劉 敏，陳登榜△，米永杰，代呂霞，代 娟，何 煦

1.成都醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)

著床是指囊胚通過與子宮內(nèi)膜相互作用逐漸植入子宮內(nèi)膜的動態(tài)過程。在胚胎著床時(shí)，胚胎滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞表現(xiàn)出與惡性腫瘤細(xì)胞相似的侵襲行為，且比腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲力[1]。近年來，研究[2-5]發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白(aquaporins，AQPs)在惡性腫瘤細(xì)胞數(shù)量增加、細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞運(yùn)動中均起到重要作用，而這些因素與腫瘤細(xì)胞的侵襲力密切相關(guān)。

AQPs是介導(dǎo)水轉(zhuǎn)運(yùn)的6次跨膜蛋白，其廣泛存在于動物及植物中，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡中發(fā)揮重要的生理作用[6]。AQPs根據(jù)功能分為水通道蛋白和甘油水通道蛋白。該蛋白不僅可以介導(dǎo)自由水的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，還可介導(dǎo)小分子物質(zhì)如甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]，AQP9屬于該亞族成員。Chen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞的AQP9可促進(jìn)水和甘油的運(yùn)輸，并調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖和遷移，當(dāng)?shù)捅磉_(dá)前列腺癌細(xì)胞AQP9時(shí)，可抑制癌細(xì)胞遷移。因此，AQP9介導(dǎo)的水和甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)在細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過免疫熒光和原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，AQP9在著床前的囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中表達(dá)豐富[9]，鑒于囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為相似，均具有較強(qiáng)的侵襲性，故推測卵巢激素可調(diào)節(jié)囊胚AQP9表達(dá)，AQP9參與了囊胚對子宮內(nèi)膜的粘附和侵襲，對胚胎的著床發(fā)揮了重要作用。本研究旨在探討卵巢雌孕激素對囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞AQP9表達(dá)的調(diào)節(jié)，以及AQP9在囊胚對子宮內(nèi)膜的粘附和著床中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 小鼠胚胎的獲取

所有實(shí)驗(yàn)均使用7～9周齡美國癌癥研究所(institute of cancer research，ICR)小鼠，小鼠購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物股份有限公司。小鼠胚胎的獲取按照以下方法[10 ]進(jìn)行：雌性ICR小鼠經(jīng)腹腔注入10 IU的孕馬血清促性腺激素(pregnant horse sera gonadotropin，PMSG)，48 h后注射10 IU的人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)。雄性和雌性小鼠按1∶2合籠，次日晨檢查雌性小鼠陰栓，以查見陰栓為孕第1天，在孕4 d上午處死小鼠，取出小鼠雙側(cè)子宮角，使用M2液沖洗宮腔獲得囊胚。本研究通過成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作符合關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物指導(dǎo)性的意見要求。

1.2 建立小鼠胚胎的體外著床模型

將子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞株Ishikawa接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，將處理后的囊胚移入培養(yǎng)有Ishikawa上皮細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)12 h后，將培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡觀察囊胚的粘附情況。輕輕搖動培養(yǎng)板20 s，若囊胚沒發(fā)生位置改變則記為粘附囊胚，計(jì)算各組囊胚的粘附率。

1.3 siRNA干擾

按riboFectTMCP Transfection Kit(166T) 說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Buffer(v1)稀釋siRNA-AQP9(si-AQP9)儲存液，室溫放置5 min；加入riboFectTMCP Reagent，室溫孵育15 min；向含有囊胚的培養(yǎng)孔中加入si-AQP9與riboFectTMCP Reagent的復(fù)合物，使si-AQP9的終濃度為100 nmol/L。轉(zhuǎn)染24 h后，收集囊胚用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 RT-PCR 檢測囊胚細(xì)胞AQP9的mRNA表達(dá)

收集小鼠囊胚，按照Trizol試劑說明書提取總RNA，紫外分光光度計(jì)確定濃度，OD260與OD280比值在1.8～2.1，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為：以 95 ℃、30 s, 95 ℃、5 s， 55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，變性和退火進(jìn)行了45個(gè)循環(huán)。采用MUS β-actin作為內(nèi)參基因，利用SDS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析樣本的Ct值，計(jì)算mRNA表達(dá)水平。利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)合成引物序列：MUS AQP9上游引物：5′-CCC AGGCTCTTCACTGCTCT-3′, 下游引物：5′-GGG GTTCGAGTGATGCATTT-3′；β-actin上游引物：5′-TCAGGAGGAGCAATGATC TTG-3′,下游引物：5′-TCCTCCCTGGAGAAGAG CTA-3′。

