于大遠 李維康 李雪 劉立陽 劉仍海

功能性便秘(functional constipation, FC)屬于慢性便秘的一種，指排除腸管器質性病因，沒有結構異?；虼x障礙，無藥物等繼發(fā)性因素所致的便秘。研究表明，很多常年便秘的患者，往往會存在腸道菌群的失調。當今現代醫(yī)學治療FC常采用瀉劑、促動力藥物、促分泌劑、灌腸劑及栓劑等藥物治療，或生物反饋治療等物理因子治療，或手術治療等方法，雖短期療效較好，但是遠期療效欠佳，且易致藥物依賴、結腸黑變病、腸道菌群失衡等不良反應[1]。中醫(yī)治療FC具有療效明確，副作用小等優(yōu)點，近些年研究發(fā)現，通過中藥干預可改善腸道菌群。中醫(yī)認為便秘有實秘和虛秘之分。因為針對氣血兩虛型FC，本課題組采用自擬益氣養(yǎng)血方，療效較好。為觀察其對腸道菌群的影響，本研究通過大黃灌胃聯合尾靜脈放血建立氣血兩虛型FC大鼠模型，觀察自擬益氣養(yǎng)血方對大鼠的一般情況、糞便重量，以及對腸道菌群的多樣性(α多樣性、β多樣性)和各菌種豐度的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究使用SD清潔級雄性大鼠50只，體質量為(200±20)g，8周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限責任公司，動物許可證編號SCXK(京)2019-0028，飼養(yǎng)于SPF級動物室，恒定室溫及濕度(22℃～25℃，50%～60%)，通風干燥，晝夜光照恒定12/12小時，不限飲食水。適應環(huán)境 1 周。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器

中藥自擬益氣養(yǎng)血方顆粒，組方：人參15 g、黃芪20 g、生白術30 g、肉蓯蓉15 g、當歸10 g、生地黃15 g、白芍10 g、川芎10 g、杏仁9 g、柏子仁10 g、玄參10 g、麥冬10 g、郁李仁15 g、火麻仁15 g、桃仁10 g。核酸純化試劑盒(貨號：A63881，美國貝克霍特曼容克特有限公司)；高保真PCR試劑盒(貨號：KK2631，美國KAPA)；PCR 擴增儀(貨號：KK2631，賽默飛世爾科技有限公司)；熒光定量儀(賽默飛世爾科技有限公司)；LightCycler實時定量 PCR 儀(Roche Inc)；圖像分析軟件(美國Media Cybernetics)。

1.3 造模與分組

綜合參考童衛(wèi)東、許新暉、杜麗東[2-4]等人的造模方法，制備氣血兩虛型FC大鼠模型。隨機抽取10只大鼠為空白組，每日定時給予空白組純凈水10 mL/kg。其余40只給予大黃溶液10 mL/kg，其中大黃的給藥濃度需按一定規(guī)律每日200 mg/kg遞增至終濃度為3600 mg/kg飼養(yǎng)3個月，具體給藥情況為：首次灌服劑量為200 mg/(kg·d)，再按每日200 mg/kg遞增至1000 mg/kg，超過半數大鼠出現腹瀉，維持此劑量3天，70%～80%以上動物稀便消失，每日再按200 mg/kg遞增至2200 mg/kg，半數以上動物出現腹瀉，維持此劑量7天，70%～80%以上動物稀便消失，每日再按200 mg/kg遞增至2800 mg/kg，半數以上動物出現腹瀉，維持此劑量12天，70%～80%以上動物稀便消失，每日再按200 mg/kg遞增至3200 mg/kg，半數以上動物出現腹瀉，維持此劑量21天，至60%～70%以上動物稀便消失，每日再按200 mg/kg遞增至3600 mg/kg，半數以上動物出現腹瀉，維持此劑量35天,待70%～80%以上動物稀便消失后停止給藥，一周后各組給予相應處理。

同時第10周起，每周大鼠尾靜脈放血，每次1～1.5 mL，直到第12周造模結束[5]。造模期間，每日記錄大鼠的飲食、飲水、活動情況，以及體質量、皮毛、反應性等，并稱量兩組大鼠24小時糞便濕重、干重來研究糞便情況。造模組大鼠24小時糞便重量和數量明顯減少，且糞便干/濕比重明顯增加，體質量減輕，耳、鼻、唇、尾蒼白，精神萎靡，活動量、飲食減少、毛發(fā)干枯，可以判斷造模成功。將造模成功的40 只大鼠，除8只大鼠處死取材外，其余32只隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各8只。

