王真昕，申華莉，楊芃原

(1.復(fù)旦大學(xué) 上海醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)研究院,上海 200032;2.復(fù)旦大學(xué) 附屬中山醫(yī)院 檢驗(yàn)科,上海 200032;3.復(fù)旦大學(xué) 附屬閔行醫(yī)院,上海 201199;4.復(fù)旦大學(xué) 化學(xué)系,上海 200433)

采用現(xiàn)代分析方法進(jìn)行臨床醫(yī)學(xué)樣本的分析檢驗(yàn)已經(jīng)成為生命科學(xué)中的一個(gè)重要領(lǐng)域,并已形成基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)等分支學(xué)科,具有極大的臨床醫(yī)學(xué)價(jià)值。2003年,文獻(xiàn)[1]根據(jù)生命新陳代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一系列脂質(zhì)分子這一現(xiàn)象,提出了脂質(zhì)組學(xué)概念。2014年,Nature發(fā)表了一系列針對(duì)脂質(zhì)組學(xué)的評(píng)述[2-7],標(biāo)志著脂質(zhì)組學(xué)同基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)一起,已經(jīng)發(fā)展成為了生命科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)分支學(xué)科。脂質(zhì)是一類具有疏水性或親水親油兩親性的小分子,已知的脂質(zhì)分子有十萬(wàn)多種。人體血液中的脂質(zhì)為人體新陳代謝紊亂的產(chǎn)物,而非過(guò)量飲食油脂形成的的剩余產(chǎn)物,它是一個(gè)由多種脂質(zhì)分子形成的集合體。當(dāng)血液中的脂質(zhì)沉積在血管壁上形成斑塊并導(dǎo)致血管堵塞時(shí),就形成了動(dòng)脈粥樣硬化,這種疾病是冠心病(CAD)的早期病理現(xiàn)象。其冠狀動(dòng)脈閉塞持續(xù)時(shí)間不小于3個(gè)月,且存在0級(jí)血流的心肌梗死(TIMI)的患者被定義為冠狀動(dòng)脈慢性完全堵塞(CTO)患者,這類患者占所有冠心病患者的三分之一。這類疾病危險(xiǎn)性大、且死亡率高。近年來(lái),CTO 發(fā)病人數(shù)逐年增多,嚴(yán)重影響人民的生活質(zhì)量,但是CTO 存在發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病因目前仍未闡明、預(yù)后較差且沒(méi)有較為有效的治療手段和藥物等問(wèn)題。針對(duì)這一現(xiàn)狀,可采用現(xiàn)代分析方法尋找突破口。高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)因適合微量醫(yī)學(xué)樣本中生命物質(zhì)、藥物和代謝產(chǎn)物的檢測(cè)而備受注目,目前在生物醫(yī)學(xué)試樣血樣、尿樣的檢測(cè)與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)、藥物等的檢測(cè)中已有應(yīng)用[8-10]。

組學(xué)研究中,Shotgun法能夠在海量的組學(xué)分子中最大限度地獲取試樣中的組學(xué)分子信息,是組學(xué)研究中首選的分析方法[11]。而Shotgun法的缺點(diǎn)是在進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)時(shí),可能有部分中性分子被歧視而“丟失”,從而導(dǎo)致漏檢。為此,試驗(yàn)采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)法對(duì)中性脂質(zhì)分子進(jìn)行了補(bǔ)充檢測(cè)。據(jù)此,本工作采用HPLC-MS對(duì)患者血清試樣進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)研究,將Shotgun法與MSM 法相結(jié)合,探查了患者在不同病患階段時(shí)血清試樣中脂質(zhì)分子組成[如磷脂酰乙醇胺類化合物(PE)、磷脂酰膽堿類化合物(PC)、磷脂酰絲氨酸類化合物(PS)、磷脂酰甘油類化合物(PG)、磷脂酰肌醇類化合物(PI)、磷脂酸類化合物(PA)、溶血磷脂酰膽堿類化合物(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺類化合物(LPE)、膽固醇酯類化合物(CE)、三酰基甘油類化合物(TAG)、二?；视皖惢衔?DAG)和鞘磷脂類化合物(SM)]的變化,從中找出與疾病發(fā)展密切相關(guān)的標(biāo)志性脂質(zhì)分子,并將這些脂質(zhì)分子標(biāo)志物應(yīng)用于冠心病的臨床診斷的早期預(yù)測(cè)以及手術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的評(píng)估,以期為脂質(zhì)組學(xué)在CTO 臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-20AB HPLC 系 統(tǒng);AB Sciex 6500 QTRAP型三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜系統(tǒng);5810R 型離心機(jī)。

