王瑞敏，劉毅，李菲，賈躍進

1 山西中醫(yī)藥大學(xué) 山西太原 030024 2 山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 山西太原 030024

失眠癥（Insomnia Disorder，ID）是臨床常見病和多發(fā)病，2002年國際精神衛(wèi)生和神經(jīng)學(xué)基金會調(diào)查顯示，我國人群中有45.5%存在睡眠問題；并有調(diào)查表明睡眠不足與抑郁癥（DD）、肥胖、代謝紊亂、心臟病、精神健康問題和癡呆癥有關(guān)，且有更多的研究發(fā)現(xiàn)在睡眠不足的情況下免疫系統(tǒng)會遭受多種改變，根據(jù)調(diào)查約有10%～20%的人群會受其影響。[1-2]對于ID的治療，目前作為一線藥物的苯二氮卓類受體激動劑（BzRAs）缺乏長期療效的證據(jù)且與潛在的不良反應(yīng)有關(guān)，因此并非理想手段。[3]相比之下，中醫(yī)藥治療疾病有效且安全性高，具有一定優(yōu)勢，因此挖掘中醫(yī)藥對ID的治療具有較大的意義。

賈躍進主任醫(yī)師是全國名老中醫(yī)工作室指導(dǎo)老師，從醫(yī)40余年，對ID、DD等腦病治療有獨到的見解并有豐富的臨床經(jīng)驗。本文選取賈老近5年的門診病例，運用數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對其臨床用藥和處方特點進行歸納總結(jié)，并綜合分析其作用機制，以圖為ID的治療及相關(guān)研究提供一定思路與 參考。

資料與方法

1 入組標(biāo)準(zhǔn)

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《中國成人失眠診斷與治療指南》[4]診斷明確并單獨使用山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供的中藥顆粒劑治療，且安全、有效的病案。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 診斷、效果或安全性不明確的病案；合并其他影響判斷的精神及軀體疾病的病案；治療手段非單獨使用上述中藥顆粒劑的病案。

2 數(shù)據(jù)挖掘

2.1 數(shù)據(jù)收集 收集2015年7月1日-2020年7月1日間賈躍進名老中醫(yī)在山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院治未病中心門診收治的ID病案。

2.2 數(shù)據(jù)錄入與挖掘 根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后，以雙人雙錄入法將病案錄入至古今醫(yī)案云平臺V2.2.3中，然后結(jié)合2015版中國藥典[5]與第七版中藥學(xué)教材[6]對中藥進行名稱規(guī)范，如：“炒麥芽”統(tǒng)一為“麥芽”、“清半夏”統(tǒng)一為“半夏”。將所獲得的醫(yī)案使用數(shù)據(jù)挖掘模塊對其進行藥物頻次、屬性統(tǒng)計以及關(guān)聯(lián)、聚類和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，并得出核心藥組。

3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

3.1 核心藥組藥物活性成分及相關(guān)靶點獲取 利用CNKI（https：//www.cnki.net/）中 的 相 關(guān) 文 獻 及TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中檢索核心藥組各藥物活性成分，將所得活性成分在SwissADME（http：//www.swissadme.ch/）平臺中限定胃腸道吸收（GI absorption）、血腦屏障滲透（BBB permeant）、類藥性（Druglikeness）進行篩選，將篩選出的活性成分導(dǎo)入SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）得出相關(guān)靶點，并匹配Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫中的GeneSymbol。

3.2 疾病靶點獲取 在Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/#）數(shù)據(jù)庫中分別檢索“insomnia disorder”，將所得ID相關(guān)靶點合并、去重，再利用Uniprot數(shù)據(jù)庫匹配GeneSymbol。

3.3 藥物-疾病交集靶點獲得 將3.1中所得各活性成分相關(guān)靶點與3.2中所得ID相關(guān)靶點利用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在線作圖平臺取交集，獲得核心藥組活性成分中直接與疾病相關(guān)的靶點。

