO（Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫下載番茄在干旱和高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，用于提取SlBZR基因家族成員在兩種逆境處理下表達(dá)量，使用TBtools繪制基因表達(dá)熱圖。

1.6 RNA提取與qRT-PCR驗(yàn)證

采用Trizol法提取RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（東洋紡）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用熒光染料SYBR（東洋紡）作qRT-PCR試驗(yàn)，反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[12]方法，反應(yīng)程序參照試劑說明書，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法采用2-ΔΔCt法，使用Graphpad作可視化繪圖，引物序列如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄全基因組中BZR基因鑒定

使用HMMER軟件在番茄全基因組范圍內(nèi)共鑒定得到9個(gè)候選SlBZR基因家族成員，提取9個(gè)候選番茄BZR基因家族成員蛋白序列提交到SMART、Pfam和CDD數(shù)據(jù)庫鑒定其保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)9個(gè)候選SlBZR基因家族成員均具有BES_N蛋白結(jié)構(gòu)域。如表2所示，根據(jù)9個(gè)基因在染色體上先后順序，將這9個(gè)基因分別命名為SlBZR1～SlBZR9；編碼氨基酸長(zhǎng)度在180（SlBZR8）～695（SlBZR1）個(gè)氨基酸之間；編碼蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量最小為20.39 ku（SlBZR8），最大為77.86 ku（SlBZR1）；等電點(diǎn)介于5.33（SlBZR1）～9.73（SlBZR2）之間。

表2 番茄BZR基因家族成員基本信息Table 2 Base information of BZR gene family in tomato

2.2 番茄BZR基因家族成員序列信息

為探究番茄SlBZR基因家族成員序列信息，使用MEME和TBtools軟件分析9個(gè)SlBZR基因家族成員進(jìn)化關(guān)系及保守基序，結(jié)果如圖1所示。9個(gè)Sl-BZR基因在保守基序方面一致性較高，Motif1在所有SlBZRs蛋白上均出現(xiàn)。結(jié)合進(jìn)化關(guān)系聚類發(fā)現(xiàn)，SlBZR2、SlBZR3、SlBZR4、SlBZR5、SlBZR6和SlBZR9均含有Motif3、Motif5、Motif7和Motif10，而SlBZR1和SlBZR7特有保守基序?yàn)镸otif2和Motif6。SlBZR8僅含有Motif1，因此被單獨(dú)劃分為一個(gè)進(jìn)化分支。

圖1 SlBZR基因家族成員進(jìn)化關(guān)系及保守基序Fig.1 Evolutionary relationships and conserved motifs of SlBZR genes

2.3 番茄BZR基因染色體定位分布

在番茄全基因組范圍內(nèi)共鑒定得到9個(gè)SlBZR基因，以上9個(gè)基因分布于番茄12條染色體中8條染色體上，根據(jù)其在基因組注釋文件中信息，使用TBtools可視化SlBZR在染色體上的位置，以展示SlBZR基因分布及基因間距離。如圖2所示，除2號(hào)染色體上分布有兩個(gè)SlBZRs基因外，1、3、4、7、8、10、12號(hào)染色體均僅有1個(gè)SlBZR基因。同時(shí)，SlBZR2和SlBZR3位于2號(hào)染色體中間部分，即著絲粒附近，而其他所有SlBZRs基因均分布在染色體兩端遠(yuǎn)離著絲粒區(qū)域。

圖2 番茄BZR基因染色體定位Fig.2 Chromosomemapping of BZR genesin tomato

2.4 番茄BZR基因系統(tǒng)發(fā)育分析

為研究番茄BZR基因進(jìn)化關(guān)系，按照本研究材料與方法1.2中鑒定方法，分別在擬南芥、馬鈴薯與葡萄中鑒定BZR基因家族成員，并繪制番茄、擬南芥、馬鈴薯與葡萄4個(gè)物種BZR家族成員系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖3所示，4個(gè)物種BZR基因成員系統(tǒng)發(fā)育樹共分為I～V個(gè)亞家族，4個(gè)物種中與番茄BZR基因家族成員進(jìn)化關(guān)系最近的BZR基因均為馬鈴薯中BZR成員，而擬南芥和葡萄中BZR成員，與番茄BZR成員在進(jìn)化上關(guān)系較遠(yuǎn)；如IV亞家族，僅有兩個(gè)葡萄中BZR成員。

2.5 番茄BZR基因順式作用元件預(yù)測(cè)