混合脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)溶液:由PE 15∶0/18∶1(d7)、PC 15∶0/18∶1(d7)、PS 15∶0/18∶1(d7)、PG 15∶0/18∶1(d7)、PI 15∶0/18∶1(d7)、PA 15∶0/18∶1(d7)、LPC 18∶1(d7)、LPE 18∶1(d7)、CE 18∶1(d7)、DAG 15∶0/18∶1(d7)、TAG 15∶0/18∶1(d7)/15∶0和SM 18∶1(d9)組成。

杜爾貝科磷酸鹽緩沖溶液(DPBS),pH 為7.2。

異丙醇、甲醇、正己烷均為質(zhì)譜純;甲酸、氯仿、乙酸銨均為色譜純;磷酸、氯化鉀為分析純。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 用于Shotgun法測(cè)定

電噴霧離子源(ESI),進(jìn)樣流量為10μL·min－1;正、負(fù)離子噴霧電壓分別為5,－4.5 kV;掃描方式為母離子(PI)掃描結(jié)合中性丟失粒子(NL)掃描,掃描速率質(zhì)荷比(m/z)200/s,掃描范圍m/z400～1 000。

1.2.2 用于MSM 法測(cè)定

1)色譜條件 Phenomenex硅膠柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫25 ℃;進(jìn)樣量10μL;流量300μL·min－1;流動(dòng)相:A 為體積比為58∶40∶2的異丙醇-正己烷-100 mmol·L－1乙酸銨溶液的混合溶液,B為體積比為50∶40∶10異丙醇-正己烷-100 mmol·L－1乙酸銨溶液的混合溶液。梯度洗脫程序:0～10 min 時(shí),B 由50%升至100%,保持10 min;20～21 min時(shí),B 由100%降至50%,保持9 min。

2)質(zhì)譜條件 ESI;正、負(fù)離子噴霧電壓分別為5,－4.5 kV;MRM 模式;掃描范圍m/z400～1 000。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣本采集

將采集的樣本分為四組:CTO 疑似人群(對(duì)照組)、CTO 患者組、CTO 患者在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)手術(shù)后24 h 組,以及CTO 患者在PCI手術(shù)后72 h組(后3組分別對(duì)應(yīng)PCI手術(shù)前、手術(shù)中和手術(shù)后,醫(yī)學(xué)上統(tǒng)稱“圍術(shù)期”)。采集的全血血樣在室溫下靜置1 h后,以3 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min,分離上層血清,在－80 ℃下冷凍儲(chǔ)藏。

1.3.2 血清中脂質(zhì)的提取

1)用于Shotgun法的脂質(zhì)提取 將血清放在液氮中解凍并平衡至室溫,搖動(dòng)混勻。分取200μL血清于10 mL帶有聚四氟乙烯蓋帽的玻璃管中,每個(gè)樣品加入10μL混合脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)溶液,再加入體積比為10∶10∶1的甲醇-氯仿-甲酸的混合溶液,于－20 ℃下靜置過(guò)夜。最后加入含有1 mol·L－1氯化鉀溶液 的0.2 mol·L－1磷酸溶 液2.2 mL,以3 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心5 min,靜置,離心管中的樣品溶液分成三層。用玻璃滴管穿過(guò)上層甲醇相,吸取含有脂質(zhì)的中層相于另一個(gè)玻璃離心管中,再用1 mL三氯甲烷洗滌上層甲醇相,重復(fù)上述步驟兩次,合并中層相。在室溫下以溫和的氮?dú)鈿饬鞔蹈芍袑酉?用1 mL流動(dòng)相A 復(fù)溶,以12 000 r·min－1轉(zhuǎn)速于4 ℃下離心45 min,按照1.2.1節(jié)儀器工作條件分析上清液。

2)用于MRM 法的脂質(zhì)提取 將血清放在液氮中解凍并平衡至室溫,加入10μL 的混合脂質(zhì)內(nèi)標(biāo)溶液后,再將血清在液氮中反復(fù)凍融5 次,加入2 mL DPBS和2 mL體積比為25∶75的乙酸乙酯-異辛烷混合溶液,以1 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心5 min。用玻璃滴管吸取上層含有脂質(zhì)的乙酸乙酯-異辛烷相到另一個(gè)玻璃離心管中,用1 mL 體積比為25∶75 的乙酸乙酯-異辛烷混合溶液洗滌下層DPBS相,重復(fù)上述步驟兩次,合并乙酸乙酯-異辛烷相。用溫和的氮?dú)鈿饬鞔蹈梢宜嵋阴?異辛烷相。加入1 mL含有100 mmol·L－1氫氧化鋰溶液的甲醇復(fù)溶,以12 000 r·min－1轉(zhuǎn)速于4 ℃下離心45 min。按照1.2.2節(jié)儀器工作條件分析上清液。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和檢索結(jié)果

