郭雪江

南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，組織與胚胎學(xué)系，江蘇 南京 211166

全球不孕不育癥的發(fā)病率約為15%，其中男性因素導(dǎo)致的病例占50%［1］。在過去的幾十年中，男性不育的發(fā)病率不斷上升，影響大約7%的男性［2］。男性不育主要是由于精子發(fā)生障礙導(dǎo)致，臨床表現(xiàn)為少、弱、畸形精子癥以及無精子癥。無精子癥中的非梗阻性無精子癥（nonobstructive azoospermia，NOA）由于患者睪丸中嚴(yán)重的精子發(fā)生障礙，是男性不育中精子發(fā)生障礙最嚴(yán)重的一種疾病。NOA在男性不育患者中約占10%［3］，其中40%～50%的NOA 患者無法被臨床醫(yī)生獲取可以用于胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm injection tech?nique，ICSI）的功能性精子［4］。因此，NOA 患者中部分睪丸活檢可獲得精原細(xì)胞，如能完成體外精子發(fā)生，則有望獲得可用于輔助生殖的成熟精子。此外，在人類青春期前，精子發(fā)生尚未進(jìn)入減數(shù)分裂階段。兒童期腫瘤的放/化療治療可以導(dǎo)致生殖細(xì)胞的丟失。兒童腫瘤發(fā)病率為1.0‰～1.5‰，大約30%的患者由于腫瘤放療或化療會導(dǎo)致永久不育。對于兒童期放/化療之前的生育力保存，由于保留的睪丸組織中生精細(xì)胞尚未進(jìn)入減數(shù)分裂，沒有形成成熟精子，利用體外精子發(fā)生技術(shù)完成體外精子發(fā)生以及睪丸組織重建精子發(fā)生，有著非常重要的意義［5］。對于挽救NOA 患者的生育力及青春期前患者的生育力保存，目前臨床尚無好的方法。因此，建立并維持一個(gè)穩(wěn)定的體外精子發(fā)生體系，不僅將有助于上述問題的有效解決，還可以幫助豐富人類生殖生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究，評價(jià)藥物的生殖安全性，為生育力重建提供方法。

精子發(fā)生是多步的驟復(fù)雜過程，包括在體細(xì)胞微環(huán)境幫助下，原始生殖細(xì)胞分化而來的精原細(xì)胞的有絲分裂，精母細(xì)胞的減數(shù)分裂以及精子細(xì)胞的變形產(chǎn)生蝌蚪狀精子，上述任一過程的缺陷均會導(dǎo)致精子發(fā)生障礙。近一個(gè)世紀(jì)以來，科學(xué)家們一直努力嘗試在體外重復(fù)上述過程，其中最關(guān)鍵的是通過體外減數(shù)分裂形成單倍體細(xì)胞。從體外精子發(fā)生的策略來說，可以分別從體外干細(xì)胞培養(yǎng)分化形成精子細(xì)胞，或者通過體外性腺組織培養(yǎng)形成精子細(xì)胞，本文圍繞該兩種策略進(jìn)行了闡述與分析，并展望體外精子發(fā)生的應(yīng)用前景與倫理挑戰(zhàn)。

1 體外干細(xì)胞培養(yǎng)分化精子細(xì)胞

在體外干細(xì)胞分化精子細(xì)胞方面，已有很多的嘗試和研究。在精原干細(xì)胞體外分化方面，2002年，F(xiàn)eng 等報(bào)道了在缺乏支持細(xì)胞的情況下，將端粒酶永生化的小鼠A 型精原細(xì)胞系進(jìn)行體外分化，最終獲得精母細(xì)胞和精子細(xì)胞。然而，這批由小鼠精原細(xì)胞培養(yǎng)得到的圓形精子細(xì)胞是否具有受精能力尚不清楚。2003年，Tanaka等報(bào)道了將無精子癥患者的初級精母細(xì)胞與Vero細(xì)胞體外共培養(yǎng)，獲得了具有23條染色體的單倍體圓形精子細(xì)胞，最高成功率約為10%。2014年，Yang等對隱睪來源的精原干細(xì)胞體外分化進(jìn)行了研究，通過使用視黃酸（retinoic acid，RA）和干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）培養(yǎng)后，隱睪患者精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cell，SSC）中表達(dá)了許多減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后的男性生殖細(xì)胞標(biāo)志物，并最終獲得單倍體精子細(xì)胞，但未能評價(jià)使人類卵子受精以及胚胎發(fā)育的能力。

