覃美 肖京林 王曉霞 凌桂芝 唐新蓮 黎曉峰

摘 ?要：本文揭示錳毒脅迫下甘蔗根分泌煙酰胺及其作用，為解決甘蔗錳毒問題提供依據(jù)。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分離、鑒定甘蔗分泌物中的煙酰胺;采用水培試驗(yàn)方法，在培養(yǎng)液中添加煙酰胺研究煙酰胺對錳毒引起的甘蔗根伸長、胼胝質(zhì)和活性氧積累及其相關(guān)酶活性等的影響。結(jié)果液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜圖上顯示，甘蔗根系分泌物中存在煙酰胺質(zhì)譜峰，且錳脅迫條件下煙酰胺信號(hào)更強(qiáng);錳毒脅迫下甘蔗根系伸長受阻、根系活力降低，根尖積累胼胝質(zhì)，根系中過氧化氫、活性氧及丙二醛含量和超氧化歧化酶、氧化氫酶、抗壞血酸氧化物酶活性顯著提高;在錳脅迫下添加于培養(yǎng)液中的煙酰胺顯著降低或消除錳的上述影響?？梢?，過多的錳誘導(dǎo)甘蔗根系分泌煙酰胺，而煙酰胺顯著抑制過多的錳對甘蔗生長及過氧化脅迫傷害。

關(guān)鍵詞：甘蔗;錳毒;煙酰胺;作用

中圖分類號(hào)：S566.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： This study revealed the secretion of nicotinamide from sugarcane roots under the stress of manganese toxicity and its role， and provided a basis for solving the problem of manganese toxicity in sugarcane. The liquid-mass spectrometry was used to isolate and identify nicotinamide in sugarcane exudates. The effects of nicotinamide on root elongation， callose and reactive oxygen species accumulation， and related enzyme activity of sugarcane induced by manganese toxicity were studied by hydroponic experiments. There were nicotinamide mass spectrum peaks in sugarcane root exudates， and the nicotinamide signal was stronger under manganese stress. Under the stress， the root elongation of sugarcane was blocked and the root activity decreased， while the root tip accumulated callose， the contents of hydrogen peroxide， reactive oxygen species and malondialdehyde and the activity of superoxide dismutase， oxidase and ascorbate oxidase in the roots were significantly increased. Nicotinamide added to culture medium under manganese stress significantly reduced or eliminated the above effects of manganese. It can be seen that excessive manganese induces the secretion of nicotinamide from sugarcane roots， and nicotinamide significantly inhibits the damage of excessive manganese to sugarcane growth and peroxide stress.

Keywords： sugarcane; manganese toxicity; nicotinamide; effect

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.036

錳是成土礦物的成分，土壤中錳多以難溶性礦物態(tài)存在，但在酸性等條件下大量的錳溶解到土壤溶液中。植物吸收積累過多的錳后，植物酶系統(tǒng)和功能受到干擾，植物代謝紊亂，正常生長受阻[1-3];形成并積累大量的活性氧，導(dǎo)致膜脂過氧化，多酚氧化形成褐色的醌類物質(zhì)，葉片組織形成褐斑壞死[2， 4];抑制葉綠素的合成，加速葉綠素的分解，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，光合受阻，葉片黃化[5-7]。因此，錳毒是酸性土壤中作物生長的主要限制因子。甘蔗是我國主要的糖料作物，對我國食糖安全至關(guān)重要。本課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)，華南地區(qū)酸性土壤上的甘蔗近年來發(fā)生嚴(yán)重的錳毒黃化問題，錳毒已成為制約我國甘蔗生產(chǎn)的主要問題之一[1， 5-7]。