用Shotgun法對(duì)脂質(zhì)提取上清液進(jìn)行分析,通過(guò)儀器自帶軟件Analyst 1.6對(duì)質(zhì)譜獲得的脂質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,并通過(guò)生物信息學(xué)工具“Lipid MS Predict”[12]確認(rèn)脂質(zhì)分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在4組樣本中總共鑒定得到1 504種脂質(zhì)分子,確定了鏈長(zhǎng)在15～65(碳原子數(shù))之間的脂肪酸側(cè)鏈分布。其中,CTO 患者組血清中的TAG 類化合物含量上升、DAG 類化合物含量下降;其中具有C14∶1、C18∶2和C19∶0脂肪酰基鏈的分子被鑒定為具有標(biāo)志性差異的脂質(zhì)分子,特別是C14∶1,其在CTO 患者組中降低特別顯著,術(shù)后其含量趨于正常。對(duì)于CTO 疑似人群及PCI手術(shù)前、手術(shù)中及手術(shù)后的CTO 患者,對(duì)應(yīng)血清中的脂肪?；趪g(shù)期的不同時(shí)段存在明顯的變化趨勢(shì)[13],具有顯著的識(shí)別作用。

2.2 脂質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果及其臨床醫(yī)學(xué)意義

用MRM 法進(jìn)一步對(duì)脂質(zhì)提取上清液分析,共獲得631個(gè)具有臨床意義的脂質(zhì)分子,包括在正離子模式下檢測(cè)得到的403個(gè)脂質(zhì)分子(以PA、CE、PE、PC和SM 類化合物為主),和在負(fù)離子模式下檢測(cè)得到的228個(gè)脂質(zhì)分子(以PS、PI和PG 類化合物為主)[12]。

對(duì)CTO 早期診斷及CTO-PCI手術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)密切相關(guān)的脂質(zhì)主要是DAG、PA、PC 以及SM類化合物。采用變量投影重要性(VIP)準(zhǔn)則進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并篩選出對(duì)區(qū)分效果貢獻(xiàn)較大的標(biāo)志性差異脂質(zhì)分子,在篩選出的210個(gè)標(biāo)志性差異脂質(zhì)分子中,VIP值最高的3個(gè)脂質(zhì)分子分別為PA 10∶0/19∶0、LPE 18∶0以及CE 16∶1,這3個(gè)脂質(zhì)分子對(duì)于PCI手術(shù)前、中、后等3樣本的區(qū)分具有標(biāo)志性的作用。VIP 值最高的15 個(gè)差異脂質(zhì)分子中,LPE類化合物占5個(gè),均在CTO 對(duì)照組中呈高水平分布,但它在CTO 患者中的分布下降,在PCI手術(shù)后的分布降至最低。與之相反的是,CE 類化合物在CTO 患者血清中的分布水平都顯著高于對(duì)照組的。

通過(guò)受試者工作特征(ROC)曲線進(jìn)行分類評(píng)價(jià),得到179個(gè)評(píng)價(jià)曲線下的積分面積(AUC)大于0.6的脂質(zhì)分子,這些分子對(duì)于CTO 具有高診斷價(jià)值,尤其是積分面積大于0.9 的9 個(gè)脂質(zhì)分子,即LPE 18∶1、LPE 18∶0、CE 16∶1、LPE 18∶2、PC 34∶2、LPE 17∶0、神經(jīng)酰胺Cer 18∶1/24∶1、SM 18∶1/16∶0以及SM 18∶1/18∶0,對(duì)早期診斷、判定具有確切價(jià)值。

結(jié)合臨床回訪結(jié)果和脂質(zhì)組學(xué)分析數(shù)據(jù),可以發(fā)現(xiàn):與預(yù)后良好的CTO 患者相比,預(yù)后不良的CTO 人群存在術(shù)前PA 類化合物升高,PC 類化合物降低。尤其是PA 的升高與預(yù)后不良呈正相關(guān)。PA 18:3/19∶0、PA 17∶2/20∶1以及PA 13∶0/18∶1升高的患者在手術(shù)后更加趨向于發(fā)生心肌損傷或者發(fā)生血管再狹窄。從術(shù)后脂質(zhì)分布水平來(lái)看,術(shù)后CE分布水平的差異可預(yù)示不同的中長(zhǎng)期預(yù)后情況,CE 16∶1、CE 24∶0升高或CE 19∶0下降的患者預(yù)后趨于不良。這些結(jié)果對(duì)術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)具有實(shí)際的臨床醫(yī)學(xué)意義。

本工作采用HPLC-MS研究了CTO 疑似人群及CTO 患者在手術(shù)前、手術(shù)中和手術(shù)后的血清樣本,對(duì)得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了質(zhì)譜庫(kù)檢索。利用脂質(zhì)組學(xué)研究確認(rèn)了標(biāo)志性脂質(zhì)分子,結(jié)果對(duì)心血管疾病的臨床早期診斷和手術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)具有明確的指導(dǎo)意義。