曾燕玲 秦永麗# 黃清輝 黎小源 陳瑞紅 蔣永榮 邱雨辰 姜峙成 施亞雯

(1.桂林電子科技大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.廣西博世科環(huán)?？萍脊煞萦邢薰?，廣西 南寧 540000)

隨著社會的發(fā)展，氨氮的排放量急劇增加，造成水環(huán)境污染和富營養(yǎng)化等問題[1-2]。傳統(tǒng)生物脫氮主要通過微生物的硝化及反硝化作用實現(xiàn)，它對廢水脫氮起到重要作用，但仍存在諸多問題，如能耗大、需額外添加有機碳源、剩余污泥多等[3-4]。厭氧氨氧化(Anammox)工藝由于節(jié)省碳源和能源、污泥產(chǎn)量少等優(yōu)點被認(rèn)為是最具應(yīng)用前景的新型脫氮工藝之一[5]，它主要涉及一種化能自養(yǎng)厭氧菌——厭氧氨氧化菌(AnAOB)，該菌能夠以亞硝酸鹽氮為電子受體在厭氧條件下將氨氮轉(zhuǎn)化為氮氣[6]。目前Anammox工藝主要應(yīng)用于垃圾滲濾液[7]、養(yǎng)豬場廢水[8]、生活污水[9]等含氨氮廢水處理中，脫氮負(fù)荷可高達76.5 kg/(m3·d)[10]。但是，Anammox工藝的啟動時間長(145～298 d)，污泥富集難[11-13]，大大限制了它在實際工程中的應(yīng)用。對于Anammox工藝啟動慢、污泥富集難的原因，研究者認(rèn)為：一是AnAOB倍增時間長，生長緩慢[14]；二是AnAOB易受環(huán)境的影響[15]，如基質(zhì)的突變、溫度的降低、有機物的添加等，均會導(dǎo)致污泥活性降低，AnAOB豐度大幅下降[16-18]。而含氨氮的工業(yè)廢水多為間歇排放，水量波動較大，且有毒污染物較多，水質(zhì)較為復(fù)雜，以及環(huán)境參數(shù)(如溫度)不易控制等，均會造成系統(tǒng)內(nèi)AnAOB生長受影響，從而Anammox污泥難富集。因此，如何加快AnAOB的生長，實現(xiàn)Anammox污泥的快速富集是推進Anammox工藝推廣應(yīng)用的關(guān)鍵。

超聲處理因其效率高、儀器簡單，與其他常規(guī)技術(shù)相比大大縮減了處理時間以及經(jīng)濟上的負(fù)擔(dān)而被認(rèn)為是一種實用的技術(shù)[19-20]。目前低強度超聲處理技術(shù)已廣泛應(yīng)用于廢水生物處理領(lǐng)域[21]，其機械效應(yīng)、熱效應(yīng)等會使細(xì)胞膜變薄，加快傳質(zhì)過程，增強酶活性，促進微生物生長，達到提高反應(yīng)效率的目的[22]。段秀梅[23]58通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超聲處理后的生物細(xì)胞壁比未經(jīng)處理的薄1.1 nm。唐欣等[24]認(rèn)為，超聲處理能夠明顯促進短程硝化反硝化過程中氨單加氧酶的活性，酶活性的增加加快了短程硝化污泥反應(yīng)速率。然而由于不同的微生物適宜的超聲強度不同，需選擇性地控制超聲條件使目標(biāo)菌群活性增強并且抑制其他菌群的活性[25],[26]1591,[27]283，而Anammox污泥富集培養(yǎng)的過程就是AnAOB生長及其他菌群(如硝化菌、反硝化菌)被淘汰的過程。多位研究者通過短期批次實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲強度為80～200 W，照射時間為3～5 min時，可明顯增強Anammox污泥活性[23]58,[28]1358。張鑫愛[29]在研究低強度超聲強化含氮廢水生物脫氮研究時發(fā)現(xiàn)，180 W時，硝化菌、反硝化菌屬的占比均降低，而AnAOB的占比升高。由此可見超聲在AnAOB的生長和選擇富集方面具有優(yōu)勢。然而，目前的研究主要集中在超聲參數(shù)(如超聲強度、超聲時間、超聲作用周期)對AnAOB的短期強化效果及其初步的強化機理等方面[23]58,[28]1358，針對特定低強度超聲下Anammox污泥富集培養(yǎng)的長期強化效果報道較少。因此本研究擬采用低強度超聲強化Anammox污泥的富集，在參照前人的研究基礎(chǔ)上選擇適宜的超聲參數(shù)，在超聲條件下，采用厭氧序批式反應(yīng)器接種處理養(yǎng)殖沼液的自然塘污泥富集馴化Anammox污泥，考察污泥長期馴化過程中反應(yīng)器的脫氮性能和微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況，旨在為Anammox污泥的快速富集培養(yǎng)和Anammox工藝的應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