3.4 疾病-組方-藥物-成分-靶點及蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以疾病、核心組方、藥物、藥物活性成分、相關(guān)靶點為節(jié)點，其相互關(guān)系為邊，在CytoscapeV3.8.0中構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)；并將1.2.3中的藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入String（http：//string-db.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，然后利用Cytoscape的MCODE插件將所得PPI進行聚類，從而獲得核心靶點。

3.5 GO（Gene Ontology）富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析

將3.3中所得交集靶點導(dǎo)入Cytoscape的BInGO、ClueGO插件分別進行GO生物過程、分子功能、細(xì)胞成分和KEGG通路富集分析。

4 關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接分析

選取3.4疾病-組方-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度較大的活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)各聚類中節(jié)點度較大的關(guān)鍵靶點分別在Zinc（https：//zinc.docking.org/）、PDB（http：//www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中獲得其3D結(jié)構(gòu)，并使用Autodock vina進行分子對接，將其中對接較好的組合進行展示。

結(jié)果

1 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

1.1 藥物屬性及證候統(tǒng)計 共搜集到病案432例，根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)篩選，獲得驗案200例。該200例驗案包含方劑256首，涉及中藥154味，總應(yīng)用頻次3447次，其中藥物應(yīng)用百分比大于18%的有20味，其應(yīng)用頻次和為2221次，約占總頻次64%，見表1。將256首方劑中154味藥物進行性味歸經(jīng)的分析，結(jié)果以雷達圖表示，見圖1、2，其中中藥藥性分布主要為：溫、平、寒、微寒；藥味主要為：甘、辛、苦；而藥物的歸經(jīng)主要歸：脾、肝經(jīng)。中醫(yī)證候多見于肝郁證、肝郁脾虛證、痰證，見圖3。

表1 藥物使用頻次及百分比

圖1 四氣五味歸經(jīng)頻次分布雷達圖 （左：四氣頻次分布；中：五味頻次分布；右：歸經(jīng)頻次分布）

圖2 藥物功效統(tǒng)計

圖3 中醫(yī)證候分布

圖4 物聚類分析

1.2 藥物關(guān)聯(lián)分析、聚類分析、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析及核心組方確定 將256首處方利用云平臺數(shù)據(jù)分析，首先將置信度設(shè)置≥0.7，支持度≥0.4，得到20組藥物關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，并按照支持度降序排列，如表2；將2.1.1中應(yīng)用頻率大于18%的20味中藥進行聚類分析，同時設(shè)置距離類型為歐氏距離，聚類方法為：最長距離法，可將其分為：C1：茯苓、半夏、陳皮；C2：龍骨、牡蠣、柴胡、黃芩；C3：白芍、白術(shù)、香附、川楝子、枳實、萊菔子；C4：合歡皮、麥芽、黨參、遠(yuǎn)志、石菖蒲等4個聚類處方，見表4；最后設(shè)置節(jié)點度不小于95，進行中藥-中藥復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，得到一個由8味中藥組成的核心組合，見圖5。綜合以上得出最核心藥物組方為：陳皮、遠(yuǎn)志、白術(shù)、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓。

圖5 藥物復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析

表2 藥物關(guān)聯(lián)分析

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.1 核心組方活性成分和對應(yīng)靶點 通過檢索CNKI與TCMSP數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合SwissADME篩選與Swisstargetprediction預(yù)測靶點，篩選出陳皮、遠(yuǎn)志、白術(shù)、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓有效成分各4、37、4、15、9、9、5、6種，其中重復(fù)成分6種；相關(guān)靶點分別為29、624、68、359、73、79、33、128個。經(jīng)過去重、排除后，總計獲得有效成分83種，相關(guān)靶點770個。見表3。

表3 核心藥物組成部分成分相關(guān)信息

2.2 疾病靶點獲取結(jié)果和藥物-疾病靶點交集結(jié)果 將GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到的ID相關(guān)靶點按照相關(guān)度大于中位數(shù)進行篩選與OMIM數(shù)據(jù)庫中所得的靶點，合并與去重，共計獲得ID疾病靶點994個。利用微生信平臺將2.1中求得的藥物靶點與1.2中求得的疾病靶點取交集，共獲得163個藥物與疾病直接相關(guān)的交集靶點，見圖6所示。