在多能干細(xì)胞分化方面，Yang等成功將小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iP?SC）體外誘導(dǎo)分化為陽性表達(dá)VASA、c?Kit 與SCP3等生殖細(xì)胞標(biāo)志物的生殖細(xì)胞。2015 年，Sasaki 等將人類多能干細(xì)胞經(jīng)過早期中胚層樣細(xì)胞（incipi?ent mesoderm?like cell，iMeLC）誘導(dǎo)為人原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（human primordial germ cell?like cell，hPG?CLC）［6］。2016年，中科院動物研究所周琪院士與趙小陽教授，及南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室沙家豪教授首次報(bào)道了小鼠胚胎干細(xì)胞體外完成減數(shù)分裂過程，獲得功能性精子細(xì)胞的研究。該研究利用小鼠胚胎干細(xì)胞，通過誘導(dǎo)分化形成原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（primordial germ cell like cell，PG?CLC），并將PGCLC 與睪丸體細(xì)胞（neonatal testicu?lar somatic cell）在睪丸性激素的作用下進(jìn)行體外共培養(yǎng)，觀察到遺傳印記的擦除（erasure of genetic im?printing）和染色體聯(lián)會和重組（chromosomal synap?sis and recombination），產(chǎn)生的單倍體精子樣細(xì)胞（spermatid?like cell）具有正確的核DNA和染色體含量。在卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)注射精子樣細(xì)胞，可產(chǎn)生有活力和可育的后代，表明該方法成功重建了體外雄性配子發(fā)生，為未來研究人類體外精子發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。

2 體外性腺組織培養(yǎng)誘導(dǎo)精子發(fā)生

組織培養(yǎng)法通常是利用多種方法培養(yǎng)組織碎片或小器官來完成體外精子發(fā)生的。體外組織培養(yǎng)的核心優(yōu)勢在于，當(dāng)生殖細(xì)胞在體外生長時(shí)，用于培養(yǎng)的組織可以保持生殖細(xì)胞及體細(xì)胞的空間排列，可以最大限度地模擬睪丸組織的微環(huán)境。近一個(gè)世紀(jì)以來，人們進(jìn)行了許多關(guān)于利用器官組織培養(yǎng)法進(jìn)行生殖細(xì)胞培養(yǎng)的嘗試，最早的體外睪丸組織培養(yǎng)可以追溯到100 年前。1920 年，法國科學(xué)家Champy 有史以來第一次報(bào)道了用器官組織培養(yǎng)法進(jìn)行生殖細(xì)胞體外分化。1959年，Trowell發(fā)明了一種培養(yǎng)方法：將大鼠睪丸小管放在空腔玻片中，同時(shí)使用Eagle 的最低基本培養(yǎng)基（minimum essen?tial media，MEM），生精小管可存活6 d。這一時(shí)期，體外睪丸組織培養(yǎng)的主要目標(biāo)是維持睪丸組織的活力。盡管做出極大努力，但精子體外發(fā)生的研究進(jìn)展不如期望，體外產(chǎn)生具有受精發(fā)育能力的單倍體精子細(xì)胞更是困難重重。

直到2011年，Yokonishi等用鑷子將新生小鼠的睪丸組織分成2～8 塊，分別在3 種不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（alpha?MEM、DMEM、StemPro?34?SFM）中培養(yǎng)，并輔以胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），利用瓊脂糖凝膠支撐培養(yǎng)睪丸組織。所產(chǎn)生的精子細(xì)胞和精子分別通過圓形精子細(xì)胞注射（round spermatid in?jection，ROSI）和ICSI 成功產(chǎn)生了可存活的后代［7］。隨后，在2012年，Sato等利用這項(xiàng)技術(shù)，將c?Kit配體（c?kit ligand，KitL）基因缺陷的不育小鼠睪丸組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，并且加入外源性的重組KITL 蛋白，最終得到了可育精子，這項(xiàng)研究為遺傳性精子發(fā)生缺陷患者開辟了新的治療策略。并進(jìn)一步使用成年小鼠睪丸組織進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示成熟成年小鼠睪丸組織的培養(yǎng)是有效的，可以從精原細(xì)胞誘導(dǎo)精子發(fā)生直到有效的單倍體細(xì)胞形成［8］。

