杜致輝 楊瀾 張朝君 許紅娟 陳之林

摘 ?要：本研究結(jié)合Illumina高通量測(cè)序和Nanopore測(cè)序技術(shù)，對(duì)黑喉石斛（Dendrobium ochreatum）的葉綠體基因組（cpDNA）進(jìn)行測(cè)序，組裝得到其cpDNA全長(zhǎng)序列并繪制結(jié)構(gòu)圖譜。黑喉石斛cpDNA全長(zhǎng)154 935 bp，注釋共得到125個(gè)基因，其中有unigenes 103種，包含73種蛋白編碼基因，26種tRNA基因和4種rRNA基因。特征分析結(jié)果表明：黑喉石斛cpDNA中共存在58個(gè)SSR （simple sequence repeat）位點(diǎn)，大部分為單核苷酸重復(fù)和二核苷酸重復(fù)類(lèi)型，堿基組成以A/T堿基類(lèi)型為主;其偏好的密碼子共32個(gè)，其中有30個(gè)以A/U堿基結(jié)尾。以黑喉石斛與其他13種石斛的cpDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，鼓槌石斛（D. chrysotoxum）和梳唇石斛（D. strongylanthum）與黑喉石斛具有較近的親緣關(guān)系，IR/SC邊界分析結(jié)果也映證了此結(jié)論。以黑喉石斛為參照，與3種近緣石斛的cpDNA進(jìn)行全序列長(zhǎng)對(duì)比，結(jié)果顯示，4種石斛的序列變異主要發(fā)生在單拷貝區(qū)，基因間隔區(qū)的變異明顯高于基因編碼區(qū)。

關(guān)鍵詞：黑喉石斛;葉綠體基因組;特征;比較分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.31 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In this research， the complete chloroplast genome （cpDNA） of D. ochreatum was sequenced through the combination of high-throughput and nanopore sequencing， and the full-length sequence （154 935 bp） of chloroplast genome （cpDNA） was assembled and annotated. A total of 125 genes （103 unigenes） were annotated in the cpDNA， including 73 protein-coding genes， 26 tRNA genes and 4 rRNA genes. Characteristic analysis showed that the number of SSR sites in the cpDNA of D. ochreatum was 58， most of which were mononucleotide or dinucleotide repeats with A/T base preference. Codon bias analysis showed that there were 32 biased codons and the majority of the biased codons were ended with A/U base. The phylogenetic tree of D. ochreatum and 13 Dendrobium species was constructed using cpDNA sequences. Result indicated that D. chrysotoxum and D. strongylanthum were closely related to D. ochreatum， and the IR/SC junctions analysis of Dendrobium species was consistent with the former. Global alignment of cpDNA of 4 Dendrobium species showed that the sequence variations were mainly concentrated in single copy regions， and varia-tions in the intergenic region were significantly higher than that in the gene coding region.

Keywords： Dendrobium ochreatum; cpDNA; characteristic; comparative analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.009

石斛屬（Dendrobium Sw.）為蘭科（Orchidaceae）多年生附生草本植物，既是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，也是名貴的觀賞花卉。石斛的幼年期較長(zhǎng)，從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變一般需要3年，受基因型及生長(zhǎng)環(huán)境條件影響而有所差異。大多石斛只能在2年生老莖上開(kāi)花，而黑喉石斛（D. ochreatum）成熟植株在當(dāng)年新長(zhǎng)出的嫩莖上就能抽出花序并開(kāi)花，其開(kāi)花時(shí)間明顯早于其他春石斛，是珍貴的育種親本，也是研究早花石斛開(kāi)花機(jī)理的重要材料[1]。黑喉石斛主要分布于印度阿薩姆邦、孟加拉、尼泊爾、緬甸、泰國(guó)、老撾等地區(qū)，其野生群體分布范圍廣，數(shù)量少，該物種與其他石斛的親緣關(guān)系和物種進(jìn)化研究未見(jiàn)報(bào)道。