圖6 藥物-疾病交集基因

2.3 疾病-核心組方-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建ID-核心組方-中藥-有效成分-對應(yīng)靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖7。圖7包含861個節(jié)點，2868條邊。從該網(wǎng)絡(luò)可得節(jié)點度較大（Degree＞50）的有效成分有：F、YZ16、YZ14、HHP8、YZ12、YZ13、YZ10、YZ17、FL4、FL5、A、YZ20。在String中導(dǎo)入163個交集靶點構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，然后通過MCODE插件分析網(wǎng)絡(luò)并根據(jù)聚類和節(jié)點度得出PPI核心網(wǎng)絡(luò)，見圖8所示，然后選擇其中節(jié)點度值大（DC＞615）的靶點作為核心靶點，有：AKT1、VEGFA、MMP9、IL6、FOS、TNF、CREB1、ESR1、DRD2、SLC6A4。

圖7 疾病-核心組方-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖8 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO富集分析和KEGG富集分析結(jié)果 將2.3中的交集靶點導(dǎo)入BInGO，并設(shè)置信水平為0.01，進行GO富集分析，見圖9，可得GO生物過程主要包括：細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、信號過程、對刺激的反應(yīng)、代謝過程等；GO分子功能則包括：結(jié)合、抗氧化活性、電子載體活性、分子傳導(dǎo)活性、通道調(diào)節(jié)等；而GO細(xì)胞成分以：細(xì)胞器成分、突觸成分、高分子結(jié)合物等為主。再將交集靶點導(dǎo)入ClueGO，設(shè)定p-value≤0.01，最小聚類為15，K-score為0.45進行KEGG通路富集分析，見圖10，其中主要有：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、HIF-1信號通路、細(xì)胞間隙連接、尼古丁成癮、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、前列腺癌等。然后以有效成分、靶點、通路分別為節(jié)點，其相互關(guān)系為邊構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，以直觀描述三者聯(lián)系，見圖11，而通過分析該網(wǎng)絡(luò)可得節(jié)點度最大的通路為神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，提示核心組方治療極可能通過此通路對失眠障礙產(chǎn)生作用，該通路具體作用見圖12。

圖9 GO富集分析氣泡圖

圖10 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖11 成分-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖12 神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路

3 分子對接結(jié)果

從關(guān)鍵靶點和關(guān)鍵成分分子對接結(jié)果來看，其對接分?jǐn)?shù)大多≤-5.0 kcal·mol/mol，具體見表4，提示核心藥組中的關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點多可穩(wěn)定結(jié)合，將對接結(jié)果最好的前5個組合使用Pymol進行可視化，見圖13。

圖13 分子對接構(gòu)象圖

表4 分子對接結(jié)果

討論

1 賈師對“不寐”的認(rèn)識

中醫(yī)學(xué)稱失眠為“不寐”“目不瞑”“不得眠”等；歷代醫(yī)家對失眠的病機闡述頗多，但總屬陽盛陰衰，陰陽失交，如《靈樞·口問》曰：“陽氣盡，陰氣盛，則目瞑；陰氣盡，而陽氣盛，則寤矣”、《醫(yī)效秘傳·不得眠》云：“夜以陰為主，陰氣盛則目閉而安臥，若陰虛為陽所勝，則終夜煩擾而不眠也”等，均記載了陰陽盛衰對失眠的影響。中醫(yī)對失眠的認(rèn)識不止于病因病機，還對失眠的治療有理法方藥咸備的描述，如《傷寒論》中所說：“虛勞虛煩不得眠，酸棗仁湯主之”。而現(xiàn)代人多食肥甘厚味，缺乏鍛煉，精神緊張，導(dǎo)致氣機不暢，氣血運行失常，賈老認(rèn)為失眠病機為“陽不入陰，陰陽失交”，在治療上尤其重視“調(diào)暢氣機、肝脾并治”，療效頗佳。