煙酰胺是煙酸的酰胺化合物，作為輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，參與各種細(xì)胞的代謝過程。煙酰胺（NIC）也是一種天然的抗氧化劑，可以清除自由基，提高植物抗逆性。有研究結(jié)果表明，營養(yǎng)液中添加煙酰胺能夠促進(jìn)植物的生長，提高根系活力[8]。外源煙酰胺改善苜蓿、蠶豆對鹽脅迫的適應(yīng)性[9]。最近，S?dzik[10]研究發(fā)現(xiàn)，根系分泌的煙酰胺在減輕大麥鉛毒害方面發(fā)揮重要作用。然而，作為重要作物，在錳脅迫下甘蔗根系是否分泌煙酰胺？煙酰胺在緩解甘蔗錳毒方面是否有積極作用？據(jù)查閱文獻(xiàn)，有關(guān)錳誘導(dǎo)根系分泌煙酰胺的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。因此，本研究對錳脅迫甘蔗根系分泌煙酰胺及其對甘蔗錳毒的影響進(jìn)行了探討，旨在為煙酰胺在錳毒作物上的應(yīng)用及甘蔗育種上提供科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

試驗(yàn)甘蔗品種為‘中蔗1號(hào)’。供試材料參照武欣等[11]的方法在溫室中育苗，做以下研究的試驗(yàn)材料。根據(jù)課題組前人研究，當(dāng)錳脅迫達(dá)0.1 mmol/L時(shí)，甘蔗的生物產(chǎn)量已經(jīng)顯著下降，葉綠素含量顯著下降，葉片顯著發(fā)生黃化作用[7，12]。

為收集甘蔗根系分泌物，以已經(jīng)長至1心4葉的25日齡的幼苗為試驗(yàn)處理材料，將供試幼苗分別在含0（CK）和0.1 mmol/L MnCl2（Mn）的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，一個(gè)重復(fù)4株甘蔗幼苗。基礎(chǔ)培養(yǎng)液為1/5強(qiáng)度的Hogland營養(yǎng)液，pH 5.5（下同）。2 d后，將營養(yǎng)液更換成用去離子水浸洗根系，反復(fù)3～5次。最后，將幼苗轉(zhuǎn)移至去離子水培養(yǎng)。4 h后，收集含根系分泌物的溶液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干。加水溶解濃縮瓶中濃縮物，收集溶解溶液，保存于?20 ℃冰箱并采用液質(zhì)聯(lián)用分析其中的煙酰胺。根系烘干、稱重。

為研究煙酰胺對錳引起的膜脂氧化的影響，以已經(jīng)長至1心4葉的25日齡的幼苗為試驗(yàn)處理材料，特設(shè)置以下處理：0（CK）、0.1 mmol/L MnCl2（Mn）、0.1 mmol/L Mn+0.1 mmol/L煙酰胺（分析純，購于索萊寶）（Mn+NIC），培養(yǎng)甘蔗幼苗。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，一個(gè)重復(fù)4株甘蔗幼苗。2 d后，采集+1葉和根系樣品，采用以下方法分別測定酶活和膜脂過氧化指標(biāo)。

為探究錳脅迫處理甘蔗根生長的影響，選取7 d日齡、初生根長勢均勻的種莖在溶液的4 L塑料容器中培養(yǎng)。每個(gè)種莖記的幼苗為一個(gè)重復(fù)，每個(gè)處理設(shè)置12個(gè)重復(fù)。分別培養(yǎng)在CK、Mn和Mn+NIC處理溶液中。2 d分別測定出生根長度，根系活力、觀察胼胝質(zhì)積累。

1.2 ?方法

煙酰胺：三重四級(jí)桿-液質(zhì)聯(lián)用法[13]。色譜條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。柱溫：40 ℃。流速：0.3 mL/min。進(jìn)樣量：2 μL。流動(dòng)相A：0.1%甲酸水;流動(dòng)相B：甲醇。質(zhì)譜條件：離子源（105 ℃）：電噴霧離子源;掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）正離子模式;氣體溫度：495 ℃;氣體流速：300 L/h。煙酰胺監(jiān)測離子對及質(zhì)譜參數(shù)見表1。

酶活性：取待測0.5 g加入4 mL磷酸緩沖液 （50 mmol/L，pH 7.8，含1 mmol/L EDTA和2%聚乙烯吡咯烷酮）研磨成勻漿，在10 000 r/min低溫（4 ℃）離心20 min，上清液用于超氧化物歧化酶（SOD，淡藍(lán)四唑法）、氧化氫酶活性（CAT，過氧化氫紫外線法）、抗壞血酸氧化物酶（APX）活性測定[14]。