蘭科植物多達(dá)20 000余種[2]，其部分物種的分類(lèi)與進(jìn)化研究長(zhǎng)期以來(lái)存在較大爭(zhēng)議[3]。在多數(shù)情況下，僅憑形態(tài)和解剖學(xué)特征分析已經(jīng)無(wú)法滿(mǎn)足屬間或?qū)賰?nèi)物種分類(lèi)的需求[4]。有學(xué)者利用DNA序列進(jìn)行物種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究，但是受目標(biāo)基因的選擇與數(shù)量等問(wèn)題的影響，其分析結(jié)果往往會(huì)存在較大分歧[5-7]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，葉綠體基因組（chloroplast DNA， cpDNA）的全長(zhǎng)序列測(cè)定與對(duì)比分析為植物的物種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了新的參考依據(jù)。葉綠體廣泛存在于真核自養(yǎng)生物中[8]，其擁有獨(dú)立的基因組即葉綠體基因組。相比于細(xì)胞核基因組，葉綠體基因組較小，全長(zhǎng)序列更易獲得[6];其具有獨(dú)特的母體遺傳特征，不存在基因重組的問(wèn)題，因而具有較高的保守性和適中的進(jìn)化速率，被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于植物遺傳進(jìn)化與種間、種內(nèi)多態(tài)性鑒定研究[9]。植物葉綠體基因組多為環(huán)狀DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，大小多為115～165 kb，通常包含2個(gè)反向重復(fù)區(qū)（inverted repeats， IRs），由1個(gè)大單拷貝區(qū)（large single copy， LSC）和1個(gè)小單拷貝區(qū)（small single copy， SSC）隔開(kāi)，共4個(gè)分區(qū)[10]。葉綠體全基因組序列的測(cè)定在物種鑒定、分子標(biāo)記、系統(tǒng)發(fā)育和轉(zhuǎn)基因的研究中發(fā)揮著重要作用，在物種系統(tǒng)進(jìn)化及其種間親緣關(guān)系等方面同樣有重要價(jià)值[11]。

本研究結(jié)合二代高通量測(cè)序和三代測(cè)序技術(shù)，獲得了黑喉石斛葉綠體基因組的全長(zhǎng)序列，對(duì)其特征與系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了分析，并將其序列與近緣物種的葉綠體基因組進(jìn)行了比較分析，以期為黑喉石斛物種鑒定、遺傳育種及分子進(jìn)化研究提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為長(zhǎng)勢(shì)良好且無(wú)病蟲(chóng)害的黑喉石斛植株，由貴州省園藝研究所保存并提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?DNA的提取與質(zhì)量檢測(cè) ?取黑喉石斛新鮮葉片，使用CTAB法提取其總基因組DNA后，分別通過(guò)Nanodrop超微量分光光度計(jì)、Qubit熒光計(jì)和0.35%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)黑喉石斛總基因組DNA的純度、濃度與完整性。

1.2.2 ?建庫(kù)與測(cè)序 ?高通量測(cè)序參照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)protocol，將檢測(cè)合格的DNA樣品，經(jīng)超聲波機(jī)械打斷的方式進(jìn)行片段化處理，片段化的DNA經(jīng)純化、末端修復(fù)、3'端加A和連接測(cè)序接頭等處理后，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳選擇其350 bp大小的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增（NEBNext?Ultra?DNA Library Prep Kit for Illumina?）形成測(cè)序文庫(kù)，然后使用Illumina NovaSeq測(cè)序儀對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序，reads長(zhǎng)度為150 bp。

三代測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程參照Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司提供的標(biāo)準(zhǔn)protocol，將檢測(cè)合格的DNA樣品，通過(guò)BluePippin全自動(dòng)核酸回收系統(tǒng)回收其大片段DNA，使用SQK-LSK109連接試劑盒構(gòu)建其測(cè)序文庫(kù)，經(jīng)過(guò)DNA損傷修復(fù)，末端修復(fù)，接頭連接，磁珠純化和Qubit文庫(kù)定量等步驟后使用Nanopore測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 ?黑喉石斛cpDNA序列的拼接、組裝與注釋  使用過(guò)濾軟件SOAPnuke對(duì)測(cè)序得到的序列進(jìn)行低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾。使用unicycler軟件對(duì)過(guò)濾后reads進(jìn)行組裝，首先用高準(zhǔn)確度的illumina數(shù)據(jù)（Q30>85%）進(jìn)行組裝，得到高質(zhì)量的葉綠體基因組骨架（contig），然后用Nanopore數(shù)據(jù)將高質(zhì)量contig連接成更長(zhǎng)的完整序列。將拼接結(jié)果與鉤狀石斛cpDNA（NCBI登錄號(hào)：NC038077.1）進(jìn)行比對(duì)，保留匹配且測(cè)序深度高于100的序列，最終確定候選序列的連接關(guān)系，得到黑喉石斛cpDNA。

通過(guò)專(zhuān)門(mén)針對(duì)葉綠體的注釋軟件CPGAVAS2對(duì)黑喉石斛cpDNA進(jìn)行注釋?zhuān)⒗肙GDRAW軟件對(duì)注釋后的結(jié)果繪圖分析。