1.4 干預方法

采用自擬益氣養(yǎng)血方治療，按照成人用藥劑量的 150%、100%、50%對應設置益血氣養(yǎng)血方高、中、低劑量組。按照人轉換為大鼠劑量的轉換系數(6.17)進行轉換，計算大鼠灌胃劑量。經轉換，低、中、高三組劑量灌胃劑量分別為7.56 g/天、9.53 g/天和11.51 g/天。 空白組和模型組僅正常飲食、飲水，無任何其它處理。共干預4周。在末次給藥時進行取材。

1.5 取材方法

每只大鼠予10%的活性碳混懸液1～2 mL灌服，30分鐘后經過異氟烷誘導麻醉后大鼠脫頸處死。大鼠處死后，取出大腸組織，于結腸中端、結腸末端、直腸分別取1粒糞便(若結腸內無糞便，則取直腸內糞便3粒)裝入凍存管，并放入液氮中，l小時內移至-80°C冰箱保存[6]。

1.6 觀察指標及檢測方法

1.6.1 一般情況 觀察記錄治療前后大鼠進食量、飲水量、毛發(fā)光澤程度、體質量、精神狀態(tài)、活動度等情況的改變。

1.6.2 糞便情況 觀察治療前后各組大鼠24小時糞便顆粒數，稱量糞便濕重、干重來研究糞便情況。

1.6.3 腸道菌群情況 觀察治療后各組大鼠腸道菌群的多樣性和各菌群的豐度。將得到的大鼠糞便顆粒通過PCR擴增，所得到的基因序列采用OTU聚類分析方法，即相似度高于97%的序列聚類為一個OTU。在此基礎上進行α多樣性分析、β多樣性分析。α多樣性是指某一特定區(qū)域或系統內的多樣性，為反映豐富度、均勻度和多樣性的綜合指標。其中Chao1指數和ACE指數可反映群落豐富度，Shannon指數和Simpson辛普森指數可反映群落多樣性。β多樣性分析是對多個樣本間物種多樣性的比較，以評估微生物群落結構之間的相似性和差異性。β多樣性分析包括樣本層級聚類分析、樣本距離熱圖、PCA分析、PCoA分析、 NMDS分析等多種分析方法。利用平臺得到各組大鼠在門水平和屬水平上的腸道菌群豐度。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

藥物治療前,與空白組相比,模型組大鼠進食較空白組減少，毛發(fā)稀疏，精神萎靡，排便減少，活動量減少，體質量降低，說明造模成功。治療后,與模型組比較,采用自擬益氣養(yǎng)血方治療的各組大鼠精神、飲食等情況有所恢復，體質量高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。益氣養(yǎng)血方不同劑量的各組，治療后體重差異無統計學意義。結果如表1。

表1 各組大鼠治療前后體質量比較

2.2 各組大鼠糞便情況

藥物治療前，造模組大鼠糞便重量(干重和濕重)都小于空白組大鼠，干/濕比較高，差異有統計學意義(P<0.05)。治療后，與模型組相比，采用益氣養(yǎng)血方治療的各組糞便干量和濕重增加更為顯著(P<0.05)。與低劑量組相比，中劑量組和高劑量組糞便干量和濕重更高，差異有統計學意義(P<0.05)。治療后，中劑量組和高劑量組糞便干重和濕重差異無統計學意義(P>0.05)。表明經過益氣養(yǎng)血方治療4周，大鼠體質量顯著增加，糞便重量增加，干/濕比下降。結果如表2。

表2 各組大鼠治療前后糞便重量比較

2.3 各組大鼠腸道菌群情況

2.3.1 Alpha 多樣性 如表3、表4所示，與空白組比較，造模組sobs指數、chao指數、ace指數、shannon指數低于空白組, simpson指數高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。經過治療后，低劑量組、中劑量組、高劑量組ace指數、sobs指數、chao指數、shannon指數均高于模型組，simpson指數低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)。采用益氣養(yǎng)血方治療的3組，所有指數的差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 治療前兩組大鼠腸道菌群α多樣性指數比較

表4 治療后各組大鼠腸道菌群α多樣性指數比較

2.3.2 Beta多樣性 從PCA圖可以看出，造模組與空白組所在的置信區(qū)間距離較遠,說明造模前后腸道菌群差異較大。低劑量組、中劑量組和高劑量組所在的置信區(qū)間重合度較高，且與模型組所在的置信區(qū)間距離較遠。說明采用自擬益氣養(yǎng)血方不同劑量的治療的菌群組間差異不明顯，與模型組組間差異較大；中藥不同劑量的三組中高劑量組治療后腸道菌群與空白組組間差異最小。表明經益氣養(yǎng)血方治療4周后，腸道菌群的多樣性較治療前提升。見圖1。