2 賈師治療的用藥規(guī)律

從數(shù)據(jù)分析結(jié)果來看，使用頻率最高的藥物為：陳皮、遠(yuǎn)志、白術(shù)、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓。這些藥物具有鎮(zhèn)靜催眠、調(diào)節(jié)植物神經(jīng)系統(tǒng)、改善認(rèn)知功能、神經(jīng)保護等神經(jīng)系統(tǒng)作用，另具有抗抑郁、抗炎、改善胃腸功能等作用。[7-14]從中藥藥性分布來看，主要為：溫、平、寒、微寒，其藥物的寒涼偏性不明顯。藥味主要為：甘、辛、苦；甘味具有補益、和中、調(diào)和藥性等作用，辛具有行氣、行血的作用，苦具有清泄火熱、泄降氣逆、燥濕、瀉火存陰的作用，且辛開苦降，調(diào)暢氣機，正適應(yīng)失眠的治療。藥物的歸經(jīng)主要為歸脾、肝經(jīng)，中醫(yī)證候多見于肝郁證、肝郁脾虛證、痰證，這反映出賈老“從肝論治”失眠的觀點，另藥物的歸經(jīng)與中醫(yī)證候也體現(xiàn)了賈老強調(diào)的“理法方藥”一致，并注重“方證相應(yīng)”。藥物關(guān)聯(lián)分析中篩選出的20對核心關(guān)聯(lián)組合均是陳皮、遠(yuǎn)志、白術(shù)、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓八位藥物之間相互關(guān)聯(lián)。其中陳皮、半夏、茯苓為二陳湯的主要組成，其功效為燥濕化痰行氣；遠(yuǎn)志和合歡皮以疏肝解郁安神；白術(shù)與茯苓健脾祛濕；麥芽有行氣健脾之功，既能疏解肝之郁滯，又能護衛(wèi)脾之正氣，為賈老常用之佐使藥；整體觀之，賈老治失眠，以行氣疏肝健脾為主，兼以化痰祛濕。在聚類分析的處方中：C1為燥濕化痰的二陳湯；C2為和解樞機的柴胡加龍骨牡蠣湯；C3、C4為益氣健脾、行氣化痰的香砂六君子湯；均為賈老堅持“方證對應(yīng)”中的常用方劑。復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析也是從此八位藥物中所獲的核心藥組。以上說明，從數(shù)據(jù)挖掘中可得賈老治療ID的核心組方為陳皮、遠(yuǎn)志、白術(shù)、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓，從中可看出賈老以“調(diào)暢氣機、肝脾并治”論治失眠的觀點。

3 核心組方的網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)藥物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得出核心藥組發(fā)揮作用的12個關(guān)鍵活性成分，其中F為廣泛存在于植物中的生物類黃酮，具有多種生物活性，有動物實驗表明它可顯著增加非快速眼動睡眠，同時顯著減少快速眼動睡眠；[15]YZ12、YZ13、YZ14、YZ20為遠(yuǎn)志中的呫噸酮類，有研究表明此類物質(zhì)可通過上調(diào)Nrf2表達來賦予神經(jīng)保護作用[16]；YZ17的3，4，5-三甲氧基肉桂酸甲酯（MTC）是具有生物活性的天然苯基丙烷，具有抗炎和抗氧化的作用，可以改善炎性所致的失眠癥狀[17]；HHP8為合歡皮中的木脂素類成分，該物質(zhì)可能是合歡皮傳統(tǒng)安神作用的主要有效成分之一[18]；FL4、FL5是茯苓中的三萜化合物，有研究證明具有鎮(zhèn)靜興奮性神經(jīng)元和抗驚厥等作用。[19]