1.2.4 ?黑喉石斛cpDNA的特征與系統(tǒng)進(jìn)化分析 ?采用MISA對(duì)黑喉石斛cpDNA葉綠體進(jìn)行SSR檢測(cè)，搜索參數(shù)設(shè)置為：?jiǎn)魏塑账釂卧貜?fù)數(shù)至少為10，二核苷酸重復(fù)單元數(shù)至少為5，三核苷酸單元的重復(fù)數(shù)至少為4，四、五、六核苷單元的重復(fù)數(shù)至少為3[12]，2個(gè)SSR之間的最小距離設(shè)置為100 bp，循環(huán)排列或反向互補(bǔ)的SSR位點(diǎn)視為同一類(lèi)型。

通過(guò)CodonW對(duì)黑喉石斛cpDNA中長(zhǎng)度大于300，并且以ATG、TTG、CTG、ATT、ATC、GTG、ATA作為起始密碼子，以TGA、TAG、TAA作為終止密碼子的基因序列進(jìn)行密碼子偏好性分析，統(tǒng)計(jì)估算其相對(duì)同義密碼子使用頻率（relative synonymous codon usage， RSCU）即密碼子使用偏好性。

從NCBI上下載鐵皮石斛、齒瓣石斛、兜唇石斛等13個(gè)物種的cpDNA，使用MAFFT軟件（version 7.467）將這些序列與黑喉石斛cpDNA進(jìn)行多序列比對(duì)，然后基于最大似然法的RAXML（randomized axelerated maximum likelihood）軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 ?黑喉石斛cpDNA序列的比較分析 ?使用IRscope分析黑喉石斛與其他8種石斛的cpDNA結(jié)構(gòu)中四大分區(qū)的SC/IR邊界擴(kuò)張收縮情況;通過(guò)mVISTA軟件以黑喉石斛cpDNA為參照基因組，與其他3種石斛cpDNA進(jìn)行全長(zhǎng)對(duì)比分析，同時(shí)利用DnaSP分析其核酸變異情況，篩選高變異性位點(diǎn)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?黑喉石斛cpDNA結(jié)構(gòu)與基因注釋

黑喉石斛cpDNA全長(zhǎng)154 935 bp，GC含量37.38%。結(jié)構(gòu)為典型的環(huán)狀雙鏈四分體結(jié)構(gòu)（圖1），由1個(gè)大單拷貝區(qū)（LSC，85 124 bp），1個(gè)小單拷貝區(qū)（SSC，17 417 bp）和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)（IR，26 197 bp）組成。4個(gè)區(qū)段中，GC含量最高的為IR區(qū)（43.43%），其次為L(zhǎng)SC區(qū)（34.98%）。

注釋黑喉石斛cpDNA共得到125個(gè)基因（LSC區(qū)78個(gè)，SSC區(qū)9個(gè)，2個(gè)IR區(qū)各19個(gè)），其中unigenes有103種，包含73種蛋白質(zhì)編碼基因，26種tRNA基因和4種rRNA基因（表1）。有rps19、rpl2、rpl23、ycf2、ycf15、rps7、rps12等7個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，trnH-GUG、trnM-CAU、trnL-CAA、trnV-GAC、trnE-UUC、trnA-UGC、trnR-ACG、trnN-GUU等8個(gè)tRNA基因和rrn16S、rrn23S、rrn4.5S、rrn5S等4個(gè)rRNA基因在IRs區(qū)域被重復(fù)1次，另有trnE-UUC和trnM-CAU在LSC區(qū)分別重復(fù)1次和2次。黑喉石斛cpDNA大部分基因無(wú)內(nèi)含子，共有9種蛋白質(zhì)編碼基因（ycf1、rpoC1、atpF、petB、petD、rpl2、rpl16、rps12、rps16）和5種tRNA基因（trnE-UUC、trnA- UGC、trnL-UAA、trnS-CGA、trnV-UAC）含有1個(gè)內(nèi)含子，2種蛋白質(zhì)編碼基因ycf3和clpP含有2個(gè)內(nèi)含子。

