林慶賓 陳鵬 劉宇 李楠

〔摘要〕 目的 觀察補腎活血湯對脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）大鼠后肢功能、脊髓組織病理損傷，及對Tau、BDNF、NT-3、NGF蛋白表達的影響，探討其作用機制。方法 24只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、補腎活血湯組，每組8只。模型組、補腎活血湯組大鼠采用改良Allen’s法建立大鼠SCI模型，假手術組手術操作同模型組，但不打擊脊髓。補腎活血湯組大鼠用補腎活血湯以10.8 g/（kg·d）劑量灌胃，假手術組和模型組大鼠用等量生理鹽水灌胃。在模型建立后第1、3、7、14、28天用巴索、比蒂和布雷斯納漢運動評級（Basso， Beattie & Bresnahan locomotor rating， BBB）法評估大鼠后肢功能;第28天觀察結束后進行脊髓組織取材，尼氏染色觀察脊髓組織病理結構;用Western blot和免疫組化法檢測脊髓組織Tau、BDNF、NT-3、NGF蛋白的表達。結果 （1）與模型組相比，補腎活血湯組大鼠BBB評分在第14、28天明顯增高（P<0.05）;（2）補腎活血湯組脊髓組織神經(jīng)元數(shù)目（P<0.05）和形態(tài)優(yōu)于模型組;（3）Western blot和免疫組化結果顯示，與模型組相比，補腎活血湯脊髓組織Tau蛋白表達顯著降低（P<0.05），BDNF、NT-3、NGF的表達顯著增高（P<0.05或P<0.01）。結論 補腎活血湯可改善SCI大鼠肢體功能，減輕脊髓組織病理損傷，其作用機制可能與抑制Tau蛋白表達，增加BDNF、NT-3、NGF蛋白的表達有關。

〔關鍵詞〕 補腎活血湯;脊髓損傷;Tau;BDNF;NT-3;NGF

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.007

Effect of Bushenhuoxue Decoction on Tau Protein and Neurotrophic Factor Expression in

Rats with Spinal Cord Injury

LIN Qingbin1，2， CHEN Peng1，2， LIU Yu1，2， LI Nan1，2

（1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou， Fujian 350122， China; 2. Key Laboratory of Orthopedics & Traumatology of Traditional Chinese Medicine and Rehabilitation， Ministry of Education， Fujian University of Traditional

Chinese Medicine， Fuzhou， Fujian 350122， China）

〔Abstract〕 ?Objective To observe the effects of Bushenhuoxue Decoction on limb function， pathological structure of spinal cord， expression of Tau， BDNF， NT-3 and NGF in spinal cord injury （SCI） rats， and to explore its effect mechanism. Methods 24 SD rats were randomly divided into sham operation group， model group and Bushenhuoxue Decoction group， with 8 rats in each group. SCI model was established by modified Allen’s method in the model group and Bushenhuoxue Decoction group. Operation in the sham operation group was the same as that of the model group without spinal cord attack. Rats in the Bushenhuoxue Decoction group were given the Bushenhuoxue Decoction at 10.8 g/（kg·d） dose while sham operation group and the model group were given the same amount of normal saline. Basso， Beattie & Bresnahan locomotor rating （BBB） method was used to evaluate the hind limb function of rats at 1， 3， 7， 14， and 28 days after model establishment. Spinal cord tissue samples were taken after the observation on day 28. The pathological structure of the spinal cord was observed by Nissl staining， and the expression levels of Tau， BDNF， NT-3 and NGF in the spinal cord were detected by Western blot and immunohistochemistry. Results （1） Compared with model group， BBB scores of the rats in the Bushenhuoxue Decoction group were significantly increased at 14th and 28th day （P<0.05）. （2） The number （P<0.05） and morphology of neurons of spinal cord in Bushenhuoxue Decoction group were superior than those in model group. （3） Western blot and immunohistochemical results showed that， compared with the model group， the expression of Tau protein in the spinal cord of Bushenhuoxue Decoction group was significantly decreased， and the expression levels of BDNF， NT-3 and NGF were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Bushenhuoxue Decoction can improve limb function and relieve pathological injury of spinal cord in SCI rats， and its mechanism may be related to inhibiting Tau protein expression and increasing the expression of BDNF， NT-3 and NGF proteins.

