范荒原，詹宛瑩，候立恒，柴文戍

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧 錦州 121000)

感染性疾病在臨床實踐中具有挑戰(zhàn)性和普遍性，是社區(qū)和醫(yī)院中最常見的疾病之一。革蘭氏陰性菌仍然為感染性疾病最多見病原體，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯桿菌和非腸桿菌科細菌的銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等。感染性疾病分為簡單和復(fù)雜性感染，不幸的是，許多復(fù)雜性感染與高復(fù)發(fā)率相關(guān)，對現(xiàn)有口服抗生素耐藥性增加，迫使許多臨床醫(yī)生求助于靜脈注射藥物，如碳青霉烯類抗菌藥物[1]。碳青霉烯類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強、腎毒性低等特點，已經(jīng)成為臨床治療中、重度細菌感染的主要藥物之一[2]。隨著臨床耐藥菌的不斷產(chǎn)生，合理經(jīng)驗性應(yīng)用抗生素是阻斷其傳播的重要手段。為更好地了解我院常見分離菌對不同藥物的抗菌活性，盡可能減少耐藥菌產(chǎn)生機會，以期在治療感染性疾病臨床經(jīng)驗性用藥當中，提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品

觀察藥品：比阿培南(安信)南京先聲東元制藥有限公司；對照藥品：美羅培南(美平)Sumitomo Dainippon Pharma Co.；亞胺培南(泰能)杭州默沙東制藥公司；厄他培南(怡萬之)Laboratoires Merck Sharp&Dohme -Chibret；頭孢他啶(復(fù)達欣)GlaxoSmithKline Manufacturing S.p.A；頭孢吡肟(恒蘇)江蘇恒瑞醫(yī)藥公司；頭孢哌酮/舒巴坦(凡琳，1∶1)楊子江藥業(yè)公司；哌拉西林/他唑巴坦(邦達，8∶1)齊魯天和惠世制藥公司；環(huán)丙沙星(西普樂)Bayer Schering Pharma AG；左氧氟沙星(左克)楊子江藥業(yè)公司；阿米卡星(米英杰)浙江莎普愛思藥業(yè)公司。

1.2 實驗菌株來源與鑒定

試驗菌株均來自本院2019年9月至2020年9月住院患者的痰液(193例)、尿液(154例)、腹腔積液(94例)、血液(69例)、傷口膿液(44例)及其他(11例)標本分離到的致病菌(相同患者相同部位只收集1次)，所有菌株均經(jīng)我院檢驗科微生物室細菌檢定儀(西門子Microscan WalkAway-96Plus)鑒定。利用低溫冷凍保存法收藏細菌，每次試驗前予菌株復(fù)活，分離純化良好后進行試驗。

1.3 培養(yǎng)基

藥敏試驗用MH肉湯培養(yǎng)基(上海廣銳生物科技有限公司)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(北京百歐博偉生物科技有限公司)；血瓊脂平板培養(yǎng)基(上海哈靈生物科技有限公司)。

1.4 試驗方法

參照Sarker等的試驗方法[3]，挑取經(jīng)18～24 h培養(yǎng)，生長完好的單個菌落進行菌懸液配制，通過濁度儀調(diào)制成0.5個麥氏濁度(約1.5×108CFU/mL),再倍比稀釋終濃度為6.1×105CFU/L備用。所有試驗藥品按藥品說明書用生理鹽水配置成終質(zhì)量濃度7680 mg/L備用。在96孔無菌培養(yǎng)板第1橫的第1列加入290 μL MH肉湯培養(yǎng)基，其他至第2橫的第10列中加入150 μL MH肉湯培養(yǎng)基，第1橫的第1列再加入10 μL配置好的藥品，由左至右逐一進行倍比稀釋，最終達到256～0.016 mg/L的試驗藥品梯度，再最后每孔加入5 μL菌懸液。其中第2橫的5～7列為只含菌液、培養(yǎng)基，無藥物的陽性對照孔，8～10列為只含培養(yǎng)基，無菌液無藥物的陰性對照孔。適當混勻，35 ℃孵育18 h后應(yīng)用酶標儀讀取各孔的吸光度值(A)，與陰性對照孔進行比較，相同者即為該藥物對該株菌的最低抑菌濃度(MIC)，若藥物濃度為256 mg/L與陽性對照孔的A值完全相同時，視為MIC大于256 mg/L。

1.5 試驗結(jié)果判斷

按CLSI M100-S30(2020)[4]進行抗菌藥物臨界濃度標準的判讀，計算出細菌的敏感率和耐藥率，按照Livermore DM等[5]報道，比阿培南對腸桿菌科細菌的折點選取與亞胺培南、美羅培南一致，即≤1 mg/L為敏感，≥ 4 mg/L為耐藥，對銅綠假單胞菌和和鮑曼不動桿菌，也參考了亞胺培南和美羅培南對相應(yīng)菌屬/種的折點,對亞胺培南、美羅培南其中一種耐藥的菌株，視為碳青霉烯類藥物耐藥菌株[6]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件計算MIC50、MIC90及MICrange，比阿培南與其他對照藥物敏感率比較采用χ2檢驗分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。質(zhì)控菌株校正藥敏試驗準確性。