2.2 ?黑喉石斛cpDNA的SSR位點(diǎn)和密碼子偏好性分析

分析黑喉石斛cpDNA共找到58個(gè)SSR位點(diǎn)，其SSR標(biāo)記密度0.374個(gè)/kb。所有SSR位點(diǎn)中，出現(xiàn)次數(shù)最多的為單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)（表2）。黑喉石斛cpDNA編碼序列共編碼20 595個(gè)氨基酸（含終止密碼子在內(nèi)），其中編碼亮氨酸（Leu）的密碼子使用頻率最高，為2078次（10.09%）;其次是異亮氨酸（Ile）和絲氨酸（Ser），分別檢測(cè)到1667次（8.09%）和1633次（7.93%）;使用頻率最低的是編碼半胱氨酸（Cys）的密碼子，僅出現(xiàn)237次（1.15%）。黑喉石斛cpDNA的64種密碼子中，RSCU值大于1.00的密碼子有32個(gè)，其中有30個(gè)以A/U堿基結(jié)尾，僅有2個(gè)以C/G堿基結(jié)尾;偏好性最強(qiáng)的密碼子AGA，編碼精氨酸（Arg），其RSCU值達(dá)到1.9（表3）。說(shuō)明黑喉石斛cpDNA密碼子偏好以A/U（T）堿基結(jié)尾。

2.3 ?黑喉石斛cpDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MAFFT對(duì)13種石斛的cpDNA與測(cè)序所得黑喉石斛cpDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行多重比對(duì)，基于比對(duì)結(jié)果構(gòu)建Maximum Likelihood（ML）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分析結(jié)果表明（圖2），黑喉石斛cpDNA與鼓槌石斛和梳唇石斛序列親緣關(guān)系較近，這3種石斛首先聚為一支，1000次檢驗(yàn)水平上支持率達(dá)到100%;隨后又與劍葉石斛聚為一支，支持率93%;然后才與石斛組的流蘇石斛、疊鞘石斛和束花石斛聚為一類(lèi)。

2.4 ?黑喉石斛cpDNA的SC/IR邊界分析

分析黑喉石斛等9種石斛屬植物cpDNA四分體結(jié)構(gòu)的SC/IR邊界收縮擴(kuò)張情況，結(jié)果表明（圖3），石斛屬植物的LSC/IRb邊界較為保守，基本都位于rpl22基因的編碼區(qū)內(nèi)，僅有鼓槌石斛LSC/IRb位于rpl22基因右側(cè)的非編碼區(qū);IRb/SSC區(qū)邊界存在較大分化，大部分石斛的IRb/SSC邊界位于ycf1和ndhF基因的重疊區(qū)且向后者的編碼區(qū)內(nèi)擴(kuò)張，黑喉石斛、梳唇石斛和鼓槌石斛的IRb/SSC邊界左側(cè)的ycf1編碼區(qū)消失，邊界向IRb區(qū)域方向擴(kuò)張，黑喉石斛cpDNA同時(shí)出現(xiàn)了ndhF基因缺失現(xiàn)象;除鼓槌石斛外，大部分石斛cpDNA的SSC/IRa區(qū)邊界皆位于ycf1基因的編碼區(qū)內(nèi);IRa/SSC邊界皆位于psbA基因左邊的非編碼區(qū)，黑喉石斛及與其親緣關(guān)系較近的鼓槌石斛和梳唇石斛cpDNA的IRa/SSC不在rpl22基因的編碼區(qū)內(nèi)。

2.5 ?黑喉石斛cpDNA的比較分析

通過(guò)mVISTA軟件以黑喉石斛cpDNA為參照基因組，與鼓槌石斛、梳唇石斛和束花石斛cpDNA進(jìn)行全長(zhǎng)對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)圖4，4種石斛cpDNA的編碼區(qū)較為保守，除ycf類(lèi)基因外，絕大部分編碼序列的相似度皆保持在較高的水平;rRNA類(lèi)基因所在的IR區(qū)，其變異程度明顯低于LSC和SSC區(qū);變異主要發(fā)生在相鄰基因的間隔區(qū)內(nèi)，如matK-rps16、trnF-GAA-ndhK、trns- GCU-trns-CGA等。

同時(shí)通過(guò)DnaSP6分析上述4種石斛cpDNA的高變異區(qū)，結(jié)果見(jiàn)圖5，4種石斛cpDNA的核酸變異主要集中在LSC和SSC區(qū)，IR區(qū)大部分序列核酸變異程度處于較低水平，與序列對(duì)比分析結(jié)果一致;結(jié)合vMISTA圖譜確定了變異度前3位的間隔區(qū)位置，分別為trnS-GCU-trnS-CGA（8531～ 9660 bp），trnF-GAA-ndhK（49 104～50 329 bp）和trnM-CAU-atpE（51 611～51 790 bp）。