為預(yù)測(cè)SlBZR基因生物學(xué)功能，使用Plant-CARE數(shù)據(jù)庫對(duì)SlBZR基因起始密碼子上游1 500 bp啟動(dòng)子區(qū)域作順式作用元件分析（見圖4）。結(jié)果表明，SlBZR相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)存在豐富的順式作用元件，可能對(duì)其生物學(xué)功能影響較大。在所預(yù)測(cè)31個(gè)順式作用元件中，SlBZR基因啟動(dòng)子上均含有較多CAAT-box（啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域中常見順式作用元件）、TATA-box（轉(zhuǎn)錄起始的核心啟動(dòng)子元件）。SlBZR5含有較多AT～TATA-box元件、SlBZR3含有較多Box元件、SlBZR4含有較多ABRE元件（參與脫落酸響應(yīng)的順式作用元件）、SlBZR1含有較多MYC元件且SlBZR6含有較多ERE元件（乙烯響應(yīng)元件）。部分順式作用元件盡管含量較少但仍具有重要生物學(xué)功能，如ARE（厭氧誘導(dǎo)元件）等。

2.6 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)番茄BZR基因表達(dá)模式分析

為探究番茄SlBZR基因在非生物脅迫下表達(dá)情況，本研究在GEO數(shù)據(jù)庫下載通過干旱與高溫脅迫處理番茄葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)錄組（FPKM）數(shù)據(jù)包括干旱處理、高溫處理和對(duì)照，如圖5所示，圖5a為干旱處理（D，drought），每組數(shù)據(jù)為不同處理天數(shù)（d，day）；圖5b為高溫處理（H，heat），每組數(shù)據(jù)為不同處理小時(shí)數(shù)（h，hour）。有8個(gè)SlBZR基因在不同條件下均表達(dá)，而SlBZR8基因在高溫脅迫下不表達(dá)。SlBZR3、SlBZR6和SlBZR9在干旱處理后與對(duì)照相比，隨處理時(shí)間增加，表達(dá)量呈先升后降趨勢(shì)，且表達(dá)量最高時(shí)均在干旱處理3 d時(shí)，SlBZR1和SlBZR8在干旱處理4 d時(shí)上調(diào)表達(dá)最明顯。SlBZR2和SlBZR5經(jīng)干旱處理后表達(dá)量均比對(duì)照組低。同時(shí)在高溫脅迫下發(fā)現(xiàn)，處理后表達(dá)量比對(duì)照低，如SlBZR2、SlBZR5和SlBZR9。而SlBZR3、SlBZR4、SlBZR6和SlBZR7在高溫脅迫下與對(duì)照相比，隨脅迫時(shí)間增加，表達(dá)量呈先升再降又升趨勢(shì)。由此表明，SlBZR基因不同表達(dá)方式也間接揭示SlBZR基因家族在番茄響應(yīng)逆境脅迫中的功能多樣性。

2.7 番茄BZR基因家族成員在非生物脅迫下表達(dá)模式分析

為驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，研究番茄中Sl-BZR基因家族對(duì)非生物脅迫反應(yīng)，本研究選擇4個(gè)SlBZR家族成員，分別為SlBZR3、SlBZR6、Sl-BZR8和SlBZR9。

如圖6所示，在冷脅迫下，隨時(shí)間推移，與對(duì)照相比SlBZR6和SlBZR8表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)（Sl-BZR6在冷脅迫12 h后其相對(duì)表達(dá)量驟降，但整體仍上調(diào)表達(dá)）；SlBZR3和SlBZR9則表現(xiàn)為先降再升趨勢(shì)。冷脅迫下，與對(duì)照相比，SlBZR6上調(diào)表達(dá)最明顯，其相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照組（冷處理0 h）6倍。鹽脅迫時(shí)，SlBZR3、SlBZR6和SlBZR9均在處理12 h時(shí)呈相對(duì)表達(dá)量峰值，而SlBZR8則出現(xiàn)在6 h時(shí)（約為對(duì)照組5.7倍），且SlBZR6無明顯上調(diào)趨勢(shì)。干旱脅迫前12h，SlBZR6、SlBZR8和SlBZR9相對(duì)表達(dá)量呈逐步升高趨勢(shì)，且4個(gè)基因均在處理12 h后達(dá)最高相對(duì)表達(dá)量，且24 h后相對(duì)表達(dá)量略低于12 h。高溫脅迫下，SlBZR3在12 h前相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間呈階梯上調(diào)，其余基因在高溫脅迫下無明顯上調(diào)或下調(diào)趨勢(shì)，且SlBZR3和SlBZR8在高溫脅迫24 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照，其他兩個(gè)基因則略低于對(duì)照，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

圖6 4個(gè)番茄BZR基因不同脅迫處理下相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Relativeexpression of four tomato BZR genesunder different stresstreatments

3 討論

作為植物轉(zhuǎn)錄因子家族之一，BZR家族基因通過在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控下游各類靶基因，參與植物多種生理過程和生長(zhǎng)發(fā)育[13]。目前，已在多種植物中發(fā)現(xiàn)BZR基因家族，如擬南芥[9]，大豆[14]，小麥[15]和水稻[16]等。植物中存在的BZR蛋白功能復(fù)雜，如調(diào)控響應(yīng)BR的基因表達(dá)調(diào)節(jié)植株生長(zhǎng)發(fā)育和使植株抗逆性增強(qiáng)等[4]。然而在番茄中，關(guān)于BZR基因家族研究較少。