1.5 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)

采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測小鼠囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1和2(Phospho-extracellular regulated protein kinases 1/2,p-ERK1/2)蛋白表達(dá)。在收集的囊胚樣品中加入RIPA裂解液，將收集的裂解液置于4 ℃、12 000 r/min、離心半徑6.215 cm、離心10 min，取上清，BCA試劑盒測定蛋白濃度；在樣品中加入5×Loding buffer，沸水變性15 min，隨后12 000 r/min、離心半徑6.215 cm、離心3 min，收集上清液備用；濃縮膠起始電壓100 V進(jìn)行電泳15 min，分離膠180 V電泳，到達(dá)凝膠底部時(shí)終止電泳。采用“三明治”濕法，把凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將PVDF膜置于37 ℃、用5%脫脂奶粉封閉2 h。PVDF膜采用一抗(p-ERK1/2 1∶1 000、β-actin 1∶5 000)在4 ℃過夜孵育，加入二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h；采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行檢測，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。以產(chǎn)物蛋白條帶強(qiáng)度與內(nèi)標(biāo)強(qiáng)度的比值來反應(yīng)檢測蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 雌孕激素對囊胚細(xì)胞AQP9表達(dá)的調(diào)節(jié)

將收集的小鼠孕第4天的囊胚分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為空白對照組(Ctrl組)，加入0.01 μmol/L雌二醇的E2組，加入1 μmol/L孕激素的P4組，以及加入0.01 μmol/L E2和1 μmol/L P4的E2+P4聯(lián)合處理組，在處理24 h后收集各組囊胚，采用 RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組相比較，E2+P4聯(lián)合處理組AQP9在囊胚細(xì)胞中的表達(dá)升高，且與E2組、P4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明AQP9的表達(dá)受到E2+P4激素的聯(lián)合調(diào)節(jié)(圖1)。

圖1 雌孕激素對囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞AQP9表達(dá)的調(diào)節(jié)

2.2 雌孕激素對囊胚粘附的影響

在體外培養(yǎng)的囊胚中加入E2+P4激素，以及小干擾si-AQP9 100 nmol/L低表達(dá)囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中AQP9，作用24 h后收集囊胚，將囊胚與子宮內(nèi)膜上皮株Ishikawa聯(lián)合培養(yǎng)12 h后，采用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組囊胚粘附率(73.33±12.28)%比較，si-AQP9干擾組囊胚的粘附率(33.33±5.17)%明顯下降(P<0.05)(圖2)。

圖2 囊胚在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的粘附率

2.3 雌孕激素對囊胚細(xì)胞AQP9表達(dá)的影響

2.3.1 檢測囊胚AQP9 mRNA和p-ERK1/2表達(dá) 在培養(yǎng)的囊胚中，加入E2+P4激素以及小干擾si-AQP9 100 nmol/L低表達(dá)囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中AQP9，作用24 h后收集囊胚，采用RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，與Ctrl組相比較，si-AQP9組囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中AQP9 mRNA表達(dá)下降(圖3A)。收集的囊胚采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，si-AQP9組囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞p-ERK1/2蛋白的表達(dá)也較Ctrl組明顯降低(圖3B)。

2.3.2 檢測囊胚AQP9 mRNA表達(dá) 在培養(yǎng)的囊胚中加入E2+P4激素及ERK1/2的抑制劑U0126 20 mmol/L，以抑制囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中ERK1/2活性，24 h后收集囊胚。RT-PCR結(jié)果顯示，U0126組囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中AQP9 mRNA表達(dá)與Ctrl組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3C)。

2.3.3 觀察囊胚在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的粘附率 在培養(yǎng)的囊胚中加入E2+P4激素及ERK1/2的抑制劑U0126 20 mmol/L，以抑制囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中ERK1/2活性，24 h后收集囊胚，再將囊胚和子宮內(nèi)膜上皮聯(lián)合培養(yǎng)12 h后，采用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組囊胚的粘附率(76.92±9.01)%比較， U0126組粘附率(27.27±6.36)%明顯降低(圖3D)。