然而，盡管經(jīng)過一個(gè)世紀(jì)的努力，人睪丸器官發(fā)生的體外研究依然非常局限。直到2020年，本實(shí)驗(yàn)室課題組以及中科院動物研究所課題組實(shí)現(xiàn)了人類睪丸器官的體外精子發(fā)生體系構(gòu)建［9］。這一人類睪丸類器官培養(yǎng)體系采用流產(chǎn)胎兒的生殖嵴，在體外成功建立了包含生精上皮和各級生殖細(xì)胞的培養(yǎng)體系，通過添加骨形成蛋白（bone morphogenet?ic protein，BMP）、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等細(xì)胞因子，最終獲得了功能性精子。值得注意的是，上述3 種因子都通過受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）通路發(fā)揮功能，提示激酶磷酸化通路在體外精子發(fā)生中的重要作用［10-11］。體外培養(yǎng)的單倍體精子細(xì)胞經(jīng)歷了減數(shù)分裂重組，達(dá)到了體外生殖細(xì)胞培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)［12］，這些精子細(xì)胞能夠使人類卵母細(xì)胞受精并支持隨后的囊胚（blastocyst）形成。

3 挑戰(zhàn)與展望

經(jīng)過一個(gè)世紀(jì)的發(fā)展，體外精子發(fā)生已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。目前這一領(lǐng)域進(jìn)入了一個(gè)挑戰(zhàn)與機(jī)遇并存的時(shí)代。體外精子發(fā)生主要基于體外干細(xì)胞培養(yǎng)分化精子細(xì)胞或體外性腺組織培養(yǎng)誘導(dǎo)精子發(fā)生兩種體系，無論采用何種方法，都需要獲得生殖細(xì)胞，生殖細(xì)胞經(jīng)歷有絲分裂增殖、啟動并完成減數(shù)分裂形成單倍體精子細(xì)胞。其中體外減數(shù)分裂產(chǎn)生單倍體精子細(xì)胞的過程最為關(guān)鍵，所以Handel 等在2014 年提出了體外減數(shù)分裂的一系列金標(biāo)準(zhǔn)，包括對減數(shù)分裂的同源染色體聯(lián)會配對、同源重組的觀察，染色體與DNA 的含量和結(jié)構(gòu)分析，以及單倍體細(xì)胞的功能評價(jià)［12］。對于體外培養(yǎng)獲得的精子，可以通過分析染色體倍體和基因組完整性、表觀遺傳如印記基因甲基化模式建立、頂體等精子特有結(jié)構(gòu)的形成，并評價(jià)精子支持胚胎發(fā)育的能力，系統(tǒng)評價(jià)體外分化精子的功能。

體外精子發(fā)生在面臨挑戰(zhàn)的同時(shí)，也是一個(gè)充滿機(jī)遇的新領(lǐng)域。一方面，由于模式動物并不能完全模擬人類精子發(fā)生過程，人類體外精子發(fā)生的研究將會進(jìn)一步闡明人類生殖生物學(xué)的相關(guān)機(jī)制及環(huán)境因子和藥物對生育力的影響。另一方面，人類男性青春期前，尚無精子的產(chǎn)生。青春期前兒童腫瘤的放療和化療會導(dǎo)致部分患者生育力的喪失。如果這部分青少年的睪丸組織可以被保存，并得以用于未來的體外精子發(fā)生培養(yǎng)，將對于這部分患者的不孕不育治療提供巨大的幫助。此外，40%～50%NOA 患者經(jīng)睪丸活檢無“單倍體”精子［4］，其中約20%患者為唯支持細(xì)胞綜合征（sertoli cell only syn?drome，SCOS）或僅存在精原干細(xì)胞或部分精母細(xì)胞等生精階段早期的生殖細(xì)胞［4］，體外精子發(fā)生將有助于上述患者產(chǎn)生遺傳學(xué)父子關(guān)系的子代?？梢韵胂?，不遠(yuǎn)的將來，在相關(guān)技術(shù)的支持和法規(guī)的監(jiān)管下，科學(xué)家和醫(yī)生可以直接通過微創(chuàng)手術(shù)獲得不育患者的睪丸組織樣本或者通過生育力保存的青春期前睪丸組織，通過體外培養(yǎng)方法獲得單倍體精子，解決男性不育的難題。