秦玉燕，藍(lán) 唯，蔣越華，王運(yùn)儒，時(shí)鵬濤，呂麗蘭，呂玉蓮

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(南寧),南寧 530001)

砷是一種毒性較強(qiáng)的重金屬污染物,是國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)最早確認(rèn)的一類致癌物。攝入過量的砷可導(dǎo)致皮膚、消化、神經(jīng)、生殖、造血以及免疫等系統(tǒng)不同程度的損傷。砷的毒性與其形態(tài)密切相關(guān),無機(jī)砷包括砷酸[As(Ⅴ)]和亞砷酸[As(Ⅲ)],毒性均很強(qiáng),且As(Ⅲ)毒性是As(Ⅴ)的60倍;有機(jī)砷如一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)毒性較弱;在海洋生物中分布較多的有機(jī)砷如砷膽堿(AsC)、砷甜菜堿(AsB)、砷糖、砷脂等基本無毒。因此,以總砷含量高低來評價(jià)食品的安全性并不科學(xué),砷形態(tài)的分析對食品安全和環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)評估具有重要意義。

目前,砷形態(tài)分析的前處理方式包括熱浸提[1]、振蕩提取[2]、超聲輔助提取[3]和微波輔助提取[4]等。文獻(xiàn)[5]在85 ℃下以0.15 mol·L－1硝酸溶液熱浸提菟絲子藥材1.5 h,得到其中6種砷形態(tài)的回收率為91.7%～105%。文獻(xiàn)[6]以體積比為1∶1的甲醇-水溶液超聲提取飼料樣品中的7種砷形態(tài),得到的回收率為76.3%～108%。由于砷形態(tài)不穩(wěn)定,樣品前處理過程的關(guān)鍵是在保證樣品中砷的原始形態(tài)不發(fā)生變化的同時(shí)獲得最大的提取效率。熱浸提和振蕩提取一般伴隨加熱,但溫度升高可能會引起砷形態(tài)的變化;超聲輔助提取可將樣品顆粒打碎,增加溶劑與顆粒的接觸面積,使包裹在顆粒內(nèi)部的砷溶出;微波輔助提取操作較為復(fù)雜,實(shí)際應(yīng)用較少[7]。另外,由于樣品中砷形態(tài)的差異和基質(zhì)效應(yīng)的影響,針對不同基質(zhì)的樣品可能需要采用不同的前處理方法。

測定砷形態(tài)最常見的方法是高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)[8-9]和高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HPLCHG-AFS)[10-11]。HPLC-ICP-MS 具有靈敏度高的特點(diǎn),近年來在元素形態(tài)分析方面發(fā)展迅速,但較高的儀器價(jià)格和運(yùn)行費(fèi)用使其無法在普通實(shí)驗(yàn)室普及。HPLC-HG-AFS具有運(yùn)行成本低、操作簡便和靈敏度高等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于砷、汞、硒等元素的形態(tài)分析[12]。

蔬菜和谷類作物的砷攝入是人類攝取砷的主要途徑,其中,水稻、蔬菜(特別是水生蔬菜)等對砷的富集作用較強(qiáng)[13],且其中的砷主要以As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA 等4種砷形態(tài)存在[14-15]。因此,本工作以大米、蔬菜等植物性樣品為待測對象,通過優(yōu)化樣品前處理方法和儀器工作條件,建立了As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA 等4 種砷形態(tài)的HPLC-HG-AFS分析方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SA-20型原子熒光形態(tài)分析儀,配有100μL進(jìn)樣環(huán)的自動進(jìn)樣器和933型原子熒光光度計(jì);CNW IC-Guard RP凈化小柱(1 mL);ZHSY-50N 型振蕩培養(yǎng)箱;KQ-600型超聲波清洗器;Molcell 1810a細(xì)胞型超純水器;TGL-20M 型醫(yī)用離心機(jī);AB204-S型電子天平。

4種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:10 mg·L－1,介質(zhì)為水。其他所需質(zhì)量濃度均由此溶液用水稀釋制得。

砷酸根標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 08667,17.5μg·g－1,以硒計(jì));亞砷酸根標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 08666,75.7μg·g－1);MMA 標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)(GBW 08668,25.1μg·g－1);DMA 標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì)(GBW 08669,52.9μg·g－1)。大米粉 標(biāo)準(zhǔn)物 質(zhì) GBW (E)100356、GBW(E)100351、GBW(E)100348。

其他試劑均為分析純及以上;玻璃儀器均需在洗滌干凈后在25%(體積分?jǐn)?shù),下同)硝酸溶液中浸泡24 h,用水洗凈,晾干,備用。試驗(yàn)用水為一級水(電阻率不小于18.25 MΩ·cm)。

1.2 儀器工作條件

1)HPLC 條件 Hamilton PRP-X100色譜柱(250 mm×4.1 mm,10μm);流動相為25 mmol·L－1磷酸氫二銨-甲酸溶液(pH 6.0),等度洗脫,流量1.0 mL·min－1;進(jìn)樣體積100μL。