圖3 雌孕激素對囊胚細(xì)胞AQP9表達(dá)影響并通過ERK信號通路對囊胚粘附的影響

3 討論

AQP9為甘油水通道蛋白亞家族成員，可以介導(dǎo)自由水的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，還可介導(dǎo)甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而參與腫瘤的生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[11-13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)，卵巢雌激素可通過上調(diào)AQP9 mRNA，使輸卵管上皮AQP9蛋白的表達(dá)增加，表明AQP9的表達(dá)受到卵巢激素的調(diào)節(jié)。故推測卵巢激素調(diào)節(jié)了囊胚的AQP9表達(dá)。在體外培養(yǎng)的孕4 d的囊胚中，分別加入E2、P4以及E2+P4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E2+P4組囊胚細(xì)胞中的AQP9表達(dá)升高，這表明囊胚AQP9的表達(dá)受到E2+P4激素的聯(lián)合調(diào)節(jié)。

近年來，通過免疫熒光和原位雜交技術(shù)研究[9，15]發(fā)現(xiàn)，AQP9在著床前、小鼠孕4 d的囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中表達(dá)豐富，而囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞更具有侵襲性。因此，考慮AQP9是否參與了囊胚對子宮內(nèi)膜上皮的粘附和侵襲，從而在早期胚胎的著床中起到了關(guān)鍵作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，將si-AQP9小干擾加入培養(yǎng)的孕鼠囊胚細(xì)胞中，低表達(dá)囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中AQP9，再將小干擾處理后囊胚與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞株Ishikawa細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)12 h后，采用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組囊胚粘附率相比較，si-AQP9干擾組囊胚在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的粘附率下降，這提示囊胚AQP9參與了囊胚對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的粘附。

進(jìn)一步探討AQP9參與囊胚對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞粘附作用的機(jī)制。研究[8]發(fā)現(xiàn)，前列腺癌PC-3細(xì)胞的AQP9可促進(jìn)ERK1/2的磷酸化，使ERK1/2被激活，從而介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。ERK是絲/蘇氨酸蛋白激酶，為MAPK家族成員之一，定位于胞漿；ERK磷酸化后被激活，轉(zhuǎn)位至胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，參與各類細(xì)胞的生長、發(fā)育以及分裂[16]。并且磷酸化后激活的ERK1/2還可以參與維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖與分化以及腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[11-13]。此外，在著床前早期，囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)ERK的表達(dá)[15]，而囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞生物特性相似。因此，推測在胚胎著床前期，卵巢雌孕激素可上調(diào)早期囊胚細(xì)胞AQP9表達(dá)，并通過ERK通路參與了早期囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞對子宮內(nèi)膜細(xì)胞的粘附和侵襲。在培養(yǎng)的囊胚中，加入E2+P4激素以及si-AQP9低表達(dá)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中AQP9，檢測了囊胚細(xì)胞中p-ERK1/2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與Ctrl組比較，si-AQP9組的p-ERK1/2表達(dá)降低，這表明卵巢雌孕激素通過上調(diào)囊胚AQP9表達(dá)而激活ERK通路。而在培養(yǎng)的囊胚中，加入ERK1/2的抑制劑U0126，以抑制囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中ERK1/2活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)U0126組囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中AQP9 mRNA表達(dá)與Ctrl組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示囊胚AQP9為ERK1/2信號通路的上游分子。進(jìn)一步在體外培養(yǎng)囊胚中雌、孕激素作用后，加入ERK1/2抑制劑U0126抑制囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中ERK1/2活性，再將囊胚和子宮內(nèi)膜上皮聯(lián)合培養(yǎng)12 h后，采用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，U0126組囊胚在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的粘附率降低，表明雌孕激素通過ERK通路影響囊胚粘附。

綜上所述，在胚胎著床前期，卵巢雌孕激素可上調(diào)胚胎細(xì)胞AQP9表達(dá)，并通過ERK通路參與早期囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞對子宮內(nèi)膜細(xì)胞的粘附和侵襲，在胚胎著床中發(fā)揮了重要作用。本研究從一個(gè)新的視角探討了影響囊胚粘附、侵入和著床的機(jī)制，為臨床上不孕癥的診斷提供新的生物學(xué)標(biāo)志物，并為不孕癥的預(yù)防和治療提供一個(gè)新思路。