藍紹航 羅 俊,2 李娜娜 羅業(yè)浩 陳秋霞 陳靜芹 李宏一 方 剛,3

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西壯醫(yī)應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點實驗室，廣西南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代教育技術(shù)與信息中心，廣西南寧 530200；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院國醫(yī)堂，廣西南寧 530011

抑郁癥是一種常見的精神障礙性疾病[1]，世界衛(wèi)生組織報告指出，2030 年后抑郁癥將成為人們最大的健康挑戰(zhàn)[2]。抑郁癥屬于中醫(yī)“郁證”等范疇，其病位在肝，以肝氣郁結(jié)為關(guān)鍵病機，治療上以疏肝理氣為原則，遣方用藥多以柴胡類方劑疏肝解郁為主[3-4]。柴胡桂枝湯始載于張仲景《傷寒雜病論》，原方主治太陽少陽合病，現(xiàn)代臨床可應(yīng)用于治療外感、神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[5]，柴胡桂枝湯可能是通過增加5-羥色胺的含量而達到抗抑郁的目的。多項研究表明[6-10]，臨床中運用柴胡桂枝湯治療抑郁癥效果明顯。目前臨床上運用柴胡桂枝湯治療抑郁癥的研究較多，但仍缺乏對其相關(guān)作用機制的全面研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是藥物研究的新模式，為中藥發(fā)展提供了新的研究思想[11]。因此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)的思路，深入闡述柴胡桂枝湯多成分、多靶點、多通路協(xié)同治療抑郁癥的作用機制，為后續(xù)臨床實驗研究提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)和參考。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分篩選及靶點預(yù)測

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺篩選柴胡桂枝湯（柴胡、桂枝、白芍、黃芩、人參、半夏、生姜、大棗、甘草）的全部化學(xué)成分，并以口服生物利用度≥30%、類藥性指數(shù)≥0.18 為篩選條件，確定藥物的活性成分。在“Related Targets”一欄中找出其所對應(yīng)的作用靶點，將所有藥物靶點進行合并整理，剔除重復(fù)靶點；利用Perl 語言結(jié)合Uniport 數(shù)據(jù)庫對靶點名稱進行規(guī)范化。

1.2 疾病靶點獲取

以抑郁癥英文名“Depression”為檢索詞，限制檢索條件為“gene”“homo sapiens”，在GeneCards、在線人類孟德爾遺傳、藥物基因組學(xué)知識庫、TTD、DrugBank這5 個數(shù)據(jù)庫中獲取抑郁癥相關(guān)靶點基因，將檢索結(jié)果合并，刪除重復(fù)靶點。

1.3 柴胡桂枝湯與抑郁癥交集靶點篩選

將上述獲得的藥物靶點交集與疾病靶點基因交集通過R 語言繪制維恩圖，對柴胡桂枝湯活性成分靶點與抑郁癥相關(guān)靶點基因進行映射，得到藥物與疾病交集靶點。

1.4 構(gòu)建活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape3.7.2 軟件將以上所得的柴胡桂枝湯所有藥物的活性成分交集和抑郁癥靶點構(gòu)建活性成分-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖并對其進行分析。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)及核心基因預(yù)測

將篩選得到的藥物與疾病交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，進行PPI 分析，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。將獲得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件，使用CytoNCA 插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析篩選關(guān)鍵基因。

1.6 GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析

將篩選得到藥物與疾病交集靶點通過R 語言進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析（兩者均以P ＜0.05 為篩選指標(biāo)）。

1.7 分子對接

為驗證本研究數(shù)據(jù)及結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，選取“1.4”和“1.5”項中度值（degree）排名靠前的活性成分與核心靶點，分別在Pubchem 數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中下載活性成分的小分子配體2D 結(jié)構(gòu)和靶點蛋白的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Autodock vina 軟件進行對接。

2 結(jié)果

2.1 柴胡桂枝湯有效活性成分篩選及靶點預(yù)測

共檢索到柴胡桂枝湯9 味藥材的有效活性成分234 個，其中柴胡17 個、桂枝7 個、白芍13、黃芩36 個、人參22 個、半夏13 個、生姜5 個、大棗29 個、甘草92 個，去重后共獲得204 個有效活性成分，篩選到相應(yīng)作用靶點250 個。