〔Keywords〕 Bushenhuoxue Decoction; spinal cord injury; Tau; BDNF; NT-3; NGF

脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）屬于嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，是脊柱骨折最嚴重的并發(fā)癥之一，可導致?lián)p傷平面以下運動、感覺和自主神經(jīng)功能障礙[1]。SCI具有高致死率和致殘性的特點，全世界因創(chuàng)傷導致的SCI發(fā)病率約為3.6～195.4人次/100萬[2]。中國SCI發(fā)病率約為37人次/100萬，而且好發(fā)人群集中在青壯年，不僅給患者本人造成嚴重傷害，也給家庭和社會帶來沉重的負擔[3]。目前，SCI最常用的治療方法為手術減壓內固定和大劑量激素沖擊療法，能有效解除對脊髓造成的壓迫，改善脊髓血供，防止繼發(fā)性SCI，但對于已經(jīng)造成的原發(fā)性SCI療效有限。如何改善SCI一直都是臨床研究的熱點，補陽還五湯、脊髓康、黃芪桂枝五物湯、活血通督湯等益氣活血通絡的方劑已被證實能夠一定程度上改善SCI，但還需進一步研究其作用機制[4-7]。脊髓的位置及功能與中醫(yī)經(jīng)絡學說中的“督脈”相近。腎主骨生髓，與督脈關系密切，督脈損傷必然累及腎臟。因此，SCI的治則不僅需要活血化瘀、益氣通絡，更應重視補腎。補腎活血湯出自清代趙竹泉的《傷科大成》，有補腎填精、化瘀通絡之功，臨床研究已證實其聯(lián)合針刺有助于SCI患者肢體功能康復[8]。因該研究是補腎活血湯聯(lián)合針刺作為干預手段，補腎活血湯的作用及機制還需進一步研究明確。因此，本實驗擬建立大鼠SCI模型，觀察補腎活血湯對大鼠后肢功能、脊髓病理結構、脊髓組織Tau、BDNF、NT-3、NGF蛋白表達的影響，對補腎活血湯治療SCI的作用及機制做進一步研究。

1 材料

1.1 ?動物

SPF級2月齡SD大鼠共24只，體質量（220±20） g，雌雄各半，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。實驗動物購回后飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心，喂養(yǎng)環(huán)境符合實驗動物飼養(yǎng)標準。實驗前進行適應性喂養(yǎng)一周，所有的操作均遵照福建中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的要求進行。

1.2 ?藥物

補腎活血湯藥物組成具體如下：熟地黃9 g，杜仲3 g，枸杞子3 g，補骨脂9 g，菟絲子10 g，當歸尾3 g，沒藥3 g，山茱萸3 g，紅花1.5 g，獨活3 g，淡肉蓯蓉3 g。補腎活血湯藥物購自福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院中藥房，藥物符合2015版《中華人民共和國藥典》標準[9]。藥物加工成1 mL湯藥含生藥1 g，即1 g/mL，無菌封瓶，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ?主要試劑

Tau（批號：66499-1）、BDNF（批號：66292-1-Ig）、NT-3（批號：18084-1-AP）均購自美國Proteintech Group公司;NGF（批號：BM4100）、β-actin（批號：BM0627）、HRP-羊抗兔（批號：BA1054）、HRP-羊抗小鼠（批號：BA1050）均購自武漢博士德生物工程有限公司;尼氏染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1430）。

1.4 ?主要儀器

脫水機（型號：JJ-12J）、包埋機（型號：JB-P5）均購自武漢俊杰電子有限公司;切片機（上海萊卡儀器有限公司，型號：RM2016）;烤箱（上海慧泰儀器制造有限公司，型號：DHG-9140）;水浴鍋（天力醫(yī)療器械有限公司，型號：TL-420）;倒置顯微鏡（日本尼康公司，型號：ECLIPSE TI-SR）;電泳儀（型號：1648001）、轉印槽（型號：1704150）均購自美國bio-rad公司;低溫離心機（德國Thermo公司，型號：Heraeus Fresco17）。