2)HG-AFS條件 還原劑為22.5 g·L－1硼氫化鉀和5 g·L－1氫氧化鈉混合溶液;載流為1.2 mol·L－1鹽酸溶 液;負(fù)高壓300 V;燈電流100 mA;輔助電流50 mA,載氣流量500 mL·min－1,屏蔽氣流量600 mL·min－1。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取1.000 g樣品于離心管中,加入0.15 mol·L－1硝酸溶液10 mL,超聲提取30 min,然后以8 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心10 min,吸出上清液,重復(fù)提取1次,合并上清液,過0.45μm 水系濾膜后用CNW IC-Guard RP小柱凈化,按照儀器工作條件測定砷形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan′s進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

砷形態(tài)的常用提取溶劑主要是水、酸溶液和甲醇溶液[16]。試驗(yàn)對比了水、0.15 mol·L－1硝酸溶液和50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),水的提取效率最低;0.15 mol·L－1硝酸溶液的提取效率最高;50%甲醇溶液提取的樣品中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的峰形變寬,可能是由于樣品中殘留的少量甲醇引起的峰拖尾。因此試驗(yàn)選擇0.15 mol·L－1硝酸溶液為提取溶劑。

基于文獻(xiàn)[17-18],以已知總砷含量為0.54 mg·kg－1的蓮藕為待測對象,試驗(yàn)比較了70 ℃水浴振蕩提取2 h、90 ℃電熱板熱浸提2 h和超聲提取30 min等3種不同提取方式對砷形態(tài)的提取效果。計(jì)算3種方式下的4種砷形態(tài)提取率及含量總和,并對其進(jìn)行顯著性差異分析,結(jié)果見表1。同時(shí)還進(jìn)行了2個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見表1。其中,測定值、砷形態(tài)總和和提取率為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(),a,b為差異顯著(P＜0.05)標(biāo)識;砷形態(tài) 總和為As(Ⅲ)、DMA、MMA 和As(Ⅴ)質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和;提取率為砷形態(tài)總和占總砷含量的百分比。

由表1可知:蓮藕中主要的砷形態(tài)為As(Ⅲ)和As(Ⅴ);3種提取方式得到的砷提取率為87.7%～96.3%,其中,超聲提取的砷提取率最高。差異性分析結(jié)果表明,超聲提取得到的砷形態(tài)總和提取率的結(jié)果均顯著高于水浴振蕩提取和電熱板熱浸提(P＜0.05);3種提取方式得到的回收率為75.6%～101%,其中,超聲提取對As(Ⅴ)、DMA 和MMA等3種砷形態(tài)的回收率均高于水浴振蕩提取和電熱板熱浸提的。綜合考慮,試驗(yàn)選擇的提取方式為超聲提取。

表1 不同提取方式的影響Tab.1 Effect of the different extraction methods

試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),提取溶液經(jīng)CNW IC-Guard RP小柱凈化后,可以有效去除樣品中的有機(jī)物雜質(zhì),改善色譜峰峰形和延長色譜柱的使用壽命。因此,試驗(yàn)在對樣品進(jìn)行提取后又增加了CNW IC-Guard RP小柱凈化這一步驟。

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相酸度

以40 mmol·L－1磷酸氫二銨溶液為流動相,用20%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液調(diào)節(jié)其酸度,考察了不同流動相酸度對砷形態(tài)分離效果的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 4種砷形態(tài)的保留時(shí)間隨流動相酸度變化的曲線Fig.1 Curves showing changes of retention time of 4 arsenic species with the acidity of mobile phase

由圖1可知:流動相pH 為4.5～8.0 時(shí),隨著pH 增大,As(Ⅲ)的保留時(shí)間變化不明顯,DMA 和As(Ⅴ)的保留時(shí)間緩慢延長,MMA 的保留時(shí)間緩慢縮短。流動相pH 為4.5～5.0 時(shí),As(Ⅲ)和DMA 部分重疊;pH 為6.5～8.0時(shí),DMA 和MMA保留時(shí)間部分重疊;pH 為5.5～6.0時(shí),4種砷形態(tài)可完全分離,其中,pH 6.0時(shí)分離效果最好,因此試驗(yàn)選擇流動相的pH 為6.0。

2.2.2 流動相濃度

試驗(yàn)考察了流動相濃度對4種砷形態(tài)分離效果的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 4種砷形態(tài)的保留時(shí)間隨磷酸氫二銨濃度變化的曲線Fig.2 Curves showing changes of retention time of 4 arsenic species with concentration of potassium hydrogen phosphate solution