2.2 藥物靶點與疾病靶點交集

經(jīng)分析得到藥物潛在活性成分靶點250 個，抑郁癥疾病基因8197 個，二者得出的交集靶點基因為199 個。見圖1。

圖1 藥物和疾病交集靶點

2.3 活性成分-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

柴胡桂枝湯活性成分-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。圖中共有354 個節(jié)點，其中來源于化合物共154 個，來源于基因共199 個。經(jīng)統(tǒng)計度值較高的有效成分為槲皮素、山柰酚、漢芩黃素等。見表1。

表1 柴胡桂枝湯度值前5 位化學(xué)成分

圖2 活性成分-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)及核心基因預(yù)測

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖共有199 個節(jié)點、777 條邊，鄰接節(jié)點數(shù)目越多，說明這些蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的作用越顯著。見圖3。經(jīng)拓撲分析篩選后關(guān)鍵基因有JUN、Akt1、ESR1等15 個靶點。見圖4。

圖3 交集基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)拓撲分析核心基因

2.5 GO 富集分析和KEGG 通路分析

GO 富集分析共得到2900 條富集結(jié)果，其中生物過程2545 個，細胞組分127 個，分子功能228 個，根據(jù)P 值各取前10 條富集結(jié)果繪制GO 條形圖進行展示，見圖5。KEGG 通路富集分析共得到170 條通路富集結(jié)果，主要涉及感染、炎癥、免疫等多條通路，根據(jù)P 值取前30 條通路富集結(jié)果繪制KEGG 氣泡圖進行展示，見圖6。在對KEGG 結(jié)果進行預(yù)讀后發(fā)現(xiàn)，與柴胡桂枝湯治療抑郁癥密切相關(guān)的通路有MAPK、PI3K-Akt 信號通路。

圖5 交集基因GO條形圖

圖6 交集基因KEGG氣泡圖

2.6 潛在活性成分-疾病靶點分子對接分析

分子之間結(jié)合能量較低的構(gòu)象較為穩(wěn)定，對接結(jié)果結(jié)合能均＜-7.0 kcal/mol，其中山柰酚與Akt1 對接結(jié)合能最低，展現(xiàn)出良好的結(jié)合力，見圖7。分子對接結(jié)果見表2。

表2 關(guān)鍵化合物與核心靶點分子對接結(jié)合能（kcal/mol）

圖7 山柰酚與Akt1 分子對接圖

3 討論

柴胡桂枝湯臨床應(yīng)用廣泛，為深入研究其治療抑郁癥的作用機制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，共篩選得到154 個活性成分及250 個作用靶點，通過構(gòu)建活性成分-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)對柴胡桂枝湯治療抑郁癥的主要活性成分、重要靶點及潛在機制進行分析。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山柰酚、漢黃芩素等化合物度值較大，對應(yīng)多個抑郁癥靶點，可能是柴胡桂枝湯治療抑郁癥的主要活性成分。其中槲皮素作為一種天然的多羥基黃酮化合物，可通過抗氧化、抗炎、降低興奮性毒性、升高5-羥色胺水平來發(fā)揮抗抑郁作用[12]。山柰酚具有神經(jīng)保護作用，可抑制抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元凋亡并促進神經(jīng)再生，通過抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥因子分泌和上調(diào)蛋白激酶B/β-聯(lián)蛋白等途徑發(fā)揮抗抑郁作用[13]。通過PPI 網(wǎng)絡(luò)拓撲分析后篩選到JUN、Akt1、ESR1、MAPK3 等15 個靶點，提示這些靶點在PPI 中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可能是柴胡桂枝湯治療抑郁癥的核心基因。免疫炎癥反應(yīng)與神經(jīng)細胞受損、凋亡在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。研究表明[14]，轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）在炎癥與細胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用；有研究報道[15]，著名抗抑郁藥氟西汀是通過提高海馬Akt1 的表達并促進Akt 激酶磷酸化而發(fā)揮抗抑郁作用。雌激素水平的高低與抑郁癥密切相關(guān)，雌激素可通過作用于ESR1 調(diào)節(jié)多種與抑郁癥相關(guān)的中樞神經(jīng)遞質(zhì)水平[16]。MAPK 可促使c-JUN磷酸化而啟動細胞凋亡，這可能是MAPK 發(fā)揮抗抑郁作用的重要途徑[17]。此外，這些靶點均對應(yīng)了多個活性成分，如MAPK14 來自漢黃芩素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮等51 個活性成分，這提示柴胡桂枝湯具有多成分、多靶點協(xié)同抗抑郁的作用。