2 方法

2.1 ?動物分組

24只SD大鼠隨機分為3組：假手術組、模型組、補腎活血湯組，每組8只。

2.2 ?模型建立

用改良Allen’s法建立大鼠T10脊髓急性挫傷動物模型[10]。用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，通過計數(shù)肋骨定位T10胸椎，減除大鼠背部手術切口周圍毛發(fā)，碘伏消毒，鋪無菌手術巾。以T10棘突為中心作一長約3 cm的縱行切口，逐層切開皮膚、筋膜，鈍性分離兩側椎旁肌，暴露T9-T11棘突椎板。用咬骨鉗咬除T10棘突及椎板，顯露硬脊膜打擊區(qū)。將直徑2 mm、10 g的圓柱狀金屬棒從5 cm高處垂直落下，建立T10脊髓急性挫傷模型。打擊后硬脊膜表面立刻可見出血，以大鼠出現(xiàn)后肢回縮和尾巴痙攣性擺動作為打擊成功標志[11]。沖洗創(chuàng)口，逐層縫合肌肉、皮膚。模型組、補腎活血湯組大鼠均采用改良Allen’s法造模;假手術組大鼠不打擊脊髓，其余手術操作同模型組。

2.3 ?藥物干預

補腎活血湯組大鼠從術后第1天開始用補腎活血湯灌胃，每天2次，具體的給藥劑量按照人與大鼠體表面積換算為10.8 g/（kg·d）[12]。假手術組和模型組大鼠于術后第1天開始用等量生理鹽水灌胃。

2.4 ?觀察指標

于造模手術后第28天進行最后一次巴索、比蒂和布雷斯納漢運動評級（Basso， Beattie & Bresnahan locomotor rating， BBB）法評分[13]，評分結束后處死大鼠。以T10脊髓節(jié)段為中心切取長約2 cm脊髓組織，用預冷的生理鹽水將脊髓表面血液清洗干凈，按照檢測方法要求對脊髓組織做進一步處理。

2.4.1 ?后肢功能評分 ?各組大鼠于造模后第1、3、7、14、28天采用BBB法評估各組大鼠后肢功能。將大鼠后肢運動功能分為22個等級，后肢全癱為0分，完全正常為21分。

2.4.2 ?尼氏染色 ?脊髓組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，再依次經(jīng)過梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。以5 μm的厚度進行連續(xù)切片，選擇完整的切片條帶貼片，烤片。將切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，然后浸入焦油紫染液中。將染色缸放入56 ℃烤箱中1 h，蒸餾水沖洗2 min，用分化液分化約2 min，直至背景接近于無色為止。依次脫水、透明、中性樹膠封片。切片置于顯微鏡下觀察。

2.4.3 ?Western blot法檢測 ?取約100 mg脊髓組織，用預冷的TBS洗滌組織，加入含有蛋白抑制劑的RIPA裂解液，置于冰浴中超聲勻漿，4 ℃、10 000 g離心10 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度，進行蛋白電泳分析。取30 μg蛋白質樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳。將膠上的蛋白質帶轉移至NC膜上，150 mA轉移1 h。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉劑室溫下封閉，搖床搖動1.5 h，TBST洗，膜轉入適度稀釋的一抗（BDNF為1∶1000，Tau為1∶1000，NT-3為1∶1500，NGF 為1∶500，β-actin為1∶1500），4 ℃緩慢振搖過夜。TBST洗，加入生物素標記的二抗，4 ℃搖擺孵育2 h，TBST洗，配制ECL發(fā)光劑，均勻涂在膜上，暗室內曝光、顯影，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。

2.4.4 ?免疫組化法檢測 ?將切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶。用EDTA抗原修復液進行抗原修復，用5% BSA進行封閉。切片滴加適度稀釋的一抗（BDNF為1∶200，Tau為1∶200，NT-3為1∶150，NGF為1∶100）后置于4 ℃冰箱過夜。PBS 漂洗，滴加二抗，置于濕盒中37 ℃反應30 min。PBS漂洗，DAB適度顯色，蘇木素復染。經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性表達神經(jīng)元呈棕黃或棕褐色。每張組織切片在高倍鏡下，于神經(jīng)元豐富區(qū)隨機選取5個相互非重疊視野進行觀察，計算平均吸光度值。