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)，所得的核心靶點中TNF在睡眠中的作用涉及與全身性TNF慢性升高和睡眠中斷有關(guān)的病理狀況，TNF參與了廣泛的緊密協(xié)調(diào)的生化網(wǎng)絡(luò)中的睡眠調(diào)節(jié)。[20]研究表明較低的睡眠效率與較高的IL-6循環(huán)水平相關(guān)，睡眠障礙與炎癥水平升高有關(guān)。[21]c-Fos是FOS中的一個因子，但c-Fos標(biāo)記的睡眠活動神經(jīng)元的藥理學(xué)活化已顯示可誘導(dǎo)睡眠；還有研究表明在內(nèi)側(cè)視前區(qū)中c-fos的表達與睡眠調(diào)節(jié)有因果關(guān)系，c-Fos在大腦皮層和海馬體的表達可能與長時間的清醒和睡眠需求有關(guān)。[22-23]VEGFA是VEGF生長因子家族的成員，在調(diào)節(jié)情緒狀態(tài)中起作用，而失眠與抑郁癥呈復(fù)雜的雙向關(guān)系。[24-25]在實驗中發(fā)現(xiàn)睡眠受限后，AKT的表達水平顯著降低，AKT的改變可能與慢性睡眠受限有關(guān)。[26]CREB1作為一種重要的調(diào)控蛋白質(zhì)，其轉(zhuǎn)錄增加與睡眠階段的記憶形成有關(guān)。[27]ESR1即雌激素受體1，雌二醇通過其對ESR1和非經(jīng)典信號通路的作用來改變每日和晝夜節(jié)律。[28]多巴胺D2受體基因（DRD2）中的SNP（rs17601612）與睡眠時間顯著相關(guān)，研究證明第二個DRD2信號對睡眠時間有相反的影響[29]。

目前ID的病理機制尚不明確，但比較公認(rèn)的有：細(xì)胞機制障礙、生物調(diào)節(jié)異常、神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)紊亂（5-羥色胺、褪黑激素、y-氨基丁酸）、信號傳導(dǎo)障礙（下丘腦-垂體-腎上腺軸，即HPA軸）、代謝異常（葡萄糖、荷爾蒙、食欲素、瘦素等代謝異常）、遺傳基因等。[30-33]由GO富集分析得到的主要生物過程對ID公認(rèn)病理機制幾乎都有涉及，可見核心組方參與多種機制，可從多個途徑對ID發(fā)揮治療作用。KEGG通路分析主要結(jié)果中：血清素能神經(jīng)傳遞都與睡眠-覺醒周期的控制有關(guān)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，5-HT（血清素能）系統(tǒng)在控制疼痛，情緒，喚醒，睡眠-覺醒周期，學(xué)習(xí)/記憶，焦慮和獎勵行為方面起著至關(guān)重要的作用；[34-35]細(xì)胞間隙連接，如星形膠質(zhì)細(xì)胞通過間隙連接介導(dǎo)的星形膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生并向神經(jīng)元提供代謝底物的研究，證明了星形膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的擾動會損害睡眠-覺醒周期；[36]研究結(jié)果表明，早期蘇醒可能是尼古丁成癮嚴(yán)重程度與睡眠時間短和白天過度嗜睡的不良睡眠結(jié)果之間聯(lián)系的機制，尼古丁成癮的嚴(yán)重性是影響睡眠質(zhì)量的重要因素，而不僅僅是吸煙狀態(tài)，較高的成癮水平導(dǎo)致較少的睡眠和更多的白天嗜睡[37]。

分子對接結(jié)果表明，關(guān)鍵有效成分和關(guān)鍵靶點大多都結(jié)合成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而其與各關(guān)鍵成分對接較好的靶點為AKT1、DRD2和ESR1，與關(guān)鍵靶點對接較好的成分是YZ14（1，7-二甲氧基-2，3-亞甲二氧基呫噸酮）和FL5（去氫齒孔酸），這提示核心組方可能由這兩種成分作用于以上的三個靶點從而發(fā)揮治療ID的作用。

綜上所述，通過數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接研究，可以得到賈老中藥治療ID的核心組方：陳皮、遠(yuǎn)志、白術(shù)、合歡皮、半夏、柴胡、麥芽、茯苓，并初步揭示其多成分、多靶點、多通路作用機制，所涉及的關(guān)鍵成分為：1，7-二甲氧基-2，3-亞甲二氧基呫噸酮、去氫齒孔酸；核心靶點為：AKT1、DRD2和ESR1；主要通路為：神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血清素能突觸、細(xì)胞間隙連接。該結(jié)論可為進一步研究和臨床應(yīng)用提供參考。