過氧化氫（H2O2）含量：采用硫酸鈦法測定[14]。

超氧陰離子（O2.?）含量：采用羥胺氧化法測定[14]。

丙二醛含量：硫代巴比妥酸（TBA）比色法[14]。

根系活力測定：氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定[14]。

根伸長率：處理前后分別用直尺測量初生根長，計(jì)算相對伸長率：（處理后根長-處理前根長）÷ 處理后根長×100%。

根尖細(xì)胞對伊文思藍(lán)的透性：切取0～1 cm根尖，于0.1%的伊文思藍(lán)溶液中染色30 min后，用蒸餾水沖洗根5遍以去除過量的染料。以吸水紙吸干根表面水分后，準(zhǔn)確稱取0.2 g于含1%十二烷基磺酸鈉和50%甲醇溶液中、50 ℃下浸提根中的伊文思藍(lán)。30 min后，吸取提取液，于600 nm下檢測OD值，并計(jì)算單位重量的根中伊文思藍(lán)的量。

胼胝質(zhì)：參照丁新倫等[15]的方法稍加修改。處理結(jié)束的根尖放入FAA固定液（含10%甲醛、5%冰乙酸、45%乙醇）中固定24 h，固定結(jié)束后取出并放置于裝有磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.5）的離心管中軟化30 min，用0.1%苯胺藍(lán)（溶于0.05 mol/L的磷酸緩沖液，pH 8.5）染色30 min于全自動(dòng)正置微分干涉熒光顯微鏡（Axio Image A2，蔡司公司，德國）觀察、拍照。顯微鏡選擇503通道紫外激發(fā)光觀察。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)差異性采用鄧肯法進(jìn)行分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?錳誘導(dǎo)甘蔗根分泌煙酰胺

采用液質(zhì)聯(lián)用儀分析煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品后，通過表1中質(zhì)譜條件和煙酰胺離子對123/80、123/53、定性離子片段80進(jìn)行定量分析，可以在此條件下可定性定量檢測煙酰胺。檢測器上可觀察到煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為1.98 min的吸收峰（圖1A）。將根系分泌物收集、濃縮后，在相同條件下進(jìn)行分離，檢測器上也出現(xiàn)保留時(shí)間1.98 min與煙酰胺相同的質(zhì)譜峰，說明甘蔗根分泌煙酰胺。

甘蔗根系經(jīng)0.1 mmol/L MnCl2（Mn）溶液中處理48 h后，根分泌的煙酰胺質(zhì)譜峰明顯高于對照（CK，不加Mn）。通過定量分析結(jié)果顯示，錳處理的根系分泌煙酰胺顯著高于對照，達(dá)對照處理的2.61倍（圖1B）。這些結(jié)果說明，錳毒脅迫可誘導(dǎo)甘蔗根系分泌煙酰胺。

2.2 ?煙酰胺對根伸長、活力、細(xì)胞力和胼胝質(zhì)積累的影響

根是最先接觸生長介質(zhì)中有害元素的植物器官，對有害元素的反應(yīng)敏感。因此，根伸長及根尖活力是敏感性指標(biāo)，常用于評價(jià)元素對植物毒性的強(qiáng)弱。研究發(fā)現(xiàn)錳脅迫條件下甘蔗根伸長顯著受阻，根伸長率僅相當(dāng)于對照的75.5%（圖2A）。然而，在Mn溶液中添加煙酰胺后根伸長率顯著提升，并恢復(fù)至CK相當(dāng)?shù)乃?。與此相似，錳脅迫條件下根的活力顯著下降，而在Mn溶液中添加煙酰胺后根系活力顯著增加（圖2B）。這些結(jié)果表明，根分泌的煙酰胺能有效緩解錳對甘蔗的毒害。