實驗在兩個平行運行的有效容積為1.5 L的厭氧序批式反應(yīng)器中進行，其中一個為對照組(R1反應(yīng)器)，另一個與超聲清洗機(KQ250DB)耦合作為實驗組(R2反應(yīng)器)。反應(yīng)器每個循環(huán)的運行時間為24.0 h，包括進水(20 min)、混合反應(yīng)(22.0 h)、靜置(1.5 h)、出水(10 min)。實驗組根據(jù)反應(yīng)器運行效率，定期使用超聲清洗機超聲處理污泥。超聲方法：在排水后，將反應(yīng)器中全部泥水混合物置于血清瓶中，并將血清瓶置于超聲清洗機中，超聲功率為180 W，超聲時間為5 min，處理后將泥水混合物倒回反應(yīng)器中進行富集馴化。裝置示意圖見圖1。

圖1 裝置示意圖

1.2 接種污泥與模擬廢水

接種污泥為處理養(yǎng)殖沼液的自然塘污泥，污泥顏色為黑色，其混合液懸浮固體(MLSS)質(zhì)量濃度為27.87 g/L，混合液揮發(fā)性懸浮固體(MLVSS)質(zhì)量濃度為18.35 g/L，MLVSS/MLSS=0.66。

模擬廢水[30]：氨氮和亞硝酸鹽氮分別由NH4Cl和NaNO2按需配置，KH2PO410 mg/L，KHCO31 250 mg/L，CaCl2·2H2O 5.6 mg/L，MgSO4·7H2300 mg/L，微量元素濃縮液各1.0 mL/L，微量元素濃縮液組成見表1。

表1 微量元素濃縮液組成

1.3 實驗方法

將未經(jīng)超聲處理和經(jīng)超聲處理后的污泥分別接種于R1、R2反應(yīng)器，采用智能溫控電伴熱帶(WK-SM3)將反應(yīng)器內(nèi)的溫度控制在(33±1) ℃，固定水力停留時間(HRT)為24.0 h，維持進水氨氮250 mg/L和亞硝酸鹽氮350 mg/L不變，3 d取一次水樣測定反應(yīng)器內(nèi)的氮去除情況，待R2反應(yīng)器去除效率穩(wěn)定或與R1反應(yīng)器較接近時，再次對R2反應(yīng)器的污泥進行超聲強化，待氨氮基本去除后馴化結(jié)束，整個馴化過程歷時56 d。

1.4 分析項目及方法

氨氮、亞硝酸鹽氮、MLSS和MLVSS的測定按照文獻[31]進行；胞外聚合物(EPS)采用超聲提取法提取，用Folin-Lowry法測EPS中蛋白質(zhì)(PN)，用蒽酮法測EPS中多糖(PS)[32]；污泥微生物形態(tài)用掃描電子顯微鏡(SEM，Quanta 200FEG)觀察。微生物群落結(jié)構(gòu)：在馴化初期、中期、后期(分別為第1、38、56天)從R1和R2反應(yīng)器中取泥(馴化初期R1和R2反應(yīng)器的泥樣分別命名為R1.1和R2.1，中期為R1.2、R2.2，后期為R1.3、R2.3)，將污泥樣品冷凍保存后送至北京某公司測序分析。熒光原位雜交(FISH)分析：馴化末期(第56天)，從反應(yīng)器內(nèi)取泥進行FISH實驗，其所用的探針見表2[33]。

