尹虹

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515)

Nudix水解酶(nucleoside diphosphates linked to some moiety X，Nudix)廣泛存在于真核生物、古細(xì)菌、細(xì)菌和病毒中，是一類需要Mg2+的酶，Nudix水解酶擁有一個(gè)保守的Nudix基序-GX5EX7REVXEEXGU，其中U通常是Ile，Leu或Val[1-3]。Nudix水解酶根據(jù)其水解底物的不同進(jìn)行分類，其水解底物包含有核苷酸糖，二核苷酸聚磷酸， NADH，ADP-核酸，脫氧核糖核苷酸三磷酸，核糖核苷酸三磷酸等[3]。所以，Nudix水解酶不僅能調(diào)節(jié)各生化途徑的中間代謝產(chǎn)物的積累，還可以清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物[4-5]。目前，已發(fā)現(xiàn)28個(gè)擬南芥Nudix水解酶基因，分別分布于細(xì)胞質(zhì)(AtNUDT1-11、AtNUDT25、AtDCP2)、葉綠體(AtNUDT12-18)和線粒體(AtNUDT19-24、AtNUDT26-27)中[2,6]164-168。Ishikawa等[7]發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNUDT6基因能通過(guò)調(diào)節(jié)NADH正向調(diào)控NPR1依賴的水楊酸信號(hào)通路。AtNUDT7基因不僅是EDS1信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，同時(shí)也是2個(gè)不同防御途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子，既參與植物細(xì)胞程序性死亡，也與保持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡相關(guān)[8-10]。以往的研究集中在單個(gè)擬南芥Nudix水解酶基因缺失或過(guò)表達(dá)對(duì)植株造成的影響，很少有研究探討2個(gè)或多個(gè)以上擬南芥Nudix水解酶基因缺失時(shí)的分子機(jī)制，因此本研究利用BRB-Array Tools基因芯片數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)來(lái)源于公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO)的AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，通過(guò)生物信息學(xué)分析，從整體上了解其信號(hào)通路和基因組的變化，進(jìn)而了解其分子機(jī)制[11-13]。

1 材料和方法

1.1 研究材料

本文所用的數(shù)據(jù)集來(lái)自NCBI里的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，這個(gè)數(shù)據(jù)集的序列號(hào)為GSE74346。所用芯片都是Affymetrix第1代擬南芥基因組芯片，其中包含22 746個(gè)擬南芥基因，實(shí)驗(yàn)中，總RNA均來(lái)自植株的子葉。GSE74346數(shù)據(jù)集總共含有8張擬南芥芯片樣本，分別為兩張哥倫比亞生態(tài)型擬南芥植株(野生型，GSM1917702和GSM1917703)，兩張AtNUDX6基因缺失型植株(KO-nudx6，GSM1917704和GSM1917705)，兩張AtNUDX7基因缺失型植株(KO-nudx7，GSM1917706和 GSM1917707)，以及兩張AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株(KO-nudx6/7，GSM1917708和GSM1917709)。

1.2 研究方法

1.2.1 數(shù)據(jù)過(guò)濾和標(biāo)準(zhǔn)化以及差異基因的篩選

從NCBI中的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載以上 8 個(gè)GSM， 解壓后放入同一文件夾中。利用BRB-Array Tools Version 3.8.0(http:/ /linus.nei.nih.gov/BRB-ArrayTools.html)軟件對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，為獲得表達(dá)信號(hào)強(qiáng)且質(zhì)量高的基因，我們采用中位值的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[11-12]852-855，242-249。對(duì)基因過(guò)濾時(shí)選取基因的標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的缺失數(shù)≤50%；(2)基因中位數(shù)值至少發(fā)生1.5倍的改變，且這種改變≥20%的樣本數(shù)。對(duì)通過(guò)過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)的基因進(jìn)行t檢驗(yàn)，通過(guò)Class comparison對(duì)兩組樣本進(jìn)行分類比較，找到不同基因缺失型擬南芥植株的差異表達(dá)基因(P<0.01)[11]852-855。

1.2.2 不同基因缺失型植株的差異基因分析

利用Venny 2.0在線軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對(duì)擬南芥不同基因缺失型植株的差異表達(dá)基因做交集分析。

1.2.3 AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差異基因的生物信息學(xué)分析

利用Metascape在線工具[9]204-215對(duì)AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差異表達(dá)基因進(jìn)行 GO 本體分析與 KEGG 通路分析，其中P為閾值。GO本體 Cluster 分為分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)、生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)[12]242-249。

1.2.4 AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差異基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用Cytoscape 3.2.1(http://cytoscape.org)中的GENEMANIA軟件包[10]1523對(duì)AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差異基因進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，并利用Cytoscape中的Network Analysis插件對(duì)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)拓?fù)湎禂?shù)，如各節(jié)點(diǎn)的度(degree)，挑選出在網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(蛋白)度≥10的中心節(jié)點(diǎn)，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)即是該網(wǎng)絡(luò)的核心蛋白[14]。本研究中，我們將d≥10的節(jié)點(diǎn)定為核心蛋白。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)過(guò)濾和標(biāo)準(zhǔn)化以及差異表達(dá)基因的篩選

通過(guò)設(shè)定的數(shù)據(jù)過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)及中位值標(biāo)準(zhǔn)化處理后，22 746個(gè)探針中有2247個(gè)通過(guò)了過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。應(yīng)用 BRB-Array Tools 軟件在上千種表達(dá)差異顯著的基因中對(duì)兩組樣本進(jìn)行了分類比較(P<0.01)，其中，AtNUDX6基因缺失型植株相對(duì)于野生型植株共有3個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因。AtNUDX7基因缺失型植株相對(duì)于野生型植株共有8個(gè)上調(diào)基因和13個(gè)下調(diào)基因。AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株相對(duì)于野生型植株共有161個(gè)上調(diào)基因和152個(gè)下調(diào)基因，見圖1。