(A) (B) (C)

2.3.3 菌群組成比較 如圖2所示，門水平上，造模后，擬桿菌門(bacteroidetes)、變形桿菌門(proteo bacteria)、放射菌門(act inob acteria )等菌門的豐度較空白組降低，厚壁菌門(firmicutes)、疣微菌門(verrucomicrobia)等菌門的豐度較空白組升高。藥物治療后，與模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組的厚壁菌門(firmicutes)、疣微菌門(verrucomicrobia)豐度較低，擬桿菌門(bacter oidetes)、變形桿菌門(proteobacteria)、放射菌門(actinobacteria )等菌門豐度較高(P<0.05)。中藥不同劑量的三組，各菌門豐度的差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 門水平下各組物種Bar圖

如圖3所示，屬水平上，造模后，Blautia菌屬、糞球菌屬(coprococcus)、梭菌屬(clostridia)和瘤胃球菌屬(ruminococcus)豐度升高，未分類的梭菌科(clostridia_unclassified)、雙歧桿菌屬(bifidobacterium)豐度降低，差異有統計學意義(P<0.05)；乳桿菌屬(lactobacillus)豐度升高，異桿菌(allobaculum)豐度降低,差異無統計學意義(P>0.05)。治療后，與模型組相比，低劑量組、中劑量組和高劑量組Blautia菌屬、梭菌屬(clostridia)、未分類的梭菌科(clostridia_unclassified)、糞球菌屬(coprococcus)和瘤胃球菌屬(ruminococcus)豐度較低，雙歧桿菌屬(bifidobacterium)豐度較高，差異有統計學意義(P<0.05)；乳桿菌屬(lactobacillus)豐度較低，異桿菌(allobaculum)豐度較高，差異無統計學意義(P>0.05)。表明經過益氣養(yǎng)血方治療4周后，大鼠腸道菌群的構成有所改善，門水平上厚壁菌門、疣微菌門豐度降低，擬桿菌門、變形桿菌門、放射菌門等菌門豐度升高，差異有統計學意義(P<0.05)；屬水平上，Blautia菌屬、梭菌屬、未分類的梭菌科、糞球菌屬和瘤胃球菌屬豐度降低，雙歧桿菌屬豐度升高，差異有統計學意義(P<0.05)，乳桿菌屬和異桿菌屬治療前后豐度變化不明顯(P>0.05)。具體數值見表5、表6。

圖3 屬水平下各組物種Bar圖

表5 大鼠造模后腸道菌群重要菌屬豐度比較

表6 各組大鼠干預后腸道菌群重要菌屬豐度比較

3 討論

正常人和動物腸道內寄居著大量的微生物，分屬于不同的種群，發(fā)揮著各自不同的作用。正常情況下，各種腸道菌群之間保持著相互制約的關系, 以維持穩(wěn)定的腸道微生態(tài)系統，一旦這種平衡關系被打破，某些條件下的致病菌占據優(yōu)勢，就會導致各種疾病的發(fā)生[5]。研究發(fā)現，患者腸道菌群的組成和數量與健康人群有顯著差異，腸道微生態(tài)環(huán)境是FC發(fā)生和發(fā)展機制中的重要環(huán)節(jié)。如Khalif IL等[7]研究發(fā)現，成人便秘患者中腸道巴氏桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌雙歧桿菌和乳酸桿菌的濃度顯著降低，可致病的細菌和真菌增加。張旭、于阿莉等[8-9]研究發(fā)現便秘患者腸道菌群中的雙歧桿菌含量明顯降低，而巴氏桿菌、乳酸菌、腸桿菌含量顯著升高。有研究表明，通過調節(jié)腸道菌群可以治療便秘。馮現合[10]在乳果糖治療的基礎上聯合雙歧桿菌三聯活菌膠囊治療功能性便秘，可以調高有效率，調節(jié)胃腸道功能，且安全性更好。周凱旋等[11]研究證實復方嗜酸乳桿菌片對便秘具有治療作用,并對腸道菌群具有調節(jié)作用。杜三軍等[12]發(fā)現以FMT聯合果乳糖治療，治療后,實驗組Bristol糞便性狀評分較對照組高,Wexner便秘評分(wexner continence grading scale)、便秘患者生活質量評價表(patient assessment of constipation symptoms and quality of life，PAC-QOL)評分較對照組低。