表2 FISH所用探針信息

2 結(jié)果與討論

2.1 脫氮性能的變化情況

圖2和圖3分別為污泥富集培養(yǎng)過程中氨氮和亞硝酸鹽氮的變化情況。由于養(yǎng)殖沼液中含有較高濃度的氨氮，處理養(yǎng)殖沼液的自然塘污泥也具有一定的脫氮能力(如Anammox或反硝化能力)[34]1306，馴化初期(第3天)，未加載超聲的R1反應(yīng)器的氨氮和亞硝酸鹽氮的出水質(zhì)量濃度分別為250.51、330.10 mg/L，其去除量分別為10.54、12.53 mg/L。加載超聲的R2反應(yīng)器，第3天氨氮和亞硝酸鹽氮的出水質(zhì)量濃度分別為240.08、320.23 mg/L，其去除量分別為17.98、32.40 mg/L，氨氮和亞硝酸鹽氮的去除效率分別是R1反應(yīng)器的1.7、2.6倍。文獻[23]、[35]表明，超聲處理后，機械效應(yīng)、熱效應(yīng)等會使細(xì)胞膜變薄，加快傳質(zhì)過程，增強酶活性，促進微生物生長，提高反應(yīng)效率。隨后R1反應(yīng)器的出水氨氮和亞硝酸鹽氮濃度呈波動趨勢，R2反應(yīng)器的出水氨氮和亞硝酸鹽氮濃度則不斷降低，明顯低于R1反應(yīng)器，至第38天時，R2反應(yīng)器的出水氨氮和亞硝酸鹽氮濃度降低趨勢減弱，其出水質(zhì)量濃度分別為206.85、244.08 mg/L，去除量分別為65.78、95.56 mg/L，亞硝酸鹽氮、氨氮轉(zhuǎn)化比為1.45∶1.00。R1反應(yīng)器在第38 天的氨氮和亞硝酸鹽氮的去除量僅分別為62.61、52.96 mg/L，亞硝酸鹽氮、氨氮轉(zhuǎn)化比為0.85∶1.00。R2反應(yīng)器的氨氮去除效率僅比R1反應(yīng)器高22.65%，明顯低于馴化初期，推測超聲的優(yōu)勢作用在逐步消失，多位研究者發(fā)現(xiàn)超聲對AnAOB作用的最適周期為6～7 d[23]56,[28]1358，但本研究持續(xù)至38 d時仍有一定的優(yōu)勢，說明在污泥馴化過程中超聲的作用周期可以更長，推測馴化前期超聲的作用使得R2反應(yīng)器中AnAOB的活性明顯大于R1反應(yīng)器，同時伴隨有其他同向富集效應(yīng)如EPS的增加(具體分析見2.2節(jié))[23]56，使AnAOB更趨于富集團聚，從而表現(xiàn)出在污泥富集馴化過程中超聲的作用周期長于6～7 d。

圖2 氨氮的變化

圖3 亞硝酸鹽氮的變化

為了進一步強化AnAOB的富集，在38 d時，對R2反應(yīng)器的污泥進行二次超聲強化。二次超聲強化后，R2反應(yīng)器的去除性能不斷得到提升，至56 d時，R2反應(yīng)器的氨氮基本去除完全，其氨氮和亞Table 2 The message for FISH probesFig.2 Changes of ammonia nitrogen

Fig.3 Changes of nitrite nitrogen硝酸鹽氮的去除量分別為228.09、273.88 mg/L，亞硝酸鹽氮、氨氮轉(zhuǎn)化比為1.20∶1.00，接近于Anammox理論轉(zhuǎn)化比(1.32∶1.00)，同時伴隨有硝酸鹽氮的生成和氮氣的產(chǎn)生，由此可見Anammox污泥在一定程度上得到了富集。38～56 d期間，R1反應(yīng)器的氨氮出水濃度逐步降低，至56 d時，R1反應(yīng)器的出水氨氮質(zhì)量濃度為144.54 mg/L，去除量為91.14 mg/L；而此過程R1反應(yīng)器的出水亞硝酸鹽氮濃度有升高，由低于進水逐步升高至高于進水，至56 d時，R1反應(yīng)器的出水亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度為418.07 mg/L，比進水高53.96 mg/L，說明系統(tǒng)內(nèi)亞硝酸鹽氮消耗反應(yīng)在減弱，亞硝酸鹽氮生成反應(yīng)在增強，即Anammox反應(yīng)在減弱，氨氧化或反硝化反應(yīng)在增強，其對應(yīng)的功能微生物表現(xiàn)出同樣的變化趨勢(具體分析見2.3節(jié))。