本研究共鑒定出9個(gè)SlBZR基因家族成員，且獲得其序列特征和結(jié)構(gòu)、保守基序、染色體位置和啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件等信息；此外基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得9個(gè)基因在干旱和高溫下表達(dá)模式，已通過qRT-PCR驗(yàn)證其結(jié)果。如表2所示，SlBZR基因家族成員平均分子質(zhì)量為42.5 ku，平均pI為8.11。前人研究得出BZR蛋白結(jié)構(gòu)包含N端核定位信號(hào)序列、高度保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、磷酸化區(qū)域、PEST序列及C端結(jié)構(gòu)域，這可能是導(dǎo)致Sl-BZR基因家族平均等電點(diǎn)大于7的原因[5]。BZR1和BES1（和BZR1同屬一類的轉(zhuǎn)錄因子）可調(diào)節(jié)下游BR響應(yīng)基因表達(dá)，且二者均既發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活子功能又發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制子功能[4]。其DNA結(jié)合域通常包含一個(gè)bHLH（螺旋-環(huán)-螺旋）結(jié)構(gòu)，BZR1 DNA結(jié)合域是BZR1相關(guān)蛋白中最保守區(qū)域，由第一外顯子編碼，可與BRRE元件特異結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因誘導(dǎo)或抑制[7,10]。如圖1所示，該基因家族成員含保守基序，有較高一致性，進(jìn)化分支劃分也較清晰。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)SlBZR基因并不屬于內(nèi)含子富集型基因家族，因此推斷在SlBZR基因家族不斷多樣化過程中可能導(dǎo)致內(nèi)含子丟失情況發(fā)生[17]。圖4顯示所鑒定9個(gè)SlBZR基因啟動(dòng)子上游順勢(shì)作用元件功能分析，發(fā)現(xiàn)其均含有豐富順式作用元件，如CAAT-box、TATA-box、ABRE、MYC和ERE等。順式作用元件按照功能大體分為三大類：生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)順式作用元件（如G-box）[18]、激素反應(yīng)相關(guān)順式作用元件（如ABRE）[19]和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)順式作用元件（如LTR）[20]。在SlBZR基因家族中均檢測(cè)到該元件存在，表明SlBZR基因家族在抗逆中發(fā)揮功能原因之一可能是家族順式作用元件的豐富性。本研究揭示SlBZR基因?qū)Φ蜏孛{迫、干旱脅迫、高溫脅迫和鹽脅迫響應(yīng)。如圖6所示，SlBZR對(duì)4種處理均有響應(yīng)，但不同SlBZR成員表達(dá)水平存在差異。另有小麥研究表明，將過表達(dá)的TaBZR2轉(zhuǎn)入小麥（Triticum aestivumL.）可提高其植株抗旱性[15]。如圖5所示，SlBZR基因在干旱組和高溫組表達(dá)模式相近，但也有個(gè)別基因呈現(xiàn)較大差異。SlBZR8在高溫組未表達(dá)，而在干旱處理4 d時(shí)呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，5 d后其表達(dá)量又下降。隨后將這9個(gè)SlBZR基因作qRT-PCR試驗(yàn)，結(jié)果表明大部分基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。Chen和Li等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，轉(zhuǎn)錄因子CBF、WRKY6及脫落酸受體PYL6編碼抗寒基因表達(dá)，而BZR1對(duì)此調(diào)控過程起促進(jìn)作用[21-22]。另外本研究發(fā)現(xiàn)，SlBZR3在高溫和鹽脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)；Sl-BZR8在冷處理下表達(dá)量顯著上調(diào)（特別是24 h后上調(diào)近4倍）。而SlBZR8在鹽處理前期尤其是6 h后表達(dá)量上調(diào)明顯，可能在鹽脅迫早期反應(yīng)中發(fā)揮作用。在擬南芥中，bes1-D突變體與野生型植株相比在鹽脅迫條件下葉片萎蔫程度比野生型植株葉片更小[23]，本研究在番茄中同樣驗(yàn)證BZR基因響應(yīng)鹽脅迫。

綜上所述，本研究首次在番茄中鑒定BZR基因家族成員，通過生物信息學(xué)分析及非生物脅迫下qRT-PCR分析，揭示番茄BZR基因家族成員，在番茄生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫與激素響應(yīng)方面可能發(fā)揮重要作用，為研究SlBZR基因在番茄響應(yīng)逆境脅迫過程提供思路，也為進(jìn)一步研究SlBZR基因家族在番茄育種和抗性改良中作用提供基礎(chǔ)。