A：AtNUDX6基因缺失型；B：AtNUDX7基因缺失型；C：AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型

2.2 不同基因缺失型植株的差異基因分析

應(yīng)用Venny 2.0在線軟件對(duì)AtNUDX6基因缺失型植株，AtNUDX7基因缺失型植株以及AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株的差異基因(相對(duì)于野生型植株)的韋恩圖進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)，基因AT1G26920在3種缺失型的植株中均呈現(xiàn)出高表達(dá)，且均在10倍以上。另外，基因AT2G40260和ATNUDT6基因在AtNUDX6基因缺失型植株和AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株中均下調(diào)表達(dá)；基因AT4G17470、NATA1、ARP9、COR78和AtNUDT7(探針264450_s_at未找到注釋基因)在AtNUDX7基因缺失型植株和AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株中均下調(diào)表達(dá)。AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有的差異基因有304個(gè)，其中上調(diào)基因160個(gè)，下調(diào)基因144個(gè)，見圖2。

圖2 3種不同缺失植株的差異表達(dá)基因韋恩圖

2.3 AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差異基因的生物信息學(xué)分析

Metascape在線分析結(jié)果顯示AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株差異基因顯著參與免疫系統(tǒng)過(guò)程、真菌應(yīng)對(duì)反應(yīng)、缺水應(yīng)對(duì)反應(yīng)、次級(jí)代謝過(guò)程、茉莉酸刺激的反應(yīng)、藥物反應(yīng)、防御反應(yīng)的調(diào)控、活性氧反應(yīng)、次生代謝物生物合成過(guò)程、對(duì)光強(qiáng)度的響應(yīng)等多個(gè)生物過(guò)程(P<0.01)，見圖3。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)(P<0.05)，差異基因主要參與植物-病原菌相互作用、α-亞麻酸代謝、苯丙烷類化合物的生物合成以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，見圖4。Metascape的MCODE插件共尋找到5個(gè)密集連接的蛋白質(zhì)子網(wǎng)絡(luò)集群motif，見圖5。

前20個(gè)，P<0.01

圖4 AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株差異表達(dá)基因生物學(xué)過(guò)程的 KEGG通路分析

A：PPI網(wǎng)絡(luò)；B：5種重要motif

2.4 AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差異基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差異基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6，304個(gè)差異探針中只有282個(gè)差異基因找到，GENEMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)中找到517對(duì)蛋白相互作用對(duì)。AHB1、F13K9.15、NF-YC12以及AKT1是節(jié)點(diǎn)度10以上的蛋白，在構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)中處于中心位置，屬于核心蛋白，其中AHB1、F13K9.15和AKT1為3個(gè)上調(diào)核心蛋白，NF-YC12為下調(diào)核心蛋白。圖7可以看出AHB1在AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株中表達(dá)量最高。

3 討 論

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了 8個(gè)源自擬南芥植株樣本的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行差異表達(dá)分析后顯示，ATNUDT6基因在AtNUDX6基因缺失型植株和AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株中均下調(diào)表達(dá)，AtNUDT7在AtNUDX7基因缺失型植株和AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株中均下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明構(gòu)建的模型可信度高，可以反應(yīng)AtNUDX6和AtNUDX7基因缺失后擬南芥植株的基因表達(dá)情況。

AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有的差異基因參與植株體內(nèi)植物防衛(wèi)反應(yīng)、次級(jí)代謝過(guò)程、茉莉酸刺激的反應(yīng)、損傷反應(yīng)、真菌應(yīng)對(duì)反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、芳香族化合物生物合成過(guò)程、活性氧反應(yīng)等多個(gè)生物過(guò)程，表明AtNUDX6和AtNUDX7基因能夠共同協(xié)作參與擬南芥的多種防御反應(yīng)，并能參與降解細(xì)胞的中間代謝物，這與之前的體外研究結(jié)果一致[15-16]。

在發(fā)現(xiàn)的4個(gè)核心蛋白中，AHB1是非共生血紅蛋白1，可以被低氧脅迫、蔗糖誘導(dǎo)表達(dá)，與氧有很高的親和性[17-18]。Nudix水解酶可能通過(guò)抑制AHB1基因的表達(dá)發(fā)揮作用。F13K9.15是B-box型鋅指蛋白13，目前，對(duì)擬南芥B-box型鋅指蛋白的研究集中在開花調(diào)控、花發(fā)育、光形態(tài)發(fā)生以及光周期調(diào)控等方面[19-21]，而在植株防御反應(yīng)的研究報(bào)道較少。AKT1是一個(gè)鉀離子通道蛋白，對(duì)鉀的吸收積累有重要作用[22-23]。高表達(dá)的AKT1能增加擬南芥的逆境脅迫能力[24]，可能是AtNUDX6和AtNUDX7基因的下游基因。NF-YC12是 NF-Y 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的一個(gè)重要組成成分[25]，其詳細(xì)功能尚未見報(bào)道。因此，以上4個(gè)核心蛋白在AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型擬南芥中的具體分子作用機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

方格代表AtNUDX6和AtNUDX7基因共缺失型植株特有差異蛋白；黃色方格代表核心蛋白；圓圈代表數(shù)據(jù)庫(kù)中與特有差異蛋白相互作用的蛋白

顏色越紅，表達(dá)越高；顏色越藍(lán)，表達(dá)越低