2.5 ?統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以“x±s”表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則采用單因素方差分析，組間比較若方差齊則用LSD檢驗，若方差不齊則采用Dunnett’s T3檢驗;不滿足正態(tài)分布者，采用非參數(shù)Kruskal-0wallis檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 ?各組大鼠后肢功能評分比較

與假手術組相比，模型組和補腎活血湯組BBB評分在1、3、7、14、28 d顯著降低（P<0.01）。與模型組相比，補腎活血湯組BBB評分在14、28 d明顯增高（P<0.05）。見圖1。

3.2 ?各組大鼠尼氏染色結果

假手術組脊髓組織結構完整，神經(jīng)元結構清晰，核仁居中，胞漿中可見大量藍紫色、呈斑塊狀的尼氏體，可見明顯的樹突和軸突;模型組脊髓前角神經(jīng)元數(shù)目較假手術組明顯減少，部分神經(jīng)元尼氏體結構模糊，樹突和軸突較少;補腎活血湯組脊髓前角神經(jīng)元數(shù)量較模型組有所增加，尼氏體顆粒較明顯，樹突和軸突的數(shù)目較模型組明顯增加。見圖2。

3.3 ?各組大鼠Tau、BDNF、NT-3、NGF蛋白表達比較

與假手術組相比，模型組和補腎活血湯組Tau、BDNF、NT-3、NGF蛋白相對表達量顯著增高（P<0.01）。與模型組相比，補腎活血湯組Tau蛋白相對表達量明顯降低（P<0.05），BDNF、NT-3、NGF蛋白相對表達量顯著增高（P<0.05）。見圖3。

3.4 ?各組大鼠Tau、BDNF、NT-3、NGF平均吸光度值比較

與假手術組相比，模型組和補腎活血湯組Tau、BDNF、NT-3、NGF平均吸光度值顯著增高（P<0.05或P<0.01）;與模型組相比，補腎活血湯組Tau平均吸光度值顯著下降（P<0.05），BDNF、NT-3、NGF平均吸光度值顯著增高（P<0.05或P<0.01）。見表1、圖4。

4 討論

古代中醫(yī)文獻中無SCI的病名，需從與SCI癥狀相近的論述中去溯源。《靈樞·寒熱病》有云：“若有所墮墜，四肢懈惰不收，名曰體惰”，該描述與SCI導致外傷性截癱的癥狀相近，故可認為“體惰”是SCI最早的中醫(yī)病名[14]。按照中醫(yī)辨證，SCI屬于“萎證”和“體惰”范疇[15]。督脈循行于人體背側正中，為陽脈之海，總督一身之陽氣，有溝通聯(lián)系肢體的作用;脊髓位于椎管內，屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主司肢體的運動和感覺功能。督脈與脊髓不論是位置，還是功能均有相似之處，故在中醫(yī)研究中大多將脊髓等同于督脈，對SCI多采用活血祛瘀、通督的治法[16-18]。但督脈屬于經(jīng)絡辨證范疇，適用于針刺、電針、艾灸等治療方式，而中藥治療大多采用臟腑辨證，因此，不僅要從活血化瘀、疏通督脈考慮，還要從臟腑辨證角度進行梳理，探討督脈的本質及其與臟腑的關系。

腎藏精，主骨，生髓，脊髓、腦髓皆屬于“髓”的范疇，依賴腎精的充養(yǎng)，與腎臟關系密切?；谥嗅t(yī)理論中腎與督脈、絡脈的關系以及臨床從腎論治脊髓疾?。ㄟ\動神經(jīng)元病、脊髓空洞癥、脊髓炎、多發(fā)性硬化、遺傳性脊髓型共濟失調等）的有效經(jīng)驗，王殿華等[19-20]提出“腎督絡”假說，即督脈反映了脊髓的絕大部分功能，督脈的物質基礎是腎所藏之精，督脈的功能依賴腎精化生，而其對軀干、四肢聯(lián)系是由絡脈來實現(xiàn)的。督脈功能的正常發(fā)揮，與腎和絡脈密不可分，故脊髓疾病應從腎進行論治。因此，SCI的中醫(yī)治則除了活血祛瘀、通督，還需重視補腎，通過補腎化生精氣，輸布于督脈，再通過督脈和絡脈轉輸四肢和軀干。