2 結(jié) 果

2.1 實驗菌株和質(zhì)控菌株

實驗菌株：通過細菌鑒定儀鑒定本次試驗產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase，ESBL)大腸埃希菌123株，占大腸埃希菌56.9%(123/216)，大腸埃希菌總檢出率38.2%(216/565)為本次試驗最多見菌株，與2019年CHINET三級醫(yī)院細菌耐藥監(jiān)測中大腸埃希菌占革蘭氏陰性桿菌構(gòu)成比最大相同，但檢出率略低于報道[7]，本研究樣本量受限有關(guān)；碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯桿菌(carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae，CRKP)占肺炎克雷伯桿菌19.3%(22/114)，占總菌株的3.9%(22/565)；非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌銅綠假單胞菌的檢出率14.1%(80/565)，鮑曼不動桿菌9.6%(54/565)，其中碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌(carbapenem-resistant pseudomonas aeruginosa，CRPA)占銅綠假單胞菌的28.8%(23/80)，占總菌株數(shù)的4.0%(23/565)，碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistant acinetobacter baumannii，CRAB)占鮑曼不動桿菌的68.5%(37/54)，占總菌株數(shù)的6.5%(37/565)；陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌各占總菌株數(shù)的7.0%(40/565)、4.8%(27/565)、6.0%(34/565)。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853本院檢驗科微生物室提供。

2.2 抗菌藥物對臨床常見分離革蘭氏陰性菌最低抑菌濃度測定及敏感性結(jié)果

比阿培南對產(chǎn)和不產(chǎn)ESBL大腸埃希菌、非碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌、非碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌及非碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌均表現(xiàn)出了良好的抗菌活性，與劉文靜等[8]、董婧等[9]報道相似，且MICrange最小(0.016～16 mg/L)，MIC50最小(0.016 mg/L)，MIC90與美羅培南相當(0.06 mg/L)。關(guān)于不產(chǎn)ESBL大腸埃希菌，與中國細菌耐藥監(jiān)測報告[10]相比，美羅培南MIC50和MIC90是報告的2倍，亞胺培南MIC50與報告相同(0.12 mg/L)，MIC90是報告的4倍，分析原因，本試驗未再劃分大腸埃希菌是否碳青霉烯類耐藥。對于產(chǎn)ESBL大腸埃希菌碳青霉烯類抗菌藥物抗菌活性顯著高于其他對照藥物(P<0.05)(阿米卡星除外)，但其之間對比無差異性，其中比阿培南和美羅培南的MICrange和MIC50最小且相似分別為0.016～64 mg/L、0.03～64 mg/L和0.03 mg/L、0.03 mg/L，比阿培南的耐藥率僅次于美羅培南和亞胺培南。本實驗中美羅培南、亞胺培南及阿米卡星對非碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的MIC50，是國外文獻報道[11]的1/2。對于CRKP，比阿培南敏感率顯著高于美羅培南、亞胺培南、厄他培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦(P<0.05)，與國內(nèi)文獻報道[12]相仿，耐藥率與環(huán)丙沙星相同，低于美羅培南、亞胺培南、厄他培南。本次試驗對非碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌的抗菌活性比較中，比阿培南的敏感性最佳，其次阿米卡星、美羅培南，而CRPA中，比阿培南的敏感性顯著小于頭孢他啶、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、阿米卡星(P<0.05)，但敏感率高于美羅培南、亞胺培南，其耐藥率低于美羅培南、亞胺培南。對于非碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌比阿培南與亞胺培南敏感性最佳，其次美羅培南、阿米卡星，但比阿培南和美羅培南的MIC50(0.125 mg/L)最低，是亞胺培南(0.5 mg/L)的1/4、阿米卡星(1 mg/L)的1/8，比阿培南和亞胺培南的MIC90(8 mg/L)最低，是美羅培南(16 mg/L)和阿米卡星(16 mg/L)的1/2。值得一提的是在對CRAB的敏感性比較中，比阿培南和阿米卡星的敏感率最高，顯著高于美羅培南、亞胺培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、環(huán)丙沙星及左氧氟沙星(P<0.05)，且比阿培南的耐藥率最低，均低于其他對照藥品(P<0.05)。部分腸桿菌科細菌(陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、奇異變形桿菌)比阿培南總的敏感率與美羅培南、亞胺培南及阿米卡星相近(P>0.05)，但顯著高于厄他培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與戴瑋等[13]報道相仿，見表1～11。