綜上所述，以處理養(yǎng)殖沼液的自然塘污泥為種泥，在180 W 5 min超聲2次強化下，經(jīng)56 d可成功實現(xiàn)Anammox污泥的富集培養(yǎng)，其富集培養(yǎng)時間相比于常用的強化富集方法，如添加填料載體(93 d)[36]、鐵元素(87 d)[37]等明顯縮短。富集培養(yǎng)的Anammox污泥的氨氮和亞硝酸鹽氮去除速率分別為228.09、273.88 mg/(L·d)，亞硝酸鹽氮、氨氮轉(zhuǎn)化比為1.20∶1.00。

2.2 污泥外觀和EPS的變化情況

污泥馴化過程中，R2反應(yīng)器污泥的顏色由最初的黑色逐步變?yōu)榧t棕色，而R1反應(yīng)器污泥的顏色由最初的黑色逐步變?yōu)辄S棕色。為了進一步了解污泥的微生物形態(tài)，對馴化后期(第56天)的污泥進行SEM觀察，結(jié)果見圖4。在R2反應(yīng)器馴化末期的污泥中發(fā)現(xiàn)了大量的球狀菌(見圖4(b))，推測為AnAOB，但在R1反應(yīng)器中并未見明顯的球狀菌存在(見圖4(a))。

圖4 R1和R2反應(yīng)器馴化末期污泥SEM圖

馴化過程中，污泥表面EPS的變化情況見表3。經(jīng)超聲處理1 d后的R2反應(yīng)器的PN、PS質(zhì)量濃度分別為48.44、28.39 mg/g，高于R1反應(yīng)器的34.46、17.69 mg/g。由此可見，超聲處理可使污泥的EPS增多[23]56。經(jīng)第1次超聲強化后，隨著污泥進一步馴化，R2、R1反應(yīng)器的PN和PS均呈逐步增加的趨勢，且R2大于R1。研究表明，在Anammox污泥馴化過程中，高EPS有利于AnAOB間的相互黏附、聚集和信息交流[38-39]。由此可見R2反應(yīng)器經(jīng)短期超聲強化后，EPS的分泌量增加，增加的EPS使AnAOB同向聚集效應(yīng)增加，利于Anammox污泥富集，使得超聲強化作用周期延長。經(jīng)第2次超聲強化，至56 d時，R2反應(yīng)器的PN、PS分別增長至70.10、32.13 mg/g，同時PN/PS也在逐步增加。研究表明較高的PN/PS使得Anammox污泥的活性、穩(wěn)定性和沉淀性能更強[40]，這說明本研究以處理養(yǎng)殖沼液的自然塘污泥為種泥，經(jīng)超聲強化后，Anammox污泥逐步得到了富集。而R1反應(yīng)器污泥EPS的分泌量在減少，PN/PS也在降低，說明R1反應(yīng)器的污泥性能在惡化，與脫氮性能的變化趨勢相符。

