李佳蔓, 曹昆彬, 黃振, 陳炙, 郭洪英

四川省林業(yè)科學(xué)研究院, 四川 成都 610081

非洲堇又名非洲紫羅蘭，拉丁學(xué)名：Saintpaulia ionanthaWendl.，為苦苣苔科非洲堇屬植物，多年生常綠草本。非洲堇為聚傘花序、腋生、花序高出葉叢、每個(gè)花莖上1朵或數(shù)朵并生、花冠平展[1]?；ò觐愋陀袉伟?、半重瓣、重瓣、皺瓣等，花型有花邊型、三色堇型、星型、斑紋型、波浪型、胡蜂花型、鐘花型、管花型等，花色幾乎包含了除大紅和黃色外的各種顏色[2-4]。非洲堇栽培條件簡單，室內(nèi)具有散射光的窗邊，適宜人居住的空調(diào)環(huán)境等即可滿足其生長需要，而且只要養(yǎng)護(hù)得當(dāng)，一年四季均可開花，是優(yōu)良的窗臺(tái)、案頭點(diǎn)綴花卉，被譽(yù)為“室內(nèi)花卉皇后”[5-6]。另外，其品類繁多，至2005年，美國非洲紫羅蘭協(xié)會(huì)正式登記的非洲堇品種已超過9 500種，而未登記或未命名的估計(jì)在20 000種以上[2]。我國于20世紀(jì)80年代開始從美國和荷蘭引種非洲堇試管苗，目前少數(shù)中外合資園藝公司僅有小批量的生產(chǎn)，栽培尚不普遍，但發(fā)展前景依然很好。

研究擬針對(duì)非洲堇某些新奇品種開展組織培養(yǎng)技術(shù)研究，開發(fā)非洲堇新奇品種高效組培再生技術(shù)體系，快速繁殖優(yōu)良品種，為非洲堇新奇品種的規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

研究材料購買于正規(guī)種苗公司，共13個(gè)品種，材料背景清晰（見表1）。

表1 非洲堇外植體來源信息Tab.1 Source information of Saintpaulia explants

1.2 方法

（1）外植體選擇

選擇顏色深綠、形態(tài)飽滿的非洲堇植株中部完整葉片作為外植體材料，用毛刷輕刷以除去雜質(zhì)，流水沖洗3～5 min，撈出置于平盤中，用吸水濾紙吸干表面水分。

（2）消毒處理

在超凈工作臺(tái)上消毒清洗后（消毒處理方案見表2），用無菌吸水濾紙吸干表面水分，切分成1 cm2左右大小方塊，接種于附加蔗糖濃度為30 g·L-1、卡拉膠濃度6.5 g·L-1的MS培養(yǎng)基上。每個(gè)消毒處理接種10個(gè)方塊（每瓶一個(gè)外植體），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。光照強(qiáng)度2000 Lux～3000 Lux，培養(yǎng)溫度25±3℃（如無特殊說明，培養(yǎng)條件下同）。第5天開始記錄污染率、褐化率，到第15天，統(tǒng)計(jì)整個(gè)過程的污染率、褐化率，計(jì)算無菌外植體獲得率。

表2 非洲堇外植體消毒方案Tab.2 Sterilization plan for Saintpaulia explants

（3）愈傷出芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基篩選

無菌外植體轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)和不定芽誘導(dǎo)，培養(yǎng)30d后，統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率，計(jì)算單個(gè)外植體平均出芽個(gè)數(shù)和正常不定芽率。以期篩選最佳愈傷出芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

將誘導(dǎo)培養(yǎng)基中獲得的正常不定芽分成單株或3～4個(gè)芽為一叢，接種于含有6-BA、NAA、IBA不同濃度配比的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，采用3因素3水平的L9（3）4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用以篩選較佳的非洲堇增殖培養(yǎng)基配方，設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5、表6。25～30天繼代1次，連續(xù)培養(yǎng)3代，統(tǒng)計(jì)有效增殖芽數(shù)，計(jì)算有效增殖系數(shù)。

（4）生根培養(yǎng)

以大量元素減半的MS培養(yǎng)基（以下簡稱1/2MS）為非洲堇生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，蔗糖減半，添加不同濃度配比的IBA和NAA，預(yù)設(shè)IBA濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg·L-1，NAA濃 度 分 別 為0.02、0.05、0.08 mg·L-1，采用完全試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以期篩選出較佳的非洲堇生根培養(yǎng)基激素濃度配比。選取有效不定芽接種于生根培養(yǎng)基中，15天后統(tǒng)計(jì)生根率及根系長勢。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所得數(shù)據(jù)采用Excel 2015和SPSS 21.0軟件進(jìn)行處理分析，Origin 2019進(jìn)行繪圖。

污染率（%）=污染的外植體數(shù)／接種外植體總數(shù)×100%；

褐化率（%）=褐化的外植體數(shù)／無菌外植體總數(shù)×100%；

無菌外植體獲得率（%）=1-污染率-褐化率-致死率；

愈傷誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出愈傷的無菌外植體數(shù)／接種無菌外植體總數(shù)×100%；