GO 功能富集分析結(jié)果主要涉及對脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物過程的調(diào)節(jié)。其中，氧化應(yīng)激反應(yīng)可通過上調(diào)氧自由基水平、降低抗氧化水平，對生物膜、核酸、細胞凋亡產(chǎn)生影響等多種途徑參與抑郁癥的發(fā)病過程[18]。KEGG 通路分析結(jié)果顯示，柴胡桂枝湯作用于抑郁癥的靶點主要涉及MAPK、PI3K-Akt信號通路等。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）可改變海馬結(jié)構(gòu)和功能，抗抑郁藥的使用與調(diào)節(jié)患者BDNF 水平密切相關(guān)[19]。MAPK 信號通路存在于人體大多數(shù)細胞內(nèi)，具有廣泛的生理病理調(diào)節(jié)作用，是BDNF 下游信號通路中與抑郁癥關(guān)系最密切的一條，可通過影響和調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)突觸的可塑性、長時程增強效應(yīng)及介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子發(fā)揮抗抑郁作用[20-22]。分析提示，柴胡桂枝湯與MAPK 信號通路相關(guān)的靶點共有34 個，包括經(jīng)PPI 網(wǎng)絡(luò)拓撲分析后篩選得到的JUN、RELA、Akt1等多個核心基因，由此推測通過調(diào)控MAPK 信號通路或為防治抑郁癥的主要機制之一。PI3K-Akt 信號通路高表達可有效調(diào)控海馬神經(jīng)元凋亡、再生，影響海馬神經(jīng)突觸的可塑性，進而起到抗抑郁的作用[23-24]。此外，PI3K-Akt 信號通路還可通過促進神經(jīng)營養(yǎng)因子釋放、調(diào)節(jié)谷氨酸能系統(tǒng)功能、改善線粒體功能異常、調(diào)節(jié)糖和脂質(zhì)代謝紊亂等途徑參與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[25]。同時有眾多關(guān)鍵靶點如RELA、Akt1、MYC、MAPK1 等富集在PI3K-Akt 信號通路上，提示該通路在抗抑郁過程中起到紐帶作用。

最后，利用分子對接技術(shù)選取柴胡桂枝湯度值最高的3 個主要有效成分（槲皮素、山柰酚、漢黃芩素）與關(guān)鍵核心靶點MYC、Akt1、ESR1、MAPK14、JUN 進行分子對接結(jié)合，結(jié)果顯示結(jié)合能均≤-7.0 kcal/mol，匹配能量較低，提示小分子與大分子結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定，結(jié)合性好，展現(xiàn)出良好的結(jié)合力，也部分驗證了本研究結(jié)果。

綜上所述，柴胡桂枝湯可能通過槲皮素、山柰酚等主要活性成分作用于JUN、Akt1、ESR1、MAPK3 等關(guān)鍵靶點，通過參與對脂多糖的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過程，激活或抑制MAPK、PI3K-Akt 等主要信號通路，產(chǎn)生調(diào)節(jié)神經(jīng)類遞質(zhì)的釋放和傳遞、調(diào)控海馬神經(jīng)元凋亡和再生、介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子等功效，從而發(fā)揮抗抑郁作用。柴胡桂枝湯治療抑郁癥的作用機制是一個多基因、多生物過程調(diào)節(jié)及多通路共同參與的過程，符合中藥治療疾病多成分、多靶點的特征。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，初步預(yù)測柴胡桂枝湯對抑郁癥的主要有效成分、作用靶點、相關(guān)通路及協(xié)同作用的分子機制，為后續(xù)進一步開展藥物機制研究、藥物開發(fā)及臨床試驗等奠定基礎(chǔ)和提供了理論依據(jù)。