補腎活血湯出自清代趙竹泉的《傷科大成》，方中重用熟地黃、補骨脂、菟絲子為君藥，補益肝腎、填精益髓;杜仲、枸杞子、山茱萸輔助君藥補益肝腎;紅花、沒藥、當歸尾以活血祛瘀、行氣止痛;肉蓯蓉補腎陽、潤腸。全方具有補腎填精、活血化瘀之功。本實驗采用BBB評分來評估大鼠后肢功能，評分結果顯示，補腎活血湯組大鼠BBB評分在第14天和28天顯著高于模型組，提示補腎活血湯有改善SCI大鼠的后肢功能的作用。尼氏染色結果顯示，補腎活血湯組脊髓前角神經(jīng)元的數(shù)目、形態(tài)均優(yōu)于模型組，提示補腎活血湯有減輕SCI大鼠脊髓病理損傷的作用。

Tau蛋白屬于微管相關蛋白家族，它主要表達在神經(jīng)軸突，同時也存在于神經(jīng)細胞核中，與染色體骨架相連。Tau蛋白是一種多功能蛋白，具有穩(wěn)定微管的作用，通過與生長錐中的絡氨酸相連接，可影響軸突的形成和生長[21]。Tau蛋白過度磷酸化可導致微管結構破壞，影響軸突轉運，導致神經(jīng)元損傷[22]。Ying等[23]的研究證實，Tau蛋白在大鼠SCI模型中表達增高，并且隨著SCI病變程度的加重，其表達進一步增高，可以作為標志物用來預測SCI的嚴重程度以及肢體功能的結局。周成福等[24]的研究顯示，SCI大鼠脊髓組織Tau蛋白表達增高，與神經(jīng)元凋亡密切相關。本實驗Western blot和免疫組化的結果均顯示，補腎活血湯組與模型組相比，Tau蛋白表達明顯降低，證實補腎活血湯能抑制SCI大鼠脊髓組織Tau蛋白表達。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內廣泛存在、結構相似、具有保護神經(jīng)作用的一個蛋白家族，主要包括了神經(jīng)生長因子（nerve growth factor， NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)素-3（neurotrophin-3， NT-3）等，對脊髓受損神經(jīng)元的生長、存活、軸突的連接具有重要作用[25]。Liang等[26]的研究顯示，SCI大鼠脊髓組織BDNF表達增高，BDNF可以通過調節(jié)TrkB/p38/MAPK信號通路減輕炎癥。Ye等[27]證實，NT-3可通過抑制MAPK通路促進SCI修復。Zhang等[28]的研究顯示，黃芩提取物可以改善SCI，其機制與上調BDNF蛋白表達有關。范筱等[29-30]研究顯示，活血通督湯可以促進SCI大鼠脊髓組織BDNF、NGF、NT-3蛋白的表達，從而促進損傷修復，改善肢體功能。本實驗Western blot和免疫組化的結果一致顯示，與模型組相比，補腎活血湯組脊髓組織BDNF、NT-3、NGF蛋白表達顯著增加，提示補腎活血湯能促進SCI大鼠脊髓組織神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，有助于SCI修復。

綜上所述，補腎活血湯有活血化瘀的作用，有助于疏通督脈，有補腎之功，通過腎精的生髓作用，充養(yǎng)脊髓，可能有助于改善督脈的生理功能。補腎活血湯能減輕大鼠SCI，改善SCI大鼠后肢功能，減輕脊髓組織病理損傷，其作用機制可能與抑制脊髓組織Tau蛋白的表達，增加神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NT-3、NGF蛋白表達有關。

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