不定芽誘導(dǎo)率（%）=發(fā)生不定芽的無菌外植體數(shù)量／接種無菌外植體總數(shù)×100%；

單個(gè)外植體不定芽平均發(fā)生個(gè)數(shù)=不定芽總數(shù)／發(fā)生不定芽外植體數(shù)；

正常不定芽率（%）=正常不定芽數(shù)／不定芽總數(shù)×100%；

有效增殖系數(shù)=有效不定芽總數(shù)／接種不定芽數(shù)；

有效不定芽：即培養(yǎng)一個(gè)周期后，完整葉心四周均勻著生著形態(tài)完整的葉片不少于5片。

畸形不定芽：葉心無發(fā)育或發(fā)育不全、葉片發(fā)育不全等的非正常不定芽。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒效果與無菌外植體獲得

兩種消毒劑對(duì)非洲堇外植體的消毒效果隨作用時(shí)間推移變化趨勢大致相同，均為先升高后降低的趨勢，并且兩種消毒劑均能對(duì)非洲堇外植體起到較好的消毒作用，0.1% HgCl2作用5 min和10% 84（有效成分NaClO，有效含氯量8 000～10 500 mg/L）作用8 min，無菌外植體獲得率分別為67.9%和72.8%。消毒劑作用時(shí)間過短達(dá)不到消毒效果，過長使外植體組織受到破壞失去活性，致死率增加（見圖1）。

圖1 不同消毒方案的消毒效果Fig.1 Disinfection effect of different sterilization plan

其中，處理7較適合非洲堇外植體消毒，13個(gè)品種均獲得了無菌外植體，但同種消毒方式對(duì)不同品種非洲堇外植體的消毒效果呈現(xiàn)極顯著差異，消毒效果最好的品種為莓果泡芙，獲得率78.93%；其次為魔法懸垂，獲得率76.65%，消毒效果最差的為品種為暗戀，獲得率僅為48.82%（見表3）。

表3 無菌外植體獲得Tab.3 Acquisition of sterile explants

2.2 愈傷出芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

非洲堇愈傷出芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果表明（見表4）：在不同激素濃度配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，非洲堇無菌外植體的愈傷誘導(dǎo)率（A）、不定芽誘導(dǎo)率（B）、單個(gè)外植體不定芽平均發(fā)生個(gè)數(shù)（C）、有效不定芽率（D）均存在極顯著差異（P＜0.01），表明6-BA和NAA是非洲堇愈傷誘導(dǎo)的2個(gè)關(guān)鍵因子。

表4 非洲堇愈傷出芽誘導(dǎo)方差分析Tab.4 Variance analysis of callus bud induction of Saintpaulia ionantha

誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)Duncan法多重比較結(jié)果表明（見表5）：隨著6-BA濃度增高，A、B、C三個(gè)指標(biāo)隨之增高，而指標(biāo)D則呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢；當(dāng)NAA濃度升高時(shí)（處理5、7、8），指標(biāo)A、B、C隨之升高，但差異不顯著，指標(biāo)D逐漸降低且差異極顯著，這主要由于激素濃度過高，畸形芽發(fā)生比例上升，畸形芽上升個(gè)數(shù)和不定芽上升個(gè)數(shù)的比值增大。當(dāng)6-BA≥0.15 mg·L-1、NAA≥0.1 mg·L-1時(shí)，單個(gè)外植體不定芽發(fā)生個(gè)數(shù)在15～50個(gè)間，平均在25.4～3.65個(gè)間，正常芽發(fā)生個(gè)數(shù)在8～32個(gè)間，平均在13.5～20.1個(gè)間，當(dāng)6-BA為0.15 mg·L-1、NAA為0.1 mg·L-1時(shí)（處 理4），A為65.9%，B為58.0%，此處理?xiàng)l件下，不定芽發(fā)生時(shí)間大致相同，生長較為一致，且C為25.42%，D達(dá)78.9%，平均正常芽個(gè)數(shù)20.1個(gè)（見圖2A）。

表5 非洲堇愈傷出芽誘導(dǎo)Tab.5 Callus bud induction of Saintpaulia ionantha

因此認(rèn)為，處理4為較好的非洲堇誘導(dǎo)培養(yǎng)激素組合，即MS+蔗糖30 g·L-1+卡拉膠6.5 g·L-1+6-BA 0.15 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1為非洲堇較佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。

2.3 繼代增殖培養(yǎng)