由圖2可知:當(dāng)磷酸氫二銨溶液的濃度為15～50 mmol·L－1時(shí),隨著濃度的增大,As(Ⅲ)的保留時(shí)間變化不明顯,DMA 和MMA 的保留時(shí)間緩慢縮短,As(Ⅴ)的保留時(shí)間顯著縮短;當(dāng)磷酸氫二銨溶液濃度為45～50 mmol·L－1時(shí),As(Ⅲ)、DMA和MMA 會發(fā)生部分色譜峰重疊;當(dāng)磷酸氫二銨溶液濃度為15～40 mmol·L－1時(shí),4種砷形態(tài)可完全分離。綜合考慮分離度和工作效率,試驗(yàn)選擇磷酸氫二銨的濃度為25 mmol·L－1,此時(shí),4種砷形態(tài)在9 min內(nèi)完全分離,色譜圖見圖3。

圖3 4種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.3 Chromatogram of mixed standard solution of 4 arsenic species

2.3 氫化物發(fā)生條件的優(yōu)化

2.3.1 硼氫化鉀質(zhì)量濃度

試驗(yàn)考察了硼氫化鉀的質(zhì)量濃度對砷峰面積的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 4種砷形態(tài)的峰面積隨硼氫化鉀溶液質(zhì)量濃度變化的曲線Fig.4 Curves showing changes of peak area of 4 arsenic species with mass concentration of potassium borohydride solution

由圖4可知:當(dāng)硼氫化鉀的質(zhì)量濃度為10.0～22.5 g·L－1時(shí),隨著質(zhì)量濃度的增加,4種砷形態(tài)的峰面積均顯著增大;當(dāng)質(zhì)量濃度大于22.5 g·L－1時(shí),峰面積增加幅度變緩,這是由于隨著硼氫化鉀質(zhì)量濃度的增大,噪音逐漸增強(qiáng)所致。因此試驗(yàn)選擇硼氫化鉀溶液質(zhì)量濃度為22.5 g·L－1。

2.3.2 載流種類

當(dāng)載流提供的氫離子濃度為1.2 mol·L－1時(shí),其與硼氫化鉀反應(yīng)產(chǎn)生的活性氫足夠?qū)⑸檫€原成氣態(tài)氫化物,故試驗(yàn)考察了鹽酸溶液、硝酸溶液和硫酸溶液的濃度均為1.2 mol·L－1時(shí)對砷峰面積的影響,結(jié)果見圖5。

圖5 4種砷形態(tài)的峰面積隨酸種類變化的柱狀圖Fig.5 Histogram showing peak area of the 4 arsenic species with acid type

由圖5 可知:以鹽酸溶液為載流時(shí),As(Ⅲ)、MMA 和As(Ⅴ)的峰面積均最高,DMA 的峰面積僅次于以硫酸溶液為載流時(shí)的,因此試驗(yàn)選擇1.2 mol·L－1鹽酸溶液為載流。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗(yàn)方法測定5,10,20,50,100μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以4種砷形態(tài)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:4 種砷形態(tài)的線性范圍均為5～100μg·L－1,線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表2。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算4種砷形態(tài)的檢出限(3S/N),所得結(jié)果見表2。

表2 4種砷形態(tài)的線性參數(shù)和檢出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits of 4 arsenic species

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對空白樣品進(jìn)行2 個(gè)濃度水平(0.25,0.50 mg·kg－1)的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)加標(biāo)水平測定6次,計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),4種砷形態(tài)的回收率為80.0%～101%,測定值的RSD 為2.1%～5.0%。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對3 種大米粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)100356、GBW(E)100351和GBW(E)100348進(jìn)行測定,結(jié)果見表3,其中無機(jī)砷值為As(Ⅲ)和As(Ⅴ)質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和。

由表3可知:3種大米粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的無機(jī)砷值和砷形態(tài)總和都在推薦范圍之內(nèi),結(jié)果符合試驗(yàn)準(zhǔn)確度的要求。

表3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of test for accurary

2.7 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對大米、芥菜、空心菜、蓮藕、柑橘葉片等植物樣品中的砷形態(tài)進(jìn)行測定,結(jié)果見表4,其中,樣品總砷含量按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.11－2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機(jī)砷的測定》,采用原子熒光法進(jìn)行測定。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of samples

由表4可知:5種樣品中都檢測出了As(Ⅲ)和As(Ⅴ),部分樣品檢出少量DMA,但均未檢出MMA。除了蓮藕樣品外,其他樣品中As(Ⅲ)的含量均高于As(Ⅴ)的,說明大部分植物樣品中的砷主要以毒性較強(qiáng)的As(Ⅲ)存在。4種砷形態(tài)總和與總砷測定結(jié)果基本一致,樣品中砷的提取率為84.2%～104%,說明HPLC-HG-AFS 不僅可以有效分離樣品中的4種砷形態(tài),而且可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。

本工作建立了HPLC-HG-AFS測定植物樣品中4種砷形態(tài)的方法,該方法準(zhǔn)確、簡便、靈敏,適用于植物樣品中4種砷形態(tài)的測定。