伊文思藍(lán)是檢測細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞活力的染料，由于分子量（960.8）大，其并不能透過細(xì)胞膜進(jìn)入活體細(xì)胞。只有在細(xì)胞活力降低、細(xì)胞膜損傷后，伊文思藍(lán)方能順利進(jìn)入細(xì)胞并與胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合形成具有藍(lán)色熒光的復(fù)合物。因此，伊文思藍(lán)染色法是鑒定植物細(xì)胞活力的有效方法。研究發(fā)現(xiàn)，錳處理后的根尖經(jīng)伊文思藍(lán)染色后，根尖細(xì)胞中積累的伊文思藍(lán)顯著增加，說明過多的錳引起根尖細(xì)胞死亡（圖3A）。然而，Mn溶液中添加煙酰胺（Mn+NIC）后，根尖細(xì)胞中積累的伊文思藍(lán)（297.3 mg/kg）僅僅相當(dāng)于Mn處理的67.8%。這些結(jié)果說明，根分泌的煙酰胺能緩解錳引起根尖細(xì)胞死亡。

胼胝質(zhì)積累是錳毒害的重要標(biāo)志[16]。胼胝質(zhì)定位于胞間連絲等上。沉積在胞間連絲上的胼胝質(zhì)能夠調(diào)節(jié)胞間連絲的滲透性，阻塞胞間水分、養(yǎng)分和信號(hào)分子等的運(yùn)輸。胼胝質(zhì)與苯胺藍(lán)反應(yīng)后形成特定的熒光色素。在錳毒脅迫條件下，苯胺藍(lán)染色后根尖表面可觀察明顯的熒光，而對照（CK）的熒光強(qiáng)度很弱（圖3B），說明Mn誘導(dǎo)甘蔗根尖胼胝質(zhì)沉積。然而，錳溶液中的煙酰胺使根尖胼胝質(zhì)積累量降低，使根尖熒光強(qiáng)度明顯變?nèi)?。這些結(jié)果進(jìn)一步說明，根分泌的煙酰胺能緩解甘蔗錳毒害。

2.3 ?煙酰胺對丙二醛、過氧化氫以及超氧陰離子積累的影響

丙二醛是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，能直接反映生物膜受損程度。通過測定根中丙二醛含量，可以探討錳毒對根系膜脂過氧化的影響。在Mn脅迫下，根中丙二醛積累顯著增加，說明錳脅迫破壞了根系細(xì)胞的正常生長，當(dāng)營養(yǎng)液中存在煙酰胺時(shí)（Mn+NIC），丙二醛積累顯著下降（圖4），說明煙酰胺能夠緩解錳脅迫所引起的膜脂過氧化影響，緩解錳的毒害。

過氧化氫、超氧陰離子是植物中重要的過氧化劑，其過多積累會(huì)引起膜脂過氧化、細(xì)胞受損進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。試驗(yàn)結(jié)果表明，Mn處理后甘蔗根中過氧化氫顯著積累，而在煙酰胺添加的情況下（Mn+NIC）根中過氧化氫含量顯著降低。

與此相似，Mn誘導(dǎo)根中超氧陰離子顯著積累，而Mn+NIC處理使超氧陰離子積累量降低，甚至低于對照的積累水平。這些結(jié)果說明，煙酰胺能消除過多錳毒條件下膜脂過氧化脅迫傷害。

2.4 ?煙酰胺對抗氧化酶活性的影響

過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）是植物體內(nèi)清除活性氧保護(hù)機(jī)制中的重要成員，受氧化脅迫誘導(dǎo)。由表3可知，Mn脅迫條件下根中這些抗氧化酶活性均顯著增加，說明錳脅迫激活甘蔗根系抗氧化酶。當(dāng)營養(yǎng)液中存在煙酰胺時(shí)（Mn+NIC），CAT、SOD和APX活性均顯著增加。煙酰胺處理后，CAT和SOD活性恢復(fù)到對照處理相當(dāng)?shù)乃?，而APX活性則顯著高于對照水平。這些結(jié)果進(jìn)一步說明，煙酰胺能降低錳毒引起的過氧化脅迫。

3 ?討論

錳毒是酸性土壤中抑制作物生長的主要元素之一。過多的錳造成華南地區(qū)酸性土壤上的甘蔗發(fā)生大面積的黃化問題，錳毒已成為限制我國食糖安全的重大問題[1， 5-7]。在長期的生物進(jìn)化過程中，一些植物獲得了抵御過多錳的環(huán)境的一些機(jī)制。這些機(jī)制包括分泌能螯合錳的有機(jī)酸、堿化根際、提升根際Eh等降低土壤中錳的毒性。例如，早在2009年Mora等[17]的研究就發(fā)現(xiàn)，錳毒脅迫下耐錳的黑麥草就通過根分泌檸檬酸適應(yīng)錳過多的環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)錳毒脅迫下甘蔗根系分泌煙酰胺。