表3 污泥表面EPS的變化情況

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況

Anammox污泥富集培養(yǎng)過程中，門水平的微生物群落結(jié)構(gòu)變化情況見圖5。從圖5可以看出，污泥富集前后微生物群落結(jié)構(gòu)變化差異較大。馴化初期厚壁菌門、擬桿菌門相對豐度較大(在圖5中的顏色較深，相對豐度>10%)，后期，R1和R2反應(yīng)器的厚壁菌門、擬桿菌門均大幅減少(在圖5中的顏色逐步變淺)。變形菌門(多數(shù)氮轉(zhuǎn)化菌所在的門類)在R1和R2反應(yīng)器中的相對豐度則明顯增加(在圖5中的顏色逐步變深)，在馴化后期增加至30%左右。由此可見R1和R2反應(yīng)器內(nèi)均存在較高豐度的脫氮菌。AnAOB所在的浮霉菌門在R2反應(yīng)器中表現(xiàn)出明顯增加的趨勢(在圖5中的顏色由淺逐步變深)，而在R1反應(yīng)器中則表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(在圖5中的顏色先由淺逐步變深最后再變淺)。從脫氮菌屬水平的變化結(jié)果(見表4)可知，R2反應(yīng)器內(nèi)富集的AnAOB菌主要為待定庫氏菌、待定杰特氏菌，這與處理養(yǎng)殖沼液等常規(guī)系統(tǒng)富集的待定布羅卡地菌(CandidatusBrocadia)有所不同[34]1306,[41]，由此可見超聲作用對AnAOB菌屬種類的富集存在選擇性差異。另外在馴化后期，R1、R2反應(yīng)器中均發(fā)現(xiàn)了大量的反硝化菌(如紅桿菌、芽孢桿菌、脫硝彎桿菌等)，但R1反應(yīng)器的反硝化菌的相對豐度總和22.769%均明顯大于R2反應(yīng)器的17.726%；且R2反應(yīng)器的硝化細(xì)菌的相對豐度總和0.332%大于R1反應(yīng)器的0.084%。由此可見經(jīng)56 d的富集培養(yǎng)后，經(jīng)超聲處理的R2反應(yīng)器的AnAOB相對豐度在增加。而未經(jīng)超聲處理的R1反應(yīng)器的AnAOB相對豐度在減少，但其反硝化菌的豐度在大幅增加，因此R1反應(yīng)器后期亞硝酸鹽氮消耗反應(yīng)在減弱，亞硝酸鹽氮生成反應(yīng)在增強，表現(xiàn)為出水亞硝酸鹽氮濃度大于進水，與2.1節(jié)亞硝酸鹽氮的變化趨勢相符。多位研究者發(fā)現(xiàn)選擇性地控制超聲條件能夠使目標(biāo)菌群活性增強并且抑制其他菌群的活性[26]1591,[27]283，因R2反應(yīng)器中施加了180 W 5 min超聲，抑制了部分反硝化菌的活性，促進了AnAOB的富集，因此R2反應(yīng)器中AnAOB的相對豐度較高。此外，對馴化后期的污泥進行FISH分析，R2反應(yīng)器中的AnAOB表現(xiàn)出一定強度的紅色熒光信號，而R1反應(yīng)器的污泥中并未發(fā)現(xiàn)明顯的紅色熒光信號，這與高通量測序、SEM和氮的去除效率結(jié)果一致，進一步佐證了超聲在Anammox污泥的富集培養(yǎng)方面具有一定的優(yōu)勢。

表4 屬水平的脫氮菌的變化情況1)

注：同一門類顏色越深代表相對豐度越大。

3 結(jié) 論

(1) 以處理養(yǎng)殖沼液的自然塘污泥為種泥，在超聲強化下，56 d可成功實現(xiàn)Anammox污泥的富集培養(yǎng)，其氨氮和亞硝酸鹽氮的去除速率分別為228.09、273.88 mg/(L·d)，其亞硝酸鹽氮、氨氮轉(zhuǎn)化比為1.20∶1.00。

(2) 污泥馴化過程中，R2反應(yīng)器污泥的顏色由最初的黑色逐步變?yōu)榧t棕色，EPS的分泌量不斷增加，其中PN的分泌量大于PS，PN/PS也在逐步升高。

(3) 經(jīng)56 d的富集培養(yǎng)，R2反應(yīng)器的AnAOB相對豐度逐步增加。而未經(jīng)超聲處理的R1反應(yīng)器的AnAOB相對豐度先增加后減少，其反硝化菌的相對豐度大幅增加。180 W 5 min超聲處理有利于選擇性富集培養(yǎng)Anammox污泥。