表1 不同抗菌藥物對不產(chǎn)ESBL大腸埃希菌抗菌活性

表2 不同抗菌藥物對產(chǎn)ESBL大腸埃希菌抗菌活性

表3 不同抗菌藥物對非CR肺炎克雷伯菌抗菌活性

表4 不同抗菌藥物對CRKP抗菌活性

表5 不同抗菌藥物對非CR銅綠假單胞菌抗菌活性

表6 不同抗菌藥物對CRPA抗菌活性

表7 不同抗菌藥物對非CR鮑曼不動桿菌抗菌活性

表8 不同抗菌藥物對CRAB抗菌活性

表9 不同抗菌藥物對陰溝腸桿菌抗菌活性

表10 不同抗菌藥物對產(chǎn)氣腸桿菌抗菌活性

表11 不同藥物對奇異變形桿菌抗菌活性

3 討 論

關(guān)于碳青霉烯類、頭孢菌素類、復(fù)合酶抑制劑類、喹諾酮類及氨基糖苷類等11種臨床常用抗菌藥物的抗菌活性比較研究報道較少，據(jù)2019年中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)[7]233-243了解到，革蘭氏陰性桿菌仍是臨床罹患感染性疾病的重要致病菌。本研究是一項評價臨床經(jīng)驗用藥常用抗生素對醫(yī)院患者常見分離革蘭氏陰性桿菌及部分碳青霉烯類耐藥菌的體外抗菌試驗研究。新型非典型β-內(nèi)酰胺碳青霉烯類抗菌藥物比阿培南，具有對腎脫氫肽酶、持續(xù)高產(chǎn)C類頭孢菌素酶以及β-內(nèi)酰胺酶甚至超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(EBSLs)較其他碳青霉烯類抗生素穩(wěn)定性更強的特點，免遭酶類降解使抗生素不易失活[1]439-444。比阿培南可與細菌細胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白高度結(jié)合，從而抑制細菌細胞壁的生物合成，破壞細菌正常結(jié)構(gòu)發(fā)揮殺菌作用。相比較其他碳青霉烯類抗生素比阿培南對革蘭氏陰性菌，特別是對銅綠假單胞菌的抗菌能力更強，這與本文相符，且腎毒性更小，這得益于比阿培南的2位C上修飾了三唑陽離子，從而增加了細菌細胞膜的穿透性。現(xiàn)如今比阿培南應(yīng)用廣泛，特別是在治療下呼吸道感染、復(fù)雜性尿路感染、復(fù)雜性腹腔感染和血液系統(tǒng)疾病所致粒細胞缺乏的中、重度感染病例上，均獲得了顯著療效[14-16]。

本試驗抗菌活性比較中發(fā)現(xiàn)，碳青霉烯類抗菌藥物對臨床主要分離到的腸桿菌科細菌，具有顯著優(yōu)勢。其中比阿培南與美羅培南抗菌活性相當，較亞胺培南、厄他培南優(yōu)勢更加明顯，與艾效曼等[12]541-546研究相似。試驗藥物比阿培南，尤其對大腸埃希菌、非碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯桿菌、非碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌、非碳青霉烯類鮑曼不動桿菌及常見腸桿菌科細菌的敏感率均達到90%以上，耐藥率≤5%。對于CRKP、CRPA及CRAB，比阿培南總的抗菌活性顯著高于美羅培南、亞胺培南(P<0.05)。參閱文獻了解到，CRKP主要耐藥機制是產(chǎn)生碳青霉烯酶[17]，后者會水解碳青霉烯類藥物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶主要有KPC型、IMP型、NDM-1型及OXA-48型，其中產(chǎn)KPC型肺炎克雷伯菌是CRKP中最常見類型[18]，而產(chǎn)OXA-48型肺炎克雷伯菌是對青霉素等窄譜β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機制。本實驗研究表明，頭孢菌素類、半合成青霉素類抗生素對CRKP表現(xiàn)出極高耐藥性，而比阿培南對其耐藥性，僅次于最低的阿米卡星。金屬β內(nèi)酰胺酶是目前臨床導(dǎo)致銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類藥物的重要機制[19]，MBL同樣是通過水解抗菌藥物，產(chǎn)生耐藥特性。結(jié)果顯示，比阿培南對CRPA的抗菌活性不及頭孢菌素類和氨基糖苷類抗生素，但在碳青霉烯類藥物中敏感性突出。鮑曼不動桿菌耐藥性高，臨床治療難度大，目前仍是重癥醫(yī)學(xué)科、呼吸與危重癥科、血液科等抗感染治療的難題，CRAB的產(chǎn)生與抗生素暴露及碳青霉烯類藥物使用時間呈正相關(guān)[20]，本研究中臨床分離到的CRAB占耐碳青霉烯類藥物菌的45.1%，略低于其他醫(yī)院[13]321-327。試驗藥物比阿培南對CRAB的耐藥性明顯低于美羅培南和亞胺培南，這與美羅培南及亞胺培南臨床應(yīng)用時間較長可能相關(guān)，未來還需做深一步的研究證明。試驗部分結(jié)果與參考文獻部分不相一致，其主要原因為本試驗菌株均來自同一家醫(yī)院，且樣本量較少。

綜上所述，比阿培南具有對腸桿菌科細菌及碳青霉烯類耐藥菌抗菌活性強、耐藥率低等優(yōu)勢，可成為臨床常見感染性疾病經(jīng)驗性用藥中，有價值的選擇。與此同時，抗生素的合理應(yīng)用、依藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥，仍是遏制碳青霉烯類耐藥菌傳播的重要手段。