Abdelhamid[18]在探究煙酰胺對鹽脅迫條件下蠶豆幼苗生長試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，煙酰胺能夠緩解鹽脅迫，并促進(jìn)幼苗生長。本研究發(fā)現(xiàn)，煙酰胺能減輕錳對甘蔗的毒害。錳脅迫條件下甘蔗根尖細(xì)胞死亡數(shù)量增加、根伸長受阻、根系活力下降。營養(yǎng)液中存在煙酰胺時(shí)，錳引起的細(xì)胞死亡減少、根伸長阻礙和根活力下降明顯緩解。錳毒脅迫下根系分泌的煙酰胺的作用尚不清楚。

煙酰胺減輕重金屬的毒害現(xiàn)象也發(fā)現(xiàn)在大麥鉛毒害的研究中[10]：在0.5 mmol/L PbNO3 溶液中的尼克酰胺（25～100 μmol/L）顯著降低鉛離子對根生長、植株生物產(chǎn)量的不良影響而增加大麥對鉛毒害的抗性指數(shù)。在水曲柳的研究中，Kalbin等[19]也發(fā)現(xiàn)煙酰胺能提高植物對Cd、Cu、Zn等重金屬毒害的抗性。煙酰胺也有效減少鹽脅迫對蠶豆傷害，改善植物光合作用、植株生長及光合產(chǎn)物的積累[18]。本研究還發(fā)現(xiàn)，錳脅迫引起植物中超氧陰離子、過氧化氫等活性氧的積累，誘發(fā)細(xì)胞膜脂過氧化和丙二醛積累。當(dāng)營養(yǎng)液中存在煙酰胺時(shí)，錳引起活性氧、過氧化酶及過氧化產(chǎn)物均顯著降低。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，煙酰胺也能減少Pb引起的MDA在植物組織中的積累和CAT的激活[10]。外源尼克酰胺也增加胡蘿卜素等抗氧化物的積累并降低養(yǎng)分脅迫激活的過氧化酶、多酚氧化酶的活性和MDA的積累。尼克酰胺也能保護(hù)2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽引起的過氧化對培養(yǎng)細(xì)胞傷害[20-23]。Smolik等[10]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的煙酰胺顯著降低CAT活性，可能是煙酰胺的抗氧化性能和在鉛脅迫中的作用表現(xiàn)為化合物能抑制鉛的破壞作用，應(yīng)用煙酰胺作為抗氧化劑，促進(jìn)了普通大麥的根尖生長。

綜上所述，錳對甘蔗的脅迫作用導(dǎo)致正常代謝活動(dòng)遭受破壞，導(dǎo)致發(fā)生膜脂過氧化，大量積累活性氧、胼胝質(zhì)，并加劇根尖細(xì)胞死亡而抑制根尖伸長，根系活力下降，根系正常生長受阻。在本研究中，錳脅迫條件下有煙酰胺的分泌，通過探究煙酰胺對錳毒緩解作用試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，煙酰胺能夠減少錳脅迫導(dǎo)致的丙二醛和ROS的積累，提高了根系活力和細(xì)胞活力，促進(jìn)根的伸長，而使抗氧化酶活性維持與CK處理相當(dāng)。煙酰胺對甘蔗錳脅迫耐性的提高可能是表現(xiàn)為抗氧化劑功能而抑制錳對甘蔗正常生理的破壞作用，具體作用機(jī)制有待今后的研究證實(shí)。此外，煙酰胺作為輔酶的重要組成結(jié)構(gòu)，參與新陳代謝過程，可能在調(diào)節(jié)錳脅迫條件下植物代謝和提高植物抗逆性方面具有潛在作用。

4 ?結(jié)論

錳毒脅迫下甘蔗根系能分泌煙酰胺;煙酰胺有利于增強(qiáng)甘蔗的抗氧化能力，減輕錳對甘蔗毒害。

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