中醫(yī)學認為，便秘的發(fā)病機理主要為大腸傳導功能失司，大腸傳導糟粕的功能離不開氣的推動和血津液的濡養(yǎng)。若氣虛推動無力，血少腸燥津虧，大便干結，則可以導致便秘，此為因虛致實之證。如北宋《太平圣惠方·卷第二十九·治虛勞大便難諸方》曰：“夫虛勞之人。脾肺損弱。谷食減少。氣血阻隔。陰陽不和。胃氣壅滯。上焦虛熱。流注大腸。故令秘澀也?！泵鞔鷱埦霸馈毒霸廊珪っ亟Y》指出:“秘結證，凡屬老人、虛人、陰臟人及產后、病后、多汗后，或小水過多，或亡血失血大吐大下之后，多有病為燥結者，蓋此非氣血之虧，即津液之耗?！鼻宕钪需鳌夺t(yī)宗必讀·大便不通》說：“更有老年津液干枯，婦人產后亡血，及發(fā)汗利小便，病后血氣未復，皆能秘結。” 氣與血，一為陰，一為陽，一為體，一為用，二者相互依存,相互滋生,相互制約，相互為用。如《難經·本義》《醫(yī)學真?zhèn)鳌庋返戎嗅t(yī)典籍所言，“氣中有血,血中有氣,氣與血不可須臾相離,乃陰陽互根,自然之理也”。氣能生血，血能化氣，故氣虛和血虛二者往往同時出現，相兼為患。因此治療時當益氣養(yǎng)血，潤腸通便。自擬益氣養(yǎng)血方由四物湯、增液湯、黃芪湯、五仁丸組合而來，方中人參主補五臟，補氣之力較強，具有大補元氣之功；黃芪補氣升陽，益衛(wèi)固表、脫毒生肌、利水消腫，二藥相須配對，具有強大的補氣助陽作用;且人參守而不走，黃芪走而不守，二者一走一守，陰陽兼顧，徹里徹外，通補無瀉。白術具有益氣健脾之功，大量生白術使用，可以起到健脾通便的作用，是治療療脾氣虛便秘的要藥。正如《本草通玄》所言：“補脾胃之藥，更無出其右者，土旺則清氣善升，而精微上逢；濁氣善降，而糟粕下輸，白術健脾益氣，能升清降濁，而無溫燥耗傷陰血之弊?！敝猿窗仔g可以用于治療脾虛泄瀉，而大量的生白術可以用于通便，是因為“白術之功在燥，而所以妙處在于多脂”(《神農本草經讀》)。生地黃、玄參、麥冬三味藥取增液湯之意，生地黃滋陰補腎、清熱涼血，玄參滋陰清熱、涼血解毒、滑腸，麥冬滋陰潤肺，益胃生津，三藥合用大補陰液，潤滑腸道，增水行舟，促使糟粕下行，“增水行舟之計，故名增液，但非重用不為功”(吳鞠通《溫病條辨》)。肉蓯蓉補腎陽、益精血、潤腸通便，可用于腎陽和腎精不足之便秘。白芍斂陰養(yǎng)血，破陰布陽，大量生用具有通便之功，《名醫(yī)別錄》謂之“主通順血脈，緩中，散惡血，逐賊血，去水氣，利膀胱、大小腸”，當歸養(yǎng)血活血，潤腸通便，為血家必用之藥。川芎活血行氣止痛，為血中氣藥。杏仁滋潤腸燥，且能降肺氣以利大腸傳導；桃仁活血調經、潤腸通便；柏子仁養(yǎng)心安神、潤腸通便；郁李仁潤腸通便、下氣利水；火麻仁潤腸通便，以上五味藥物取五仁丸的中的“五仁”，集富含油脂的果仁于一方，可有效潤滑腸道。經過該方治療后，有益菌如雙歧桿菌菌屬豐度升高。雙歧桿菌屬于放線菌門，其生理作用遠遠超過其他菌種。其作用主要體現在：能夠通過代謝產生有機酸和其他抗菌活性物質，競爭性抑制有害細菌和病原菌的增殖或感染；調節(jié)便秘患者血清中的胃腸調節(jié)肽水平[13]；促進乳酸的產生、降低腸道pH值，從而促進腸道運動，緩解便秘。研究發(fā)現，經治療后豐度下降的菌屬，如糞球菌屬、瘤胃球菌屬等可以導致便秘。

綜上所述,益氣養(yǎng)血方治療功能性便秘不僅可改善大鼠的排便情況，還可以提高腸道菌群的多樣性，提高有益菌的豐度，降低有害菌豐度，為中藥治療FC的作用機制等進一步的研究奠定基礎。