3 ?討論

通過(guò)分析黑喉石斛cpDNA特征發(fā)現(xiàn)，其單核苷酸和二核苷酸重復(fù)類(lèi)型的SSR位點(diǎn)存在明顯的堿基偏好性，以A/T堿基為主，比例為93.94%和81.75%;密碼子偏好性分析結(jié)果表明其偏好的密碼子有93.75%以A/U（T）堿基結(jié)尾。這種偏好性與黑喉石斛cpDNA富含A/T堿基的情況一致，且廣泛存在于蘭科及其他植物中。Niu等[13]和Mccoy等[14]認(rèn)為A/T堿基包含的氮原子少于G/C堿基，A/T富集型的堿基突變會(huì)消耗更少的能量，而能量消耗上的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)生了堿基的偏好性。這種堿基水平上的偏好不僅作用于SSR位點(diǎn)的類(lèi)型和密碼子的選擇，也與cpDNA各個(gè)分區(qū)的穩(wěn)定性存在重要的關(guān)聯(lián)[15]。以黑喉石斛為參照分析4種石斛cpDNA的結(jié)構(gòu)與序列變異性發(fā)現(xiàn)，GC含量較高的IR區(qū)（43.43%），其序列核苷酸的變異程度明顯低于GC含量較高的LSC區(qū)（34.98%）和SSC區(qū)（30.88%）。

Kim[16]認(rèn)為葉綠體基因組的IR/SC邊界變異是葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變異的主要驅(qū)動(dòng)力，IR/SC邊界的收縮和擴(kuò)張?jiān)谥参颿pDNA的演化過(guò)程中起重要作用[17-18]。絕大多數(shù)蘭科植物的IR/LSC邊界較為保守，其IR內(nèi)靠近IR/LSC邊界的位置往往會(huì)存在一個(gè)rpl22或著trnH-rps19基因簇[5， 19]。但I(xiàn)R/SSC邊界的差異在不同蘭科植物中較為顯著，Luo等[5]按照IR/SSC邊界的差異將蘭科植物分為4類(lèi)：TypeⅠ/Ⅱ類(lèi)蘭科植物IR/SSC邊界分別位于ycf1-ndhF的間隔區(qū)或者ndhF的編碼區(qū)內(nèi);TypeⅢ類(lèi)蘭科植物IR/SSC邊界左側(cè)的部分ycf1基因編碼區(qū)變短;TypeⅣ類(lèi)IR/SSC邊界左側(cè)的部分ycf1基因編碼區(qū)消失，ycf1基因完全位于SSC區(qū)域內(nèi)部。Luo等[5]根據(jù)這種分類(lèi)情況提出假設(shè)即蘭科植物的cpDNA存在2條演化路線：（1）TypeⅠ類(lèi)SSC區(qū)內(nèi)的ycf1基因向IRa區(qū)方向擴(kuò)張，導(dǎo)致其在IRb區(qū)的部分編碼區(qū)也向IR/SSC邊界移動(dòng)，并與ndhF基因發(fā)生重疊，形成TypeⅡ類(lèi);（2）TypeⅠ類(lèi)的ycf1基因向SSC區(qū)內(nèi)部持續(xù)移動(dòng)，其位于IR/SSC邊界的部分編碼區(qū)越來(lái)越短，形成TypeⅢ類(lèi)，隨著ycf1基因完全嵌入SSC區(qū)，其位于IR/SSC邊界的部分編碼區(qū)消失，形成TypeⅣ類(lèi)。從這種理論來(lái)看，黑喉石斛、鼓槌石斛和梳唇石斛皆歸屬于TypeⅣ類(lèi)，其親緣關(guān)系應(yīng)當(dāng)較為接近，與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致。此外，黑喉石斛SSC區(qū)出現(xiàn)的ndhF基因缺失現(xiàn)象廣泛存在于蘭科植物內(nèi)[20]，一般認(rèn)為cpDNA中ndh類(lèi)基因的缺失是由于該類(lèi)基因功能退化或者向核基因組發(fā)生轉(zhuǎn)移，不會(huì)影響植物的生命活動(dòng)，部分研究者認(rèn)為真菌共生推動(dòng)了這種現(xiàn)象的發(fā)生[21-22]。

本研究結(jié)合二代、三代測(cè)序技術(shù)，首次獲得并報(bào)道了黑喉石斛cpDNA的全長(zhǎng)序列，對(duì)其結(jié)構(gòu)、SSR位點(diǎn)和密碼子偏好性等特征進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和闡釋。整合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和IR/SC邊界圖譜，初步分析了黑喉石斛與其他13種石斛的親緣關(guān)系情況。同時(shí)與近緣物種的cpDNA進(jìn)行了全序列比較分析，篩選高序列變異片段。這些研究結(jié)果為黑喉石斛的物種鑒定、標(biāo)記開(kāi)發(fā)利用、遺傳育種及系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了新的參考。

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