正交試驗(yàn)方差分析（見表6）可知，影響因子中，6-BA濃度對(duì)非洲堇有效增殖系數(shù)（D）具有顯著影響（P＜0.05），NAA、IBA濃度對(duì)非洲堇增殖系數(shù)影響不顯著（P＞0.01），極差分析（見表7）表明：3個(gè)因素的主次關(guān)系為：甲＞乙＞丙，即6-BA＞NAA＞IBA，且6-BA對(duì)非洲堇增殖系數(shù)的影響是后兩者的近3倍。Duncan法多重比較結(jié)果顯示，非洲堇繼代增殖培養(yǎng)的最佳激素配比為甲2乙2丙3，及6-BA、NAA、IBA分別為0.2、0.1、0.15 mg·L-1平均有效增殖系數(shù)可達(dá)6.43（見圖2B）。

表6 方差分析結(jié)果Tab.6 Results of ANOVA analysis

表7 增殖培養(yǎng)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.7 Design and results of proliferation cultureorthogonal experiment

2.4 生根培養(yǎng)基篩選

生根試驗(yàn)表明（見表8和圖3），當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，非洲堇生根率隨IBA濃度的升高呈現(xiàn)先升高后趨于平穩(wěn)的趨勢（處理1～3），同理，當(dāng)IBA濃度一定時(shí)，NAA對(duì)非洲堇生根的影響也表現(xiàn)出相同的趨勢（處理4～6）。當(dāng)IBA為1.0 mg·L-1、NAA為0.05 mg·L-1時(shí)（處理5），平均生根率92.67%，生根數(shù)14～50條/株，平均生根數(shù)＞20條/株，此時(shí)，苗健壯、基部愈傷少、根系發(fā)達(dá)（見圖2-C）。當(dāng)IBA＞1.0 mg·L-1、NAA＞0.05 mg·L-1時(shí)，隨著兩種激素濃度的上升，生根率上升極為緩慢（處理6、8、9），尤其當(dāng)NAA為0.1 mg·L-1時(shí)，苗基部愈傷較多，移栽時(shí)根容易受損（見圖2-D），因此選用處理5為非洲堇較佳的生根培養(yǎng)基激素濃度配比。

表8 非洲堇生根試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.8 Rooting experiment design of Saintpaulia ionantha

圖2 非洲堇組織培養(yǎng)各階段圖片F(xiàn)ig.2 Different stages pictures of tissue culture of Saintpaulia ionantha

圖3 不同激素配比對(duì)非洲堇生根的影響Fig.3 Effect of different hormone ratios on the rooting of Saintpaulia ionantha

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，0.1% HgCl2和10% 84只要在合理的作用間范圍內(nèi)均能使非洲堇葉片得到較好的消毒效果（無菌外植體獲得率＞65%），但HgCl2屬劇毒化學(xué)品[7]，需特殊儲(chǔ)存場所，廢液處理也有特定要求，今后可嘗試使用有效成分為NaClO的消毒液進(jìn)行消毒，以期在脫毒的同時(shí)達(dá)到保護(hù)環(huán)境的效果。

外源激素種類和濃度配比決定植物組織培養(yǎng)過程中器官分化的方向。6-BA和NAA配合使用，可以使非洲堇葉片誘導(dǎo)愈傷和愈傷出芽一步完成，這與婁淵樣[8]對(duì)非洲堇組培一次成苗技術(shù)研究有相似之處，不同之處在于激素濃度，本研究中，在6-BA 0.15 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1的MS培養(yǎng)基中，非洲堇的愈傷誘導(dǎo)率為65.93%，同時(shí)不定芽誘導(dǎo)率58.11%，單個(gè)外植體不定芽（無根）平均發(fā)生個(gè)數(shù)為25.42個(gè)，而婁發(fā)現(xiàn)在6-BA和NAA均為0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上，一個(gè)葉塊上可長出數(shù)棵帶根的完整小苗，導(dǎo)致不同結(jié)果主要與材料基因型、試驗(yàn)方法、內(nèi)源激素種類和含量等因素有關(guān)。正交試驗(yàn)表明，6-BA、NAA、IBA 3種激素，僅6-BA是非洲堇繼代增殖的主要影響因子，該結(jié)果與紀(jì)麗麗[9]的研究結(jié)果雷同，她認(rèn)為6-BA對(duì)大花重瓣型非洲紫羅蘭芽分化、增殖起決定性作用，但增殖倍數(shù)與6-BA和NAA的濃度比值有關(guān)。組培苗誘導(dǎo)生根過程中，IBA和NAA是常用的兩種激素，根據(jù)培養(yǎng)材料不同，兩種激素單獨(dú)使用或配合使用以達(dá)到生根目的。朱立明[10]以大花重瓣型非洲紫羅蘭組培無根苗作為試驗(yàn)材料，培養(yǎng)基附加0.1 mg·L-1NAA生根率可達(dá)82.1%，且根粗壯而長；耿明清[11]在培養(yǎng)基中附加0.2 mg·L-1IBA，非洲紫羅蘭試管苗生根效果好；何家濤[12]單獨(dú)使用NAA或IBA或IAA均能使非洲紫羅蘭無根苗生根，且生根率在97%以上；本研究采用兩種激素配合使用，當(dāng)IBA和NAA分別為1.5和0.05 mg·L-1時(shí)，非